可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用.doc

可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用 作者：叶韵斌, 周智锋, 陈 强, 李洁羽, 陈夏, 黄伟炜【摘要】 目的: 观察乳腺癌患者血清中可溶性MICA（sMICA）表达情况, 探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法: ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血sMICA的分泌。流式细胞术（FCM）检测sMICA及白细胞介素15（IL15）对NK细胞表面NKG2D表达的影响。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果: ELISA结果显示, 血清sMICA含量在健康成年人血清中为阴性, 在乳腺良性肿瘤患者血清中含量为（76.822.3）ng/L, 在恶性肿瘤患者血清中含量为（205.3671.27）ng/L, 乳腺癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关。应用含sMICA的血清与NK细胞共培养可明显下调NK细胞的杀瘤活性（76.26.7）% vs （48.44.1）%, NK细胞表面NKG2D表达和上清中IFN分泌量也下降。IL15明显上调NK细胞表面NKG2D表达, 增加培养上清IFN分泌量和增强NK对MCF7的杀瘤活性。结论: sMICA表达与乳腺癌TNM分期正相关, sMICA通过下调NK细胞NKG2D表达水平而降低NK细胞杀瘤活性, 在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IL15可以上调NK细胞NKG2D的表达并增强NK细胞杀瘤活性。 【关键词】 自然杀伤细胞; 乳腺肿瘤; MICA; NK细胞受体 乳腺癌的病因复杂, 从免疫学发病机制来看, 乳腺癌患者多伴有免疫抑制。NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能, 但乳腺癌患者NK细胞功能明显降低1, 2, 可能是导致乳腺癌发生发展的一个因素。NK细胞功能受激活性受体和抑制性受体的双重作用3。相对于抑制性受体, 活化性受体的研究相对滞后, 近年来研究表明活化性受体NKG2D在介导NK细胞的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。MICA为NKG2D最主要配体之一, 许多恶性肿瘤(如肺癌, 胃肠癌, 肝癌, 前腺癌, 多发性骨髓瘤)通过释放可溶性MICA抑制NK细胞的功能4, 5。我们通过检测乳腺癌患者血清中可溶性MICA水平, 观察乳腺癌患者血清中可溶性(soluble MHC class Irelated molecules A, sMICA)对NK细胞功能的影响, 探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。 1 材料和方法 1.1 材料 NK细胞分选试剂盒购自Meltenyi公司; 鼠抗人CD3单克隆抗体（mAb）FITC、 CD56 mAbPE和NKG2D mAbAPC购自BD公司; sMICA的ELISA检测试剂盒(DY1300) 购自R&D公司; IFN的ELISA检测试剂盒购自晶美生物公司; 细胞因子IL15购自Cytolab公司; MTT购自Biomo公司; 培养液RPMI1640和DMEM购自Gibco公司。65例乳腺肿瘤患者来自本院2005-10/2007-01住院女性患者, 均经病理确诊。其中恶性肿瘤49例（浸润性导管癌24例, 髓样癌9例, 浸润性小叶癌9例, 黏液腺癌7例）, TNM分期按1997年国际抗癌联盟标准: 期10例, 期12例, 期9例, 期18例; 良性肿瘤16例（纤维腺瘤9例, 囊性增生病4例, 导管内乳头状瘤3例）, 所有患者采集血清前均未进行任何治疗。10例正常对照血清取自健康女性志愿者。乳腺癌细胞株MCF7购自上海细胞所细胞库。 1.2 方法 1.2.1 NK细胞的分选、 纯化及鉴定 参考尹凌凡等6方法负向分选纯化NK细胞: Ficoll法分离外周血单个核细胞, 加入生物素标记混合抗体孵育10 min, 离心洗涤, 加入抗生物素磁株孵育15 min, 离心洗涤, 使用德国Meltenyi公司VarioMACS系统过柱, 收集没有标记的细胞即为NK细胞。流式细胞术（FCM）检测分选前后CD3-CD56+细胞的纯度。NK细胞表面NKG2D的检测, NK细胞经CD3FITC, CD56PE, NKG2DAPC 3种不同荧光抗体同时标记, 选择CD3-CD56+的细胞群设门, 测定CD3-CD56+细胞上的NKG2D的表达水平。 1.2.2 MTT法检测NK细胞杀伤功能 设定效靶比为101, 空白组: 培养液; 靶对照组: MCF7细胞+培养液; 效应细胞组: NK细胞+培养液; 实验组: NK细胞+ MCF7细胞。每组设3个复孔, 检测波长为570 nm。杀瘤活性率=1-（实验组-效应对照组）/(靶对照组-空白组）100 1.2.3 血清sMICA的测定 取外周血3 mL于无抗凝干管中, 2 h之内分离血清, -80冰箱保存, 根据试剂盒的操作说明书, 以双抗体夹心ELISA法检测血清中sMICA含量。 1.2.4 sMICA对NK细胞NKG2D表达及杀瘤活性影响 乳腺癌sMICA(+)患者9例, 乳腺癌sMICA(-)患者9例, 健康女性9例, 取外周血1020 mL, 分选NK细胞, 参照Doubrovina等7, 取9例实验患者血清, 其sMICA含量200 ng/L定为sMICA阳性患者血清, 均值（224.3657.3）ng/L, sMICA阴性患者血清为低于ELISA检测的下限值(7.8 ng/L), 所加的血清最终浓度为100 mL/L。按以下方案分3组: (1)正常人血清+正常NK细胞; (2)sMICA阴性患者血清+正常NK细胞; (3)sMICA阳性患者血清+正常NK细胞。于培养的0、 10、 15、 22、 40 h收集NK细胞, FCM检测NKG2D表达变化, MTT法检测NK细胞杀瘤活性, ELISA法检测上清IFN分泌。 1.2.5 IL15对NKG2D表达的影响 乳腺癌sMICA(+)患者9例, 取外周血1020 mL, 分选NK细胞, 按以下方案进行实验分组: (1)sMICA阳性患者NK细胞+RPMI1640培养液; (2)sMICA阳性患者NK细胞+sMICA阳性患者血清; (3)sMICA阳性患者NK细胞+IL15; (4)sMICA阳性患者NK细胞+IL15+sMICA阳性患者血清。 1105/孔NK细胞接种于24孔板中, 1 mL培养液中加IL15 10 g/L(2 000 U/mL), 于0、 15、 22、 36、 48 h收集NK细胞, FCM检测NKG2D表达变化, MTT法检测NK细胞杀瘤活性, ELISA法检测上清IFN分泌。 1.2.6 统计学分析 SPSS12.0统计分析软件分析实验数据。计量资料采用以xs表示, 两个样本均数的比较应用配对t检验, 多组样本均数的比较应用方差分析同时进行多重均数比较SNKq检验, 相关分析用秩相关（Spearman）。 2 结果 2.1 NK细胞的分离纯化 将分离的人外周血单个核细胞用NK分选试剂盒负向分离纯化, 经FCM检测其CD3-CD56+细胞比例, 结果见图1所示, 分选前, CD3-CD56+细胞的含量为（12.72.8）%（图1a）; 分选后, CD3-CD56+细胞纯度为(97.12.4)%(图1b)。 2.2 乳腺癌患者外周血NK细胞NKG2D分子的表达 根据FCM检测结果, 健康成年人NK细胞NKG2D表达为（91.58.0）%, 乳腺良性肿瘤患者为（81.411.5）%, 乳腺恶性肿瘤患者为（70.218.1）%, 乳腺恶性肿瘤患者外周血NK细胞表面NKG2D的表达比良性肿瘤和健康成年人低, 良性肿瘤比健康成年人低(P0.05)。 2.3 外周血血清sMICA含量的比较 ELISA检测结果显示, sMICA含量在健康成年人未检测到, 乳腺良性肿瘤含量（76.822.3）g/L, 31.3% (5/16例)患者阳性表达, 乳腺恶性肿瘤含量（205.3671.27）g/L, 81.6% (40/49例) 患者阳性表达, sMICA含量在恶性肿瘤明显高于良性肿瘤（t=3.97, P<0.05）。sMICA含量与乳腺癌临床因素的关系表现在, sMICA含量与TNM分期成正相关（秩相关分析rs=0.877）, 即越晚期患者血清中sMICA含量越高。而且sMICA含量在有远处转移组中比无远处转移组高(273.2650.37)g/L vs （168.8051.30）g/L, （P0.01）; 在有淋巴结转移组中比无淋巴结转移组高（236.7365.81）g/L vs（162.4751.85） g/L, （P<0.01）。但是sMICA含量与肿瘤大小无关（方差分析F=0.399, P>0.05）。 2.4 sMICA对NK细胞杀瘤活性和NKG2D表达的影响 为了观察sMICA对NK细胞杀瘤活性的影响, 我们在NK细胞培养过程中加入含sMICA的血清, 于不同时间点检测NK细胞NKG2D表达, NK对MCF7的杀瘤活性以及培养上清IFN分泌, 结果见图2所示, Group3(sMICA阳性患者血清+正常NK细胞)中加入sMICA 阳性血清后, NK细胞杀瘤活性在15 h开始下降, 从0 h的（76.26.7）%降到15 h的（64.85.6）%, 在2240 h降到（48.44.1）%（图2A）, NK细胞表面受体NKG2D表达（图2B）和上清中IFN分泌量变化趋势同杀瘤活性（图2C）, 具有统计学意义（P<0.01）。其他组与培养前相比在不同时间点NKG2D、 杀瘤活性和IFN分泌变化无统计学意义（P>0.05）。NK细胞表面受体NKG2D表达变化趋势FCM图例见图3。 2.5 IL15对NK细胞杀瘤活性和NKG2D表达的作用 IL15作用不同时间点检测NKG2D、 杀瘤活性和IFN分泌变化曲线图, 结果见图4所示, Group1(sMICA阳性患者NK细胞+RPMI1640培养液)与Group2(sMICA阳性患者NK细胞+sMICA阳性患者血清)中, sMICA(+)患者NK细胞表面NKG2D、 NK对MCF7的杀瘤活性和上清IFN分泌量无统计学意义（图4）。Group3(sMICA阳性患者NK细胞+IL15)与Group 4(sMICA阳性患者NK细胞+IL15+sMICA阳性患者血清)中sMICA(+)患者NK细胞表面NKG2D、 NK对MCF7的杀瘤活性和上清IFN分泌量在22 h开始上升, 可持续至3648 h（P0.05, 图4）。 3 讨论 MICA为MHCI 类相关分子, 最先发现于肠上皮细胞, 后来发现在许多恶性上皮细胞均有表达8。MICA分子可分为膜型MICA和可溶性MICA（sMICA）两种, NK细胞通过活化性受体NKG2D识别乳腺肿瘤细胞膜上的膜型MICA, 通过结合相应的转接蛋白(adapter)来转导信号, 活化NK细胞, 可有效的介导NK细胞的杀瘤作用, 所以膜型MICA成为肿瘤细胞在体内生长的一大障碍9, 10。但研究也发现许多恶性肿瘤(如肺癌, 胃肠癌, 肝癌, 前腺癌)可通过释放sMICA达到抑制NK细胞功能的目的7。膜型MICA和sMICA分子在NK细胞杀伤肿瘤中起相反的作用。 Holdenrieder等4分析了512例不同肿瘤类型(胃肠道肿瘤、 妇科肿瘤、 肺肿瘤)的sMICA发现, 正常人外周血清中sMICA低于ELISA检测下限值, 良性疾病明显低于恶性患者。而且恶性患者sMICA高低与疾病发展密切相关。因此血清中sMICA的表达可作为肿瘤预后和诊断的一项指标。我们的ELISA检测结果也显示在乳腺恶性肿瘤患者血清中sMICA高低与疾病发展程度密切相关, 而且sMICA含量在有远处转移或淋巴结转移中比无转移患者中明显增加。乳腺癌肿瘤标志物的研究已有很多年, 血清糖类抗原153(carbohrdyate antigen 153, CA153)主要存在于正常乳腺上皮管腔面, 细胞恶变时含量明显提高, CA153对乳腺癌的诊断和治疗后的随访有着十分重要的临床价值11。但单一指标的检测无论在敏感性和特异性上存在缺陷, 多指标的联合检测可以提高乳腺癌的诊断率, 对判断疾病的发展很有帮助12, 13。因此, 血清sMICA的检测, 有望作为乳腺癌诊断和预后的辅助评判指标。 为了观察sMICA对NK细胞功能的影响, 我们首先用FCM检测NK细胞受体NKG2D的表达情况, 发现乳腺恶性肿瘤患者比良性肿瘤患者和健康成年人都低, 而良性肿瘤患者比健康成年人低。在其后体外试验中发现, sMICA能在一定的时间内随着作用时间延长而逐渐下降NK细胞杀瘤活性, 下调NK细胞表面NKG2D表达, 减少上清IFN分泌。上述结果提示血清中的sMICA可能通过下调NKG2D表达来抑制NK细胞的杀伤活性。Jinushi等14发现肝细胞癌患者血清sMICA不仅通过下调NKG2D 而抑制NK细胞功能, 同时因为NK细胞功能受损导致树突状细胞（DC）对异己抗原反应的降低, 从而导致了肿瘤的发生。因此, NKG2D下调对肿瘤的发生有直接或间接的作用。 因为sMICA具有下调NK细胞的杀瘤作用, 促使肿瘤发生免疫逃逸, 所以如何克服这种现象, 是研究的最终目的。Marten等15向sMICA阳性的血清中加入抗MICA抗体, 阻断sMICA对NKG2D的作用, 可阻断sMICA 抑制NK细胞的杀瘤活性。Groh等16在类风湿性关节炎患者中, 检测到大量sMICA, 但同时NK细胞上NKG2D表达并不降低, 进一步研究发现这些患者血清中同时含有高浓度的细胞因子IL15, 因而推测正是由于IL15的存在克服了sMICA对NKG2D的下调作用。在体外实验中我们发现, IL15对NK细胞的作用主要是上调NK细胞表面NKG2D, 进而提高杀瘤活性, 并使培养上清IFN分泌量明显上升, 证实IL15能促进NK细胞活性的增加。实验中还发现, sMICA阳性患者NK细胞+IL15+sMICA阳性患者血清实验组中, 即使有sMICA的存在, IL15同样能上调NKG2D并增加NK细胞杀伤活性, 这也从另一方面提示, 如果IL15用于乳腺癌患者免疫治疗中, 不会因为患者已经含有sMICA而受限制。而且IL15的某些生物学特性虽与IL2相似, 但其副作用却远小于IL217。因此, IL15可能在肿瘤生物治疗方面有广阔的应用前景, 可成为抗肿瘤、 抗感染强有力的生物制剂。【参考文献】 1 齐 红, 单 征, 于宏波. 乳腺癌患者T淋巴细胞免疫功能及NK活性检测分析J. 中国实验诊断学, 2007, 11（1）: 51-52.2 Varker KA, Terrell CE, Welt M. 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