伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球血管细胞外基质表达的干预作用.doc

伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球血管细胞外基质表达的干预作用 作者：李强翔，龚汉仁，何美英，尹书东，谢晓云，孙志香 【摘要】 目的 观察伦尔欣对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质表达的干预作用。方法 利用链脲佐菌素腹腔注射法诱导建立型糖尿病大鼠模型，将实验用SD大鼠随机分正常对照组、糖尿病组和伦尔欣治疗组。治疗16周，观察治疗后晚期糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、内生肌酐清除率、24h尿蛋白排泄率；免疫组织化学检测肾小球细胞外基质的表达。结果 造模组大鼠均出现肾脏功能损害；伦尔欣能降低糖尿病大鼠的晚期糖基化终末产物、丙二醛、24h尿白蛋白排泄率和型胶原的表达，增加超氧化物歧化酶和内生肌酐清除率，硫酸乙酰肝素蛋白表达显著升高。结论 伦尔欣通过调节肾小球细胞外基质表达发挥对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用。 【关键词】 伦尔欣；糖尿病模型；细胞外基质Intervention of Lunerxin on the expression of glomerulus extracellularmatrix in streptozotocininduced diabetic nephropathy ratsABSTRACT: Objective To observe the regulatory effect of Lunerxin on glomerulus extracellular matrix of streptozotocininduced diabetic rats. Methods Diabetic nephropathy in rats was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin. The rats were allocated to normal control group, model group, and Lunerxin group for 16 weeks. After the treatment, blood advanced glycosylation end product level, malonaldehyde (MDA), erythrocuprein (SOD), urinary albumin excretion rate of the 24hours, and clearance rate of creatinine, as well as collagen and HSPG were determined by in situ immunohistochemistry in different groups. Results Diabetes mellitus and renal function lesion occurred in the two model groups. Lunerxin could improve the general state, and decrease advanced glycosylation end products, blood urea nitrogen, serum creatinine, urinary albumin excretion rate of the 24hours and the expression of collagen . It increased clearance rate of creatinine and expression of heparan sulfate proteoglycan in the kidney significantly at the same time. Conclusion Lunerxin has certain protective effect on the kidney by regulating the expression of glomerulus extracellular matrix.KEY WORDS: Lunerxin; diabetic model; extracellular matrix细胞外基质(extracellular matrix, ECM)散在分布于肾小球，是肾小球基底膜的重要组成成分。型胶原(collagen , C)与糖尿病肾纤维化关系密切，硫酸乙酰肝素蛋白(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)已被证明对保持电荷屏障有重要作用，故两者成为实验研究的重点和热点。目前，糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的诊疗进展迅速，糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)的形成和氧化应激在糖尿病肾病发病中的作用已逐渐被重视12，并且在动物实验应用盐酸氨胍特异抑制AGEs的形成，延缓糖尿病肾病的发生、发展起到一定的效果。但是，由于其毒副作用大，未能进入临床。有报道葛根素(puerarin)在抑制AGEs产生的同时还可减少AGEs的产生3，故我们通过免疫组化染色观察伦尔欣(葛根素)对肾小球细胞外基质型胶原、HSPG表达的干预，从而探讨葛根素对糖尿病肾病的保护作用的机制。1 材料与方法1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，2月龄左右，体重200-250g，清洁级；由湖南农业大学动物部提供。实验期间自由饮水，摄食饲料为中南大学动物中心提供的混合饲料，适应性喂养1周后进行实验。室温18-28，相对湿度62%-80%。1.2 仪器和试剂 美国强生手持式快速全血葡萄糖测试仪，FJ2008型免疫细胞记数仪，日丽7170型自动生化仪，链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma, Co. USA)，伦尔欣注射液(湖南益侨制药有限公司生产，批号：20060612)；丙二醛(malonaldehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(erythrocuprein, SOD)试剂盒(南京建成生物公司)；晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products, AGEs)ELISA试剂盒购自美Genelab公司(Lot No 17998)，SP免疫组化染色试剂盒、兔抗鼠型胶原抗体、兔抗鼠硫酸乙酰肝素蛋白多糖抗体由北京莱博生物实验材料研究所提供。1.3 方法与分组 动物建模：大鼠预养1周后，空腹12h，腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲液(STZ 60mg/kg体重。STZ在柠檬酸钠缓冲液中的质量分数为0.01)。对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液，依据72h后尿糖，静脉采血测血糖(怡成全血葡萄糖测试仪)，血糖16.7mmol/L者，确定模型建立。除去造模失败及死亡大鼠，将20只糖尿病鼠纳入本实验。分组：正常对照组(CN组10只)；糖尿病鼠随机分为糖尿病组(D组10只)和伦尔欣治疗组(D+P组10只)。伦尔欣治疗组每只腹腔注射伦尔欣80mg/(kgd)，均连续给药16周。各组为了避免酮症和维持糖尿病鼠的生存，D组、D+P组隔日腹腔注射长效胰岛素2-4u，并断尾取血测大鼠血糖，使血糖波动在25mmol/L左右，实验共16周。1.4 标本采集 第16周实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24h尿，测定尿白蛋白(UAE)含量，动物经乙醚麻醉后股动脉放血5mL测大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、血肌酐，计算内生肌酐清除率。取左侧肾脏反复灌洗至发白，剔除包膜，横断切取约0.5mm3柱状体2块，置于(多聚甲醛在磷酸盐缓冲液中的质量分数为0.04)多聚甲醛(含11000焦碳酸二乙酯)中固定12h，石蜡包埋，连续切片。1.5 观察指标 生化指标：用全自动生化仪测血肌酐：AGEs应用竞争性ELISA法；MDA采用硫代巴比妥酸法；SOD采用黄嘌呤氧化物酶法；尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion, UAE)：收集24h尿液，用二甲苯防腐，混匀后取2mL用免疫细胞记数仪测定；肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)：以内生肌酐清除率为代表，GFR(尿肌酐尿量)血肌酐。1.6 免疫组化检测的操作步骤 见北京莱博生物实验材料研究所实验指南。免疫组化结果的图像分析采用计算机显微图像处理系统，在400放大倍数下每张片子随机选取10个视野区，对杂交信号结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为表达量的值(用均数标准差表示)。1.7 免疫组化结果的定性判别方法 在显微镜下根据着色程度按以下标准判定结果：阴性(-)：无黄色；弱阳性(+)：淡黄色；阳性()：黄色；强阳性()：深黄色或黄褐色。1.8 统计学处理 测定数值皆以s表示，利用SPSS10.0软件进行组间方差分析，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析和q检验。2 结果2.1 药物对大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率的影响 结果显示：造模成功的大鼠血清糖基化终末产物、丙二醛、尿白蛋白排泄率较正常组明显升高，超氧化物歧化酶、内生肌酐清除率下降，差异显著(P<0.05)，D组和伦尔欣治疗组比较，糖基化终末产物、丙二醛、尿白蛋白排泄率明显升高，超氧化物歧化酶、内生肌酐清除率下降(P<0.05，表1)。2.2 药物对大鼠肾小球CI、HSPG表达的影响 HE染色结果显示：光镜检查各组大鼠肾小球及小管间质未见明显的病理改变；模型组大鼠肾组织可见肾小球明显增大，肾小球细胞增生，散在肾小管上皮细胞肿胀变性、脱落，肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚。用药组中上述病理改变均有不同程度的减轻。 免疫组化结果显示：与糖尿病相比，正常组状态下肾小球着色浓集，在肾小球系膜细胞、血管内皮细胞及少量肾小管上皮细胞胞外均可见棕黄色颗粒颜色加深且数量增多，肾小球血管细胞外基质HSPG表达显著上调，呈强阳性，CI表达呈阴性，经灰度值测定两组间差异有显著性差异(P<0.05)；治疗后，伦尔欣治疗组肾组织着色较浓集，与D组相比CI表达呈弱阳性(P<0.05)，HSPG相对表达含量明显上调，呈阳性(P<0.05，图1-2、表2)。表1 各组大鼠糖基化终末产物、丙二醛、超氧化物歧化酶、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率的变化的比较（略）Table 1 Changes of Serum advanced glycosylation end products, malonaldehyde, erythrocuprein, urine albumin, and clearance rate of creatinine in different groups*P<0.05 vs. CN group; P<0.05 vs. D group. AGEs: advanced glycosylation end products图1 Collagen免疫组化的图片（略）Fig.1 Immunohistochemical analysis for CI expression in glomeruli of rats (400)A: control group; B: D group; C: D+P group图2 HSPG免疫组化的图片（略）Fig.2 Immunohistochemical analysis for CI and HSPG expression in glomeruli of rats (400)A: control group; B: D group; C: D+P group表2 免疫组化各组大鼠肾小球CI、HSPG表达的灰度值的比较（略）Table 2 Changes of immunohistochemical optical density CI and HSPG in different groups*P<0.05 vs. CN group; P<0.05 vs. D group. CI: collagen I; HSPG: heparan sulfate proteoglycan3 讨论 我国糖尿病肾病有逐渐增多的趋势，对糖尿病患者生活质量和寿命有很大的影响。糖尿病肾病病理特点是肾脏肥大，以系膜细胞增大、ECM积聚为特征4。糖尿病肾病的临床诊断依据是白蛋白尿的出现。蛋白尿的病理生理机制包括肾小球内静水压增高、肾小球滤过膜负电荷屏障破坏。糖尿病肾病早期白蛋白尿(选择性蛋白尿)的出现是电荷屏障遭到破坏的结果。硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素侧链带有大量负电荷，是组成肾小球电荷选择性屏障的主要成分，所以说糖尿病肾病患者肾小球基底膜上大量硫酸乙酰肝素蛋白丧失可能是导致白蛋白尿的主要原因。I型胶原是一种重要的血管细胞外基质蛋白，它使血管保持稳定的结构和张力。对维持血管壁的完整性、粘弹性和通透性有重要作用，而在血管内皮细胞损伤后，它可明显促进血小板的聚集。 ECM合成和降解异常是糖尿病肾病发展的重要机制。糖尿病状态下ECM改变的机制可能与下列因素有关：高血糖可下调稳定状态；蛋白质非酶糖基化反应；氧化应激诱导细胞因子等。已有充分证据表明，人体内持久的高血糖状态可导致许多结构功能蛋白和核酸蛋白发生非酶糖基化，形成AGEs。氧化应激可以促进AGEs的形成，而AGEs在体内主要是通过交联、与受体相互作用和增加氧化应激来发挥多种作用，两者相互促进，可能协同参与糖尿病肾病的发病过程56。 肾小球ECM改变是糖尿病肾病的特征性病变，逆转ECM的改变对延缓糖尿病肾病的发生、发展起至关重要的作用7。动物实验表明，氨基胍可下调肾组织中、型胶原基因和纤维连接蛋白的表达。新近的研究资料进一步表明伦尔欣和经典的糖基化抑制药氨基胍抑制糖尿病大鼠体内AGEs形成的作用相似8。现代药理研究表明，伦尔欣能降低血液黏度、解除血管痉挛、降血脂、改善肾小球的缺血区血流，促进内皮细胞功能，减少氧化应激及阻断AGEs等作用。 本课题实验结果表明：病程16周模型组大鼠UAE升高，肾小球ECM改变。由于AGEs是公认的DM血管病变的致病因子，因此本研究检测了伦尔欣对DM大鼠体内AGEs的影响。结果显示：伦尔欣可使大鼠增强HSPG表达，降低型胶原的表达；增加超氧化物歧化酶、肌酐清除率，降低UAE，改善肾功能，并降低MDA、AGEs，可能通过抗肾脏氧化和蛋白非酶性糖化的双重作用达到逆转糖尿病微血管早期病变的目的。有关伦尔欣抑制糖基化和氧化应激的具体机制方面，还有待进一步的研究。基金项目：湖南省中医药科研基金资助项目(No.20066301)【参考文献】 1Forbes JM, Thallas V, Thomas MC, et al. The breakdown of preexisting advanced glycation end products is associated with reduced renal fibrosis in experimental diabetes J. FASEB J, 2003,17(12):17621764.2Zhang L, Zalewski A, Liu Y, et al. Diabetesinduced oxidative stress and lowgrade inflammation in porcine coronary arteries J. Circulation, 2003, 2