X3-1-2基因工程的基本操作程序.ppt

1,1.2 基因工程的基本操作程序,专题1 基因工程,2,3,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,4,与RNA聚合酶结合位点,补：原核细胞的基因结构,编码蛋白质，连续不间断,不编码蛋白质，有调控作用,5,补：真核细胞的基因结构,不编码蛋白质，有调控作用,6,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,成熟mRNA,7,关于内含子和外显子的说法正确的是 （ ） A. 内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成 熟的mRNA B. 只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNA C. 原核细胞基因中也有内含子和外显子 D. 由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区,B,8,从基因文库中提取目的基因,1 基因文库(gene library)概念,又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。,9,基因文库的分类,按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA -基因组DNA文库（总） mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,10,11,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因,12,利用PCR提取目的基因,PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 原理：DNA双链复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,13,模板DNA （已知碱基序列） 特异性引物（DNA） 耐热DNA聚合酶（Taq酶） dNTPs （4种脱氧核苷酸） Mg+(促进dNTP与核酸骨架作用),PCR体系基本组成成分,14,PCR的基本反应步骤,变性 90-95C,延伸 70-75C,退火 55-60C,第三步：将反应体系升温至7075 ，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸合成，产生一条与模板链互补的DNA链。,第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至9095 ，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。,第二步：将反应体系降温至5560 ，使两种引物分别与模板DNA链配对结合，这个过程称为复性。,15,模板DNA,95,5,3,3,5,5,3,3,5,变性,16,55,5,3,3,5,5,5,A,B,引物,A,B,退火,17,72,5,3,3,5,5,5,Taq酶,延伸1,18,72,延伸2,19,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,20,72,94,55,PCR循环,21,模板DNA,22,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,23,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,24,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,25,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,26,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,27,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,28,29,30,31,32,PCR是针对特定DNA片断的快速体外复制增殖技术 每循环一轮，目的基因的量可增加一倍 增殖速率为2n,（n为循环次数）,每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,33,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成 。,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部 。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的 。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,34,从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,35,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,36,构建表达载体,组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。,表达载体,37,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法,38,将目的基因导入动物细胞,显微注射法 （将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,39,将目的基因导入微生物细胞,Ca2处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。,将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁和细胞膜的通透性。,40,目的基因的检测与鉴定,检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 鉴定: 功能活性鉴定 抗性鉴定,41,DNA分子杂交技术,DNA-RNA分子杂交技术,抗原抗体杂交技术,检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因,检验目的基因是否转录出了mRNA,检验目的基因是否表达出了蛋白质,个体生物学检验,个体生物学性状观察,42,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,报告基因（含荧光素分子）,变性,DNA杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,43,检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。 检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。 检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。 还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。 提示： DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。,44,大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,45,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,46,1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,47,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,48,5.哪项不是基因表达载体的组成部分 A启动子 B终止密码 C标记基因 D目的基因 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 A基因枪法 B显微注射法 C农杆菌转化法 D花粉管通道法,49,例、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是 A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等 于凝血因子氨基酸数目的3倍 B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组 DNA分子导入羊的受精卵 C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细 胞，而不存在于其他细胞中 D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分 子的一条链为模板合成mRNA,B,50,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？,尝试设计,51,1.答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,思考与探究（P15）,52,2.解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。 根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。,53,需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。 如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,54,3.解析：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大