导向性IFNα2aαMSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定.doc

导向性IFN2aMSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定【关键词】 干扰素2a；促黑素；大肠杆菌；基因表达；pET22b(+)载体IFN2a是一种具有抗肿瘤活性的细胞因子，已被FDA批准用于多种恶性肿瘤的治疗，但因其在临床治疗中需大剂量长期给药且常会引发明显的毒副作用，使其应用受到一定的限制. MSH是一种由多种细胞分泌的含13肽的激素，也是一种天然存在的多肽，目前的研究证实其可通过免疫调节作用抑制恶性黑色素瘤细胞的黏附、侵袭和转移1-2. Froidevanx等3研究表明所有黑素细胞和黑素瘤细胞都表达MSH受体MC1R，且黑素瘤细胞表达MC1R上调，人黑素瘤细胞表面MC1R密度为9005700结合位点/细胞，而正常状态下人表皮黑素细胞上MC1R不超过100个结合位点/细胞. 我们利用基因重组技术，构建导向性IFN2aMSH融合基因表达载体，并诱导其在大肠杆菌中表达，旨在为恶性黑色素瘤的靶向性治疗提供基础资料.1材料和方法1.1材料质粒pET22b(+)、菌种DH5及RosettagamiTM2(DE3)，药学系生物技术中心保存；各种限制性内切酶，T4 DNA 连接酶以及DNA Marker DL2000（TaKaRa公司）；片段合成与序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（Omega公司）；低Mr蛋白标准（MBI公司）；鼠抗人干扰素（Santa Cruz公司）；羊抗鼠IgGAp（华美工程公司）：显色剂（美国Promega公司）；蛋白胨、酵母粉、低熔点琼脂糖（Spanish公司）；异丙基硫代D半乳糖苷（IPTG，华美生物工程公司）；其他试剂均为国产分析纯.1.2方法1.2.1IFN2aMSH融合基因的克隆按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码MSH导向肽的核苷酸片段：片段1（48 nt）：5 GAT CCTCCT ACT CCA TGG AAC ACT TCC GTT GGG GTA AAC CGG TTT AGG3；片段2（48 nt）：5 TCG ACC TAA ACC GGT TTA CCC CAA CGG AAG TGT TCC ATG GAG TAG GAG3. 这两个片段退火后可形成MSH导向肽的核苷酸片段以及5端和3端的粘性末端（BamH I和SalI的酶切位点）； 将合成的两个片段煮沸变性10 min后退火，再与用BamHI和SalI双酶切处理过的pET22b（+）IFN2aNGR质粒连接，连接产物转化感受态细胞DH5，培养筛选阳性克隆(图1).1.2.2重组质粒的酶切和测序从抗生素琼脂培养平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培养基中培养过夜，提取质粒DNA，用限制性内切酶Nde和Nco进行双酶切鉴定及核酸序列分析. 将测序正确者命名为pET22b（+）IFN2aMSH.1.2.3重组蛋白的诱导表达重组质粒pET22b(+)IFN2aMSH转化感受态细胞RosettagamiTM2(DE3)，挑取mAb接种于含氨苄青霉素（50 mg/L）、四环素（25 mg/L）、链霉素（10 mg/L）及氯霉素（35 mg/L）的LB培养基中，次日清晨按1100的比例接种于上述同样条件的LB培养基中，37培养至A600 nm=0.40.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，37振荡培养4 h，离心收集菌体，行SDSPAGE鉴定.1.2.4IFN2aMSH的初步纯化和Western Blot鉴定1.2.4.1超声裂菌重组蛋白IFN2aMSH是以包涵体的形式存在，取5 g表达湿菌，将其悬浮于35 mL STE(100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris.Cl, PH 8.0, 1 mmol/L EDTA)中，在冰浴中300 W超声裂菌，超声5 s，间歇10 s，全程20 min，4, 10 000 g离心20 min，保留上清，行SDSPAGE鉴定，并与溶菌酶裂菌结果进行比较.1.2.4.2疏水作用层析初步纯化重组蛋白层析柱为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)；缓冲液A：25 mmol/L Tris.Hcl, 1 mmol/LEDTA, 1 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.5；缓冲液B: 25 mmol/L Tris.Hcl,1 mmol/L EDTA, pH 7.5；将超声裂菌上清在冰浴中进行硫酸铵沉淀，硫酸铵的终浓度为400 g/L, 4, 10 000 g离心20 min，保留沉淀，用约20倍体积的A液溶解沉淀，4，10 000 g离心20 min，保留上清备用. 层析柱以缓冲液A平衡至基线稳定，上样后继续以缓冲液A冲洗至基线稳定，线性梯度洗脱100% A至100% B,洗脱体积为约25个柱床体积，流速为3 mL/min.1.2.4.3Western Blot于SDSPAGE结束后拆下凝胶，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用鼠抗人IFN mAb（1100），行Western Blot鉴定.1.2.4.4蛋白质含量及活性测定将WISH细胞在含抗生素、谷氨酰胺和100 g/L FCS（pH 7.4）的Eagles培养液中37培养过夜. 待细胞呈单层生长后弃培养液，并用胰酶消化细胞. 将消化的WISH细胞按1000个细胞/孔接种于96孔板. 37孵箱培养过夜. 换为含50 g/L FCS的Eagles液稀释的不同浓度的待测样品，继续培养，次日换用含50 g/L FCS的Eagles培养液按11030稀释的VSV病毒培养液，37培养24 h，观察结果，以50%细胞保护的待测样品稀释度为其效价.2结果2.1IFN2aMSH的酶切鉴定用限制性内切酶Nde和Nco对重组质粒pET22b(+)IFN2aMSH进行双酶切，可见一约530 bp片段，与预期大小一致，证明目的片段已插入pET22b(+)载体中（图2）. 测序结果与合成的MSH基因序列比对完全一致.2.2IFN2aMSH在大肠杆菌中的诱导表达SDSPAGE电泳结果表明，含有pET22b(+)IFN2aMSH的工程菌RosettagamiTM2(DE3)经1 mmol/L IPTG诱导后在约20 ku处产生了一条新生蛋白条带，与预期结果相符合；而未诱导的则无相应蛋白条带出现（图3）.2.3超声裂菌及溶菌酶裂菌经溶菌酶裂菌证实重组蛋白IFN2aMSH是以包涵体的形式存在，采用超声裂菌的方法裂解菌体细胞，发现在裂菌上清中出现IFN2aMSH目的蛋白条带（图4）.2.4IFN2aMSH的纯化和Western Blot鉴定采用疏水作用层析进行重组蛋白的初步纯化，可得到较高纯度的IFN2aMSH（图5），纯化产物的Westernblot鉴定(图6).2.5IFN2aMSH重组蛋白含量及活性的检测溶菌酶裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分别为6.4108 U/L, 4.176 g/L和1.536108 U/g. 超声裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分别为41011 U/L, 5.944 g/L和6.7291010 U/g.3讨论目前绝大多数的临床药物都存在一个不容忽视的缺陷，即缺乏对病理部位的特异亲和力. 大剂量给药不仅使得药物成本提高，还不可避免地产生非特异性毒性，对正常组织造成严重损伤，引发毒副作用. 为了克服这一难题，人们提出了导向性的治疗策略，我们实验室曾先后进行了NGR导向性肿瘤治疗药物的研发，如IFN2aNGR，tum5 NGR4-5.IFN是第一个应用于临床的基因工程产品，但在实体瘤的治疗中，注射入体内的IFN很少能达到肿瘤部位，因而治疗效果较差1-2，MSH可与黑素瘤细胞表面的MC1R特异性结合，促进恶性黑色素瘤细胞的凋亡，并且通过皮肤基底膜的重建而抑制皮肤黑素瘤的转移. Murata等6证实MSH在体内外均可通过皮肤基底膜的重建抑制鼠B16细胞的侵袭. 李蠡等7研究发现MSH可明显上调恶性黑色素瘤细胞Fas/FasL的表达，促进恶性黑色素瘤细胞的凋亡.为了提高IFN2a对肿瘤组织的选择性，我们通过基因工程技术构建了融合表达载体pET22b(+)IFN2aMSH，并成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白IFN2aMSH，预期此种融合蛋白既具有与黑色素瘤特异性结合的能力，又具有IFN2a抗肿瘤活性，能提高治疗作用，减低毒副反应.对于以包涵体形式存在的融合蛋白，由于包涵体结构的特殊性，在用表面活性剂和变性剂处理、溶解包涵体时，会引起重组蛋白的变性. 我们通过简单的超声裂菌使重组蛋白以可溶解的形式存在，避免了包涵体洗涤以及蛋白复性的过程，大大缩减了实验的进程，同时采用硫酸铵沉淀的方法，通过疏水作用层析一步分离得到较高纯度的目的蛋白，可为今后对于以包涵体形式存在的融合蛋白的纯化提供一个新的方法.【参考文献】 1Zhu N, Lalla R, Eves P, et al. Melanoma cell migration is up regulated by tumour necrosis factoralpha and suppressed by alphamelanocytestimulating hormoneJ. Br J Cancer, 2004,90(7):1457-1463.2Eves P, Haycock J, Layton C, et al. Antiinflammatory and antiinvasive effects of alphamelanocytestimulating hormone in human melanoma cellJ.Br J Cancer, 2003,89(10):2004-2014. 3Froidevanx S, CalameChriste M, Tanner H, et al. A novel DOTAalphamelanocytestimulating hormone analog for metastatic melanoma diagnosisJ. J Nucl Med, 2002,43(12):1699-1706.4刘磊，孟洁如，赵宁，等. 融合蛋白IFN2aNGR在荷瘤小鼠体内的肿瘤局部分布和组织定位J. 第四军医大学学报，2004,25（15）:1400-1402.5Jieru M, Nan M, Zhen Y, et al. NGR enhanced the antiangiogenic activity of tum5J. J Biochem, 2006,140(2):1-6.6Murata J, Ayukawa K, Ogasawara M, et al. Alphamelan