中国药典》2005年版二学习资料.ppt

中国药典2005年版二部主要增修订情况,本版药典（二部）共收载品种1967个，新增品种327个，修订品种522个删除品种4个，转至中国药典2005年版（三部）的生物制品52个。附录新增项目13个，修订项目65个，附录“生物制品通则”转至药典（三部）。制剂通则新增植入剂，修订项目19个。 本版药典（二部）坚持“科学、实用、规范”的标准制订原则，基本实现了中国药典2005年版设计方案所确定的目标，附录检测方法及品种正文内容均有了较林的改进，具体体现在以下五个方面。,一、及时采用先进分析方法，规范附录体现我国特色,本版药典（二部）附录增订了制药用水中总有机碳测定法（TOC）。TOC方法载入药典，将引导我国制药用水质控理念的更新，使的我国对水中有机物的限量控制更加科学、准确，同时也将推动TOC方法在制药用水在线检验中的应用，确保制药用水尤其是注射用水的质量。目前，由于TOC测定仪器尚不普及，本版药典（二部）在品种正文中仍沿用中国药典2000年版的标准，但为与我国药品生产管理要求相适应，纯化水与注射用水增订微生物限度检查，纯化水限度为每1ml中含细菌、霉菌和酵母菌总数不得过100个，注射用水限度为每1ml中含细菌、霉菌和酵母菌总数不得过10个。,纯化水重金属限度0.00005%修订为0.00003%. 注射剂的粒度检查方法从粒度大小为三个层次，第一为可见异物检查法（即原澄明度检查法），该法对粒径或长度通常大于50 m的物质进行检查，其判断标准作了较大改动，更加严格，即静脉注射液不得检出可见异，如有1支不符合规定，另取20支复试，均应符合规定。对于非静脉注射液以及粉针剂等由国家食品监督管理局另行分布规定。此外，本版药典新增了光散射法，该法采用仪器检测，通过对可见异物的光散射能量进行测量，使结果判断更为客观。为减少市场抽验的实际困难，本版药典（二部）减少了可见异物检查的取样量，原部颁标准取200支，现方法取样20支。以上规定既反映我国注射液生产的实际，又保证临床用药的安全。,第二不溶性微粒检查法，该法检查的粒度较小，通常为250 m ，检测微粒浓度为05000个/ml，本版药典（二部）增加对100ml以下静脉注射液、静脉注射用无菌粉末及注射用浓溶液中的不溶性微粒的检查。第三为粒度与粒度分布测定法，本版药典（二部）增订光散射法，测量范围为0.023500 m ，所用仪器为激光散射粒度分布仪，测定法分干法与湿法，湿法测定的检测下限通常为20 m ，干法测定检测下限通常为200 m 。 渗透压摩尔浓度测定法强调“注射剂、滴眼剂等制剂处方中的氯化钠等，其作用主要为调节制剂的渗透压，则可通过渗透压摩尔浓度测定取代含量。”此规定 意在引导生产企业以渗透压摩尔浓度作为判断制剂等渗或高低渗的客观指标。,二、加强安全性指标控制，科学提高标准要求,本版药典（二部）对色谱方法的系统适用性试验要求的修订更趋合理。薄层色谱法增加对系统检测灵敏度与分离效能的要求，通常规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。鉴别时，分离度效能可用对照品与结构相似的药物对照品制成的混合溶液进行测试；杂质检查时，一采用杂质对照品与供试品的混合溶液，两者应显示清晰分离的斑点，例如左旋多巴采用左旋多巴与酪氨酸混合溶液考核系统的分离效果。本版药典（二部）11个品种增订TLC检查有关物质。,高效液相色谱法强调色谱中难分离物质或与其相关的物质之间的分离度和待测响应值的重复性是系统适用性试验更具实际意义的重要参数，而根据目前方法学验证的情况，理论板数仅作为参考参数。本版药典（二部）226个品种增订HPLC检查有关物质。部分品种要求见表1。,表1部分品种系统适用性试验要求表,重视残留溶剂的控制，本版药典（二部）对残留溶剂的检查推荐采用顶空毛细管气相色谱法，限度与ICH一致。药品生产企业可采用简便的填充柱气相色谱法进行工艺控制，其他色谱法如HPLC测定吡啶，离子色谱法测定N-甲基吡咯烷酮等，可作为气相色谱法的主要补充。顶空毛细管气相色谱法应考虑共出峰干扰、热降解干扰、基质效应的影响与药品溶解性及溶剂介质的影响。 本版药典（二部）收载化学合成原料药约100种，本版药典（二部）24个品种增订残留溶剂检查，部分品种残留溶剂种类见表2。制订残留溶剂检查方法的难点在于各论中方法应满足所有企业不同工艺；药典方法应具有较好的耐用性；生产工艺的改变将需要对标准进行相应的修订。,表2 部分品种残留溶剂列表,本版药典（二部）在确保安全性的前提下，将热原修改为细菌内毒素的品种有73个品种，增订细菌内毒素检查的品种有112个，细菌内毒素判定标准由“不得过”修订为“应小于”，避免肉眼观察的不确定性。此外，42个品种删除异常毒性；30个品种删除降压物质。,三、扩大HPLC在多组分原料及制剂中的应用，重点加强品种要求,本版药典（二部）有223个品种采用HPLC方法取代传统的容量法或紫处法或生物检定法。例如盐酸小檗碱片与胶囊含量测定原来用滴定法，多种生物碱均可参与滴定反应，本版药典修订为HPLC法，可准确测定小檗碱的含量；酸酸泼尼松片含量测定原采用紫外法，难以区分结构类似的物质，修订为HPLC方法大大提高了方法的专属性。氯霉素、罗红霉素、克拉霉素与庆大霉等多种抗生素原含量测定方法采用微生物检定法，本版药典（二部）改用HPLC法，3种氨基糖苷类采用蒸发光散射检测器。,本版药典（二部）品种正文中近30种复方制剂，其中18种已采脾HPLC方法。HPLC方法不仅提高了方法的专属性，并且简化了实验过程。例如复方磺胺甲唑制剂由磺胺甲唑与甲氧苄组成，原条用计算分光光度法，现修订为HPLC法；双唑泰栓由甲硝唑、克霉唑与醋酸氯己定组成的复方制剂，原含量测定方法为滴定法、UV法与滴定法和UV组合三个方法分别测定，方法繁琐且干扰因素多，现修订为HPLC方法，在一个色谱条件下能有效分离三个组分；异福酰胺片（胶囊），采用等度HPLC方法能有效分离三种组分及降解产物醌式利福平，保证方法的准确性。,此外，本版药典有针对性地对61个难溶药物增订溶出度检查；对于上浮的胶囊，采用溶出度一法（转篮法）和二法（浆法）时可用沉降蓝的方法；原采用2片加入到至同一溶出杯的方法修订为1片，如三唑片、溴吡斯的明片和盐酸哌替啶片等，并通过修订检测方法使检测灵敏度满足溶出物的检测要求。18个小剂量药品增订含量均匀度检查。70个原料药增订专属性红外鉴别。,四、进步实现标准的科学与规范,性状的规范包括着色片不再描述具体颜色，如复方甲苯咪唑片原为粉红色片，现描述为着色片；将过度色包含在颜色的描述中，如“本品为白色或浅黄色颗粒”，规范为白色至浅黄色颗粒，避免用“或”引起过度颜色缺失而导致结果误判；胶囊性状统一描述内容物；栓剂不描述形状；可溶与混悬型颗粒剂等描述在本品的性状中，以此判断是否进行熔化性检查。,实事求是地删除了实验室难以操作的检测项目，如溶点过高并同时溶融分解的药物不再进行溶点测定（如乙酰唑胺、盐酸丙卡巴肼、硫酸双肼屈嗪、盐酸左旋咪唑、氢化可的松等），有些复盐，在过加热过程中出现多峰现象如环吡酮胺，即出现三个吸收峰，不适宜进行熔点测定，故删去此项目；删去某些检验人员嗅有害气体的鉴别试验，如甘油，删去丙稀醛刺激性臭气，用专属性强的红外鉴别代替；对规格进行了规范，如亚叶酸钙以亚叶酸计，磷酸苯丙哌啉以苯丙哌啉计；更加明确了某些制剂名称，如静脉输液中，氯化钠注射液或葡萄糖注射液以避免临床不适宜人群的误用。辅料设立专栏。,中国药典2005年版二部附录方法通则的主要增修订内容,紫外-可见分光光度法,1、术语 紫外-可见分光光度法， 吸光度 2、仪器校正 吸光度准确度,3、对溶剂的要求、纯度， 截止使用波长 4、狭缝宽度 小于波带半高宽的1/10，以不 减不吸光度为准 5、溶液pH值对吸收的影响 6、计算分光光度法 一般不宜用作含量测定。 7、比色法 作为测定法之一合并于本法中,红外分光光度法,1、波数精度 由2000-4000cm-14 cm-1 和4000-2000cm-18 cm-1 改为1000cm-11 cm-1 和3000cm-11 cm-1 2、分辨率 1583-1589cm-112%T 2851-2870cm-118%T 3、同一化合物收入不同卷次，以后卷图谱为准，前卷图谱仅作参考,4、多晶问题 （1）规定样品前处理方法 （2）当未规定药用晶型时，可用适当溶剂重结晶，或用对照品平行处理后测定 5、制剂的红外鉴别 （1）品各正文中规定预处理方法 （2）辅料无干扰，与原料药的标准图比对 （3）如辅料干扰不能完全消除，在指纹区可规定3-5个待测成份的特征吸收峰（ cm-1 ），其误差应小于0.5%。,薄层色谱,一、仪器与材料 1、固定相或载体 粒径1040 m 5 40 m 2、喷雾器、显色剂与荧光检测 二、操作方法 1、点样 点样直径24 m ，点间距1.02.0 cm 2、展开 单向、双向、多次 3、薄层扫描（删去） 三、系统适用性试验（新增） 1、检测灵敏度 限度对照溶液再经适当稀释，应显示 清晰斑点,2、比移值 鉴别，杂质定位 3、分离度 待测物中难分离物质对应能清晰分离 鉴别 待测对照品与结构相似的参照物应分离 杂质检查 杂质对照品与待测物主成分应分离 四、测定法（新增） 鉴别 同浓度对照品溶液 颜色与位置应一致 斑点大小与颜色深浅也 应大致相同 杂质检查 杂质对照品、自身对照 杂质斑点数、单个杂质量、杂质总量 （估计） 五、检视（新增） 本色、显色、荧光、荧光猝灭等,高效液相色谱法,1、色谱柱：柱性能（载体的形状、粒径、孔径、 表面积等、化学修饰），手性柱 2、检测器：UV、F、DR、EC、ELS、MS等采 用ELSD时，由实验决定是否需要进行对数转换 3、系统适用性试验 （1）难分离物质对的分离度 （2）柱效 4、拖尾因子 0.95T 1.05 峰高法定量,5、明确了杂质测定中准确积分的涵义 C0.5%, RSD 10% 0.5%C 2%, RSD 5% C2%, RSD 2% 6、在加校正因子的自身对照法中，明确了相对于主成分的相对保留时间，用于规定杂质的定位，并与校正因子一起载入品种正文中。,干燥失重测定法,恒温减压干燥条件：温度60 ， 压力 20mmHg,炽灼残渣检查法,明文规定，当供试品分子中含有碱金属或氟元素时，应使用铂坩埚。,溶液的颜色检查法,增加了前言 溶液颜色反映纯度 无色 颜色与纯溶剂相同 几乎无色 供试液浅于用水稀释一倍后的 相应一号标准比色液的颜色。,注射液中不溶性微粒检查法,1、名称：50m 澄明度 可见异物 250 m 不溶性微粒 不可见微粒 2、光阻法和显微镜法检验结论不同时，以后者为准。 3、取样体积5ml或随容器的标示体积决定 4、环境及溶剂 10ml, 10 m ，10粒； 25 m ， 2粒 光阻法 50ml， 10 m ，20粒； 25 m ， 2粒 显微镜法 5、增加小针剂检查 25 ml 5ml3 25ml 合并数支使总体积大于20ml 5ml3 或逐支检查（取样体积以不吸入气泡为限）,6、供试品数量 3支以上 7、判定 光阻法：100ml， 10 m 25粒/ml， 25 m 3粒/ml 100ml 10 m 6000粒/支， 25 m 600粒/支 （含无菌粉针） 显微镜法： 100ml， 10 m 12粒/ml， 25 m 2粒/ml 100ml 10 m 3000粒/支， 25 m 300粒/支 （含无菌粉针）,渗透压摩尔浓度测定法,1、进一步明确了渗透压与渗透压摩尔浓度的关系 2、明确了冰点下降法测定渗透压摩尔浓度的依据 3、定义：mOs mol/Kg浓度由每升溶液中溶解的溶质克数改为每公斤溶剂中溶解的溶质克数 4、由一点校正法改为二点校正法 5、制剂处方中的氯化钠，若其作用主要为调节制剂的渗透压，则可通过毫渗摩尔的测定取代氯化钠的含量测定,可见异物检查法,1、名称 澄明度， 50m 2、测定方法 （1）灯检法 照度 无色注射剂 10001500Lx 透明塑料容器或有色注射剂20003000Lx 混悬液 4000Lx 视力 好于4.9矫正后好于5.0 注射液 取样数 20支 判定 未见可见异物为合格 如一支中检出异物，可另取20支，均不得检 出异物,（2）光散射法 取样数与判定同灯检法 3、可见异物（白点、块状物等） 特殊异物（金属屑、玻璃屑、色块、粗纤 维等）,4、澄明度检查细则和判断标准与中国药典2005年版比较,溶出度测定法,1、适用于难溶性固体制剂，增加颗粒剂的溶出度检查 2、仪器装置 材料：不应有显著的吸附和溶出 网筛：丝径由0.254mm改为0.25mm 网孔0.425mm改为0.40mm 转速：删去50200rpm,改为各论规定转速的4% 取样点位置：转篮顶端与液面的中点，距溶出杯内壁10mm处，与原规定差23mm 溶剂：溶出介质比溶出液更合适，脱气，p H 0.05,3 、测定法：品种各论中应明确溶出条件，通常出介质为900ml取样时间45限度为标示量的70%，并规定取出溶出液体积如大于1%溶出介质体积时，应补足或校正计算。 4、过滤：取消原0.8m滤膜，改为“用适当的微孔滤膜过（自动采样滤头110 m）” 5、处方或工艺不同的同品种，可并列溶出条件 6、极难溶物的溶出条件 （1）加大转速、增加时限或降低限度规定 （2）加表面活性剂，如SDS或吐温80 1% （3）加有机溶剂，如乙醇、异丙醇等 5% 7、小规格药剂每杯仍以1片为宜，低吸光度溶出液可改用长光路吸收池，删支“取用量如为2片或2片以上时”。,8、囊壳干扰 空白读数标示量25% 方法无效 空白读数标示量2%无须校正 9、结果与判断 合格：6（6Q） 6（Q 12 Q-10%， 6（12 Q，Q-10% 1 Q-20%）， +6复试 12（3 Q，Q-10% 1 Q-20%， Q平均Q） 不合格： 6（1 Q-20%） 6 （2 Q-10%） 6（3 Q） 6（Q平均Q） 12（4 Q） 12 （2 Q-10%） 12 （1 Q-20%） 12（Q平均Q）,含量均匀度检查法,1、计算方法 CHP 计量法 BP/EURP 计数法 USP 计量-计数混合法 2、适用范围 小剂量口服固体制剂，粘稠型注射剂，注射用无菌粉末、透皮贴剂；栓剂、单剂包装的口服混悬剂、单剂量包装的眼用、耳用、鼻用混悬剂、固体或半固体制剂。 每片10mg（主药含量片重5%） 其他制剂2mg（主药含量单剂量2% ） 增加每剂25mg（有效浓度与毒性浓度较接近或混匀工艺较困难的品种）,片剂脆碎度检查法,对于形状或大小在检查时形成不规则滚动或由特殊工艺生产的片剂而不适于本法检查时，可不进行本项检查。,片剂通则,一、剂通则介绍 片剂是制剂中最常见的品种最多的剂型。在各国的药典中均有收载。 定义：片剂系指药物与适宜的辅料混匀压制成的圆片状或异型片状的固体制剂。 分类：片剂以口服普通片为主，此外，： 2005版中国药典收载的片剂尚有含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、阴道片及阴道泡腾片、缓释片、控释片、肠溶片 2005版中国药典暂未收载的片剂：口崩片、脉冲片。册去的有速释片,口服普通片：大多数片剂包括非包衣片、包衣片（薄膜衣片、糖衣片）均属于口服普通片，应符合片剂项下有关规定：重量差异、崩解时限、含量、含量均匀度、溶出度、相关物质、微生物限度、包衣片在必要时进行残留溶剂检查（介释）,二、外观（中控或内控标准） 应完整、光洁、色泽均匀，有适宜的硬度和耐磨性，非包衣片除另有规定外（如泡腾片、冷冻干燥成型的片剂.）进行片剂脆碎度检查和硬度检查。 片剂脆碎度检查法：见中国药典附录XG 片重为0.65g者，取总量约为6.5g。 片重0.65g者，取10片，25Rpm,4减失重量不得1%，且不得检出断裂、龟裂或粉碎的片子。可复查23次，但平均减失重量不得1%。,附：片剂外观检查质量标准（参考用）,2、重量差异 概念：指定片重：理论投料量计算的理论片重。 颗粒平均片重：按颗粒总重量平均的片重。 按指定片重计算的重量差异为厂定标准。 按平均片重计算的重量差异为法定标准。 相对而言，理论片重是合理的，因为颗粒收得量计算的平均片重没有减除有形的损耗（机器粘附、丢洒的部分）和无形损耗（随气流排除的部分）。但是以往的片剂辅料中常用的辅料为玉米淀粉，水分在614%之间通常为1011%，而干颗粒水分通常在12.5%之间，为此按理论片重计算会造成片重偏高。现在辅料的应用已发生变化，因此按理论片重计算是较合理的。糖衣片须检查片芯符合重量差异后方可包衣，包糖衣后不再检查重量差异。薄膜包衣后检查重量差异，应符合规定。,药典规定主药规格10mg的片剂须作含量均匀度。凡作含量均匀度检查的片剂可不作重量差异检查。 3、崩解时限片剂除另有规定外，取6片，分别置吊篮的玻璃管中，在371 的水温测定，15内应全部崩解，如有12片崩解不完全，可复测2次。总共18片中超过规定的不得多于2片。从95版开始，不加档板，筛网内径为2mm，为10目筛网。 薄膜包衣片亦可改在盐酸溶液（91000）中进行检查，30分钟内全部崩解，如有1片不能完全崩解，可复测一次，均应符合规定。（目前薄膜包衣材料已采用水溶性或水分散性包衣材料，可用水作介质）。 凡规定进行溶出度检查的片剂，可不作崩解时限检查。,三、详细介绍 含片：系指含于口腔中，药物缓慢溶解产生持久局部作用的片剂。含片中的药物应是易溶的，主要起局部消炎、杀菌、收敛、止痛或局部麻醉作用，除另有规定外，30分钟内应全部崩解。2000版药典要求进行释放度检查，但附录上未能提供测定方法、取样时间点及标准，2005版中国药典从实际需要出发，予以删除。 舌下片：系指置于舌下能迅速溶化，药物经舌下粘膜吸收发挥全身作用的片剂。除另有规定外，各片均应在5分钟内全部崩解或溶化（2005片将融化改为溶化）。舌下片中的药物与辅料应是易溶性的，主要用于急症的治疗，最常用的如硝酸甘油片属于舌下片，作为血管扩张药，治疗心绞痛等急症，除符合片剂项下有关规定外，规定2分钟内起镇痛作用的盐酸丁诺啡舌下片，也已收载入中国药典2000版。,可溶片（2005版片剂通则中新增内容）：系指能溶解于水的非包衣片或薄膜包衣片。 可溶片按崩解时限检查法检查，应于3分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。除另有规定外，水温为1525 。 关于口腔崩解片：本品作为普通片的补充，主要解决无水条件下，于口腔中（舌面）快速崩解，随吞咽动作进入消化道，在口腔内应无粘膜吸收，体内行为与普通片一致，解决老年人吞咽困难及工作奏快、缺水条件下仍可能用的特点。 口崩片一般要求主药含量较小为宜，大部分采用直接压片法、冻干法等所以硬度和耐磨度较差。为了遮盖苦味也有采用明胶、微晶纤维素等包裹主药成小颗粒掩盖不适口味，再加甘露醇、矫味剂、崩解剂、润滑剂等以较小压力直接压片。,2005版药典暂不收载是鉴于目前尚无合适的质量标准作为崩解度测定方法，通常要求：1）口感好，在口腔中20-30秒以内崩解后无粗糙沙砾感。2）采用改进崩解度测定法 溶出度测定通常采用常规溶出度测定法检查，同普通片。 鉴于口崩片的特点，在进行稳定性考察时必须将“口崩”项作为检察项目，加以确证。 溶出度测定法参考： JP溶出度改良法、静置试管法、烧杯法、崩解仪法、滤纸法、润湿崩散法、其它方法 1、静置试管法：玻管（直径 1.5cm）、投入药片、加入37水2ml，静置，观察崩散情况。,2、烧杯法： 烧杯一个（10ml，直径2cm，高35cm ) 加入药片,加入3ml， 37水，计时,60s倒入复以1号筛的烧杯中，应完全通过.必要时再加入5ml水快速冲洗，同法检查6片均应全部通过筛网 崩解仪法： 采用中国药典片剂崩解仪改造，减少移动速度，提高筛网细度。 BP2004 采用崩解仪法：NMT3分钟。 关于脉冲片：脉冲片属于迟释制剂的一种系指口服后不立即释放药物的片剂，而在某种条件下如在体液中经过一定时间或一定pH值或某些酶的作用下，一次或多次突然释放药物的片剂。如心脏病患者在半液易发病，睡前服用后可防止半夜或凌晨发病。国外报道FDA批准上,市的哌甲酯脉冲片有精神兴奋作用，属于脉冲释药技术。每日早晨服用后4小时有一个释药高峰，方便学生用药。,制药用水中总有机碳测定法（新增）,TOC的基本概念 TOC总有机碳 DOC可溶性有机碳 NPOC难气洗有机碳 POC易气洗有机碳 VOC挥发性有机碳 TIC（IC）无机碳 TC总碳，是TOC和IC的总和,水中有机碳的来源,自然界：动植物的腐烂 工业排放：石化，造纸，有机试剂 农业：杀虫剂，化肥 家庭：清洗剂，人畜排泄物,无机碳 IC=CO2（水溶液）+HCO3-+CO32- （pH4.3） （pH10.3） CO2 （液）二氧化碳的水溶液 HCO3- 碳酸氢根 CO32- 碳酸根,USP及EP对水中TOC的规范,USP测试方法采用日期 硫酸根 1840 钙离子 1840 二氧化碳 1850 氯离子 1890 铵离子 1890 易氧化物 1890 重金属 1900 总固体量 1947 大肠菌 1947 pH值 1970 内毒素细菌 1983,USP对水的要求,总有机碳 总有机碳测定被确认为对纯化水（PW）和注射用水（WFI）的可行测定方法，并被引入USP 这个测定方法自1996年11月15日有效。从96/11/15起，TOC方法和易氧化物方法并存，可使用其中任何一个。,USP第23版中的纯化水注射用水,总有机碳方法于1998年5月15日起被正式起用USP-23版第八增版正式去除了易氧化物法,USP对水专题篇的改进,欧洲药典（EP）,采用了“快速、贯施”政策 于1999年3月，EP的第2.2.44章是采用了TOC方法 TOC方法将于今年七月正式生效并将载入今年七月出版的EP2000版 EP的TOC测试要求： 对注射用水必须使用TOC法 对纯化水可用TOC法，也可有易氧化物法,TOC方法的优越性,准确-氧化完全，由人或环境产生的干扰小 简单-操作方法简单 自动化-可进行在线自动监测 管理科学化 TOC法对TOC测定仪的要求 必须使用经校准的测定仪 测定仪必须得通过系统适宜性试验,注射用水纯化水的TOC测试频率,一、从属方面 二、 水的质量方面 1、取与易氧化物 1、选择在线 同样的测试频率 2、水系统里具有代表 2、通常是每一周 性的部位 一次或每月一次 3、应基于水系统工程 3、对所有的采样点进行验证 和水质控制 4、对有代表性的采样点进行 不断的监测,注射用水纯化水的TOC测试点,“用来进行质量属性试验的在线仪器的可接受性取决于在水系统的哪个部位采样。这些采样点和相应值必须反映在用水的质量。” 试验必须具有代表性，能代表所有的使用点！,TOC测试技术,所有TOC测定的基本原理 氧化物 测定 有机物 CO2 CO2 一、氧化技术 二、CO2测定技术 1、高温氧化 1、非分散红外探测（NDIR） 2、加热的过硫氧化 2、直接电异率探测 3、紫外线加过硫氧化 3、薄膜电异率探测 4、紫外线氧化 5、紫外线加二氧化钛氧化,2005版中国药典药品微生物检查修订内容及背景,2005年版药典微生物限度标准修订情况,一、2005年版微生物限度标准的制订原则,2000年版：细菌数、酵母数和霉菌数按剂型制订；控制菌（致病菌）按给药途径制订。 2005版：均按给药途径制订。,二、2005年版微生物限度标准的应用,本版药典明确指出：药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料（中药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。,三、2005年版微生物限度标准的控制项目,杂菌数：细菌数 霉菌和酵母菌数 控制菌（致病菌）：大肠埃希菌 大肠菌群沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌,四、2005年版微生物限度标准的分类,制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂,五、2005版制剂通则项下的微生物限度要求,2005版化学药制剂通则项下的微生物限度要求 无菌检查：注射剂、植入剂、冲洗剂。 原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊、颗粒剂,六、品种项下的微生物限度要求,辅料：乳糖、淀粉、糊精、玉米朊、精制玉米油等。 纯化水：微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录XI J），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。 注射用水：微生物限度取本品至少200ml，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录XI J），细菌、霉菌和酵母总数每100ml不得过10个。,2005年版药典微生物限度检查法的修订情况,微生物限度检查法,起草的指导思想： 完善检查法。 增加试验的可操作性。 使方法更具科学性，保证检验结果 的准确性。 与国际接轨。,增、修订内容（1）-总则1,操作环境 洁净度：微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。 洁净度定期检测：单向流空气区域、工作台面太环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。,增、修订的内容（1）-总则2,霉菌、酵母菌培养温度为2328。 结果报告：以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。,增、修订内容（2）-检验量,随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）的3倍。 贵重，微量样品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。,增修订内容（3）-供试液制备1,表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 供试液制备若需用水浴加热时，温度不应超过45。 供试液的体积：100ml。,增、修订内容（3）供试液制备2,供试品分类 液体供试品 固体、半固体或黏稠液性供试品 需用特殊供试液制备方法的供试品 非水溶性供试品 膜剂供试品 肠溶及结肠溶制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品 具抑菌活性的供试品,增、修订内容（3）供试液制备3,非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”。 结肠溶制剂供试品：用pH7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解。 具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作性。,增、修订内容（4）灭菌,培养基及稀释剂等灭菌：采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。,增、修订内容（5）稀释剂,稀释剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液,增、修订内容（6）-细菌、霉菌及酵母菌计数,计数方法：平皿法、薄膜过滤法 按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。,细菌、霉菌、酵母菌计数-平皿法,培养时间：必要时，可适当延长培养时间至57天。 点计霉菌和酵母菌数。,细菌、霉菌、酵母菌计数-薄膜过滤法,方法 菌数报告规则,增、修订内容（7）-控制菌检查（1）,修订特点： 减少篇幅 不作具体生化试验的规定 增加鉴定方法 适应微生物分类变化要求 增加控制菌检查项,增、修订内容（7）-控制菌检查（2）,修订的检查法 大肠埃希菌检查法、铜绿假单胞菌检查 法、沙门菌检查法、金黄色葡萄球菌检 查法。 新增的检查法 大肠菌群检查法、梭菌检查法。,微生物限度检查用的菌种、菌液制备及计数方法,菌种要求：传代次数，保藏技术 制备方法：液体培养物直接稀释法细菌标准浓度比浊法 计数方法：平皿法 菌液的使用期,2005年版无菌检查法的修订情况,2005年版无菌检查法的特点,2005年版药典附录的无菌检查法较2000年版有较大的改动；增加试验的可操作性；方法更具科学性，提高检出率，保证检验结果的准确性；缩小与先进国家药典的无菌检查法的差别。,增修订内容（1）无菌检查试验环境,环境：试验应在洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内或隔离系统中进行。 监测：应定期按医药工业洁净（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净级的检测。 隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净的洁净度须符合无菌检查的要求。,增修订内容（2）无菌试验用培养基,培养基的命名 培养基的装量 培养基的适用性检查：无菌性检查，灵敏度检查。 培养基的贮藏,增修订内容（3）稀释液、冲洗液,0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,增修订内容（4）灭菌,所有灭菌程序均应验证，方可采用。防止灭菌不彻底或过渡灭菌。,增修订内容（5）无菌检查方法的验证,何时验证 验证用菌株的选取择及要求 验证方法 结果判断,增修订内容（6）检验数量,明确原“最低检验量”是针对每种培养基。 修订了大体积注射剂、抗生素原料药、医疗器具的批产品最低检验数量。 规定同一品种用直接接种法与薄膜过滤法的检验数量应一致，实际上是增加了上市抽验样品薄膜过滤法的检验数量。 各容器的样品装量不够接种两种培养基，应增加一倍的检验数量。,增修订内容（7）检验量,另外规定了固体供试品的检验量。 采用直接接种法时，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，说明了检验量比2000版增加了一倍。 薄膜过滤法的检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。,增修订内容（8）供试品的无菌检查（1）,检查法的选择：规定只要供试品性状允许，应尽量采用薄膜过滤法。 供试品的处理：详细描述了各类型供试品的供试液制备法。,增修订内容（8）供试品的无菌检查（2）,检查法：薄膜过滤法、直接接种法。 培养时间：2000版规定培养7天，2005版规定培养14天。 培养温度：改良马丁培养基置2328培养。,增修订内容（9）-结果判断,以一次检出为准,除非有证据充分证明检出的微生物非供试品本身所致，原检验结果无效，可复试。 修订理由：操作环境、实验条件的改善；低污染供试品的检出率问题。 复试。,增修订内容（10）无菌检查法的局限,本版药典无菌检查法指出： 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。,鲎试剂与细菌内毒素检查法,细菌内毒素检查相关理论及概念,细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查,名词解释,细菌内毒素检查法 热原检查法 LAL TAL,1、细菌内毒素,细菌内毒素与热原的关系 热原 指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。 细菌内毒素 革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖（LPS） 。 热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在GMP的条件下，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒毒就无热原，控制内毒素就控制热原。,细菌内毒素定义变化,过去一直认为，细菌内毒素来源于革兰阴性细菌，但最近发现非毒性革兰阴性LPS结构 所有内毒素均为脂多糖（LPS），但并非所有的脂多糖均为内毒素，因为其不具有相关的毒性。如：肽聚糖、葡聚糖。,细菌内毒素定义变化,尽管对内毒素，以及与LAL反应的物质的认识有了很大的变化，但最终并没有改变作为目前LAL实验基础的两个原则。 1）内毒素性与热原性相关，家兔和LPL实验作为人类和炎症反应的预测方法两者相关。 2）在注射剂生产环境下，通过除外主要的热原物质-内毒素而得以排除热原。,细菌内毒素的生物活性,致热性 引起血液中粒细胞下降 激活凝血系统 血压下降 引起淋巴细胞的有丝分裂 与鲎试剂反应,细菌内毒素的特征,广泛存在 非常稳定 其疏水末断非常易于自身或者与玻璃容器结合而聚集，而不是与水混合。 致热活性的高度不均一性,细菌内毒素参考品的建立,不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。 由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定，可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品。,标准内毒素与环境内毒素,标准内毒素：指经人工取提精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒检查的参考品。 标准内毒素包括参考标准品（RSE）、工作标准品（CSE）、其参考标准品又包括国际标准品（IS）和国家标准品（NSRSE）。,细菌内毒素的量值,80年代以前以重量作为内毒素的单位 1982年USP20引入以生物效价为量值的内毒素单位（EU）,环境内毒素（EET）,天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气中精制内毒素与环境内毒素的差异： 组成：精制毒素脂、多糖 环境内毒素脂、多糖、蛋白质 和杂质 致热性：精制内毒素致热性强 环境内毒素致热性较弱,细菌内毒素标准品的稀释,CP2000年版规定内毒素标准品溶解后国在旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀释前地至少混合30秒，其他国家药典也类似国求； 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果 充分振荡后内毒素疏水端在水相中均匀分布；若静置一段时间，疏水端重新集成藏于器壁,世界上现存鲎的种类,鲎是一种海样无脊椎动物，蓝色的血液。 种类以及分布： 美洲鲎：北美洲东岸海域 中国鲎：中国东南沿海 南方鲎：泰国和马来群岛海域 圆尾鲎：东南亚西部海域,世界上现存鲎的种类,3种 亚洲东海岸 1种 北美大西洋沿岸,鲎试剂与分类,鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂的种类： -依据鲎的种类分： 美洲鲎试剂（LAL） 中国鲎试剂（TAL） 圆尾鲎试剂（CAL） -依据检查方法分： 凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂 -依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分： 普通鲎试剂和特异性鲎试剂,BET的目的和前提,确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足量的细菌内毒素。 一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。,细菌内毒素检查法,凝胶法 光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法）,凝胶法,最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法 对干扰相对不敏感。 有两倍的误差 较光度测定法不灵敏,2005年版药典细菌内毒素检查法修订内容,结构上的调整 方法学上的修改 细节描述上的修改,一、结构调整,BP2002、USP25、JP14的叙述是按试验步骤纂写的，容易理解，比较合理。各种溶液的配制采用表格形式，直观易懂。 2005版检查法改变2000版的叙述顺序，以及表格的形式，这是两版药典细菌内毒素检查法区别最大的地方。,以凝胶限量试验溶液的制备为例,A：供试品溶液 B：供试品阳性对照 C：阳性对照 D：阴性对照,2000年版与2005年版药典内毒素检查法整体结构,2000年版与2005年版药典内毒素检查法整体结构,2000年版与2005年版药典内毒素检查法整体结构,二、方法学上的修改,1、2000版药典中只收载凝胶法，定量法只作为指导原则的一部分收载。 2005年版将2000年版的指导原则合并入检查法中，正式收载细菌内毒素定量检测法（光度法）。,方法学上的修改,2、增加了凝胶法半定量法,3、将凝胶法干扰实验中供试品对照管由2支增加为4支，鲎试剂标示灵敏度对照系列保持4支。,4、将凝胶法中各种对照的数量由1支增加为2支。,5、光度法试验中的几点改动,5、光度法试验中的几点改动,5、光度法试验中的几点改动,三、细节描述上的修改,1、由于2005年版药典将凝胶法与光度测定法同时收载，所以在简介中对凝胶法和光度法都进行了描述。并且也将两种方法的试验准备及限值的确定一同论述。 2、由于2000版药典中对于细菌内毒素工作标准品的要求“细菌内毒素工作标准品中，每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”为生产要求，并不针对用户，在2005版中删除对工作品的此项标准。 3、因为考虑到供试品溶液中pH值等因素对试验的影响，故在2005版增加了“供试品溶液的制备”项，并对供试品的pH值提出了要求。 4、由于2005版将凝胶法与光度法一同收载，因此也将原来分开论述的最大有效稀释倍数（MVD）的计算方法合并。,5、在干扰试验中，添加了“为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验”。 6、在光度测定法中，规定“供试品各鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种溶液至少做2个平行管。”,中国药典2005年版细菌内毒素检查法 介绍,整体结构 一、综述部分 检查法的描述 实验的准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD） 二、实验部分 1、凝胶法 2、光度测定法 a、鲎试剂灵敏度复核 a、标准曲线的可靠性实验 b、干扰实验 b、干扰实验 c、检查法：限量试验 c、检查法 半定量试验,一、综述部分 检查法的描述 试验的准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD）,1、检查法的描述 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外以凝胶法结果为准。 细菌内毒素标准物质 国家标准品 工作标准品,1、检查法的描述 细菌内毒素检查用水 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。 光度测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005 EU/ml。,2、试验的准备 试验器械的要求 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的内毒素。常用的方法是在250干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。 若使用塑料器械，如微孔板与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。,2、试验的准备 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。,3、限值（L）的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。 计算举例：注射用阿莫西林钠 根据国家药典委员会编纂的临床用药须知：“肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.51g，一日34次：小儿按体重每日50100mg/Kg，分34次静脉滴注。” M成人=1000mg/h60Kg=16.67mg/(Kgh) M成人=100mg/ (Kgh) 3=33.3.mg/(Kgh) L=K/M=5EU/ (Kgh) 33.3.mg/(Kgh)=0.150EU/mg,3、限值（L）的确定 限值计算时做必要调整的几种情况 从严原则 联合用药 特殊情况等,4、确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指供试品溶液被充许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVD=cL/ L：供试品的细菌内毒素限值 C：供试品溶液的浓度 ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上低的内毒素浓度。 （如标准曲线为50、5、0.5EU/ml三个浓度组成）,4、确定最大有效稀释倍数 （MVD） 计算举例： a、当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml适用于供试品为状态，并且规定限值为应小于xxEU/ml。 例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则 MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml=4倍 b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c的单位需为mg/ml或U/ml。 适用于供试品为固体状态，如粉针；或液但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U。,例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。 如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。 MVD=20mg/ml0.15EU/mg0.125EU/ml=24倍,4、确定最大有效稀释倍数（MVD） 如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c= /L； 适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。 例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂行检验。 最小有效稀释浓度 C= 0.125EU/ml 0.15EU/mg=0.833mg/ml,二、实验部分 1、凝胶法 2、光度测定法 a、鲎试剂灵敏度复核 a、标准曲线的可靠性实验 b、干扰实验 b、干扰实验 c、检查法：限量试验 c、检查法 半定量试验,鲎试剂灵敏度复核试验,试管阴性 阳,鲎试剂灵敏度复核试验,放入371 的恒温器中，保温60分钟2分钟。 将试管从