RTPCR法检测MYCT1基因在GES1细胞中的表达.doc

RT-PCR法检测MYCT-1基因在GES-1细胞中的表达【摘要】 目的 检测MYCT-1(myc target)基因在胃黏膜GES-1细胞系中的表达，探讨GES-1细胞作为RNA干涉细胞模型的价值。方法 用TRIZOL法提取GES-1细胞总RNA，RT-PCR法扩增MYCT-1 cDNA，DNA测序验证。结果 在GES-1细胞中检测到504bp MYCT-1 cDNA片段，测序证实与GenBank报道序列完全一致。结论 GES-1细胞中存在MYCT-1表达，可作为RNA干涉细胞模型。 【关键词】 MYCT-1;GES-1细胞系;RT-PCRMYCT-1(myc target 1)是本室克隆的新候选抑癌基因，GenBank登录号NM_0251071，曾命名MTLC(myc target from laryngeal cancer cells)。前期研究表明MYCT-1广泛表达于多种正常组织，且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达下调25。为进一步研究MYCT-1基因的生物学功能及在肿瘤发生、发展中的作用，准备用RNA干扰(RNA interence, RNAi)技术沉默正常细胞中MYCT-1的表达，以了解MYCT-1低表达对正常细胞生长特性、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。本文用RT-PCR法和DNA测序检测胃黏膜GES-1细胞中MYCT-1的表达，探讨GES-1细胞作为RNA干涉模型的价值。1 材料与方法1.1 材料 GES-1细胞(肿瘤研究所);TRIZOL试剂、1640培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司);反转录酶、Taq酶(Promega公司);MYCT-1引物(大连宝生物公司)，序列为：正向引物：5-ATGGATCCCTGCACTGGCTGATGAGTGTGTA-3;反向引物：5-GTAAGCTTGAACAGTGCCTTCACCCTCGA GGT-3;其他试剂均为国产分析纯。1.2 细胞培养 将1.5105 GES-1细胞接种至35mm培养皿中，加入含10%胎牛血清1640培养基，在5%CO2、37条件下培养，铺满后以0.25%胰酶消化传代，4h后细胞贴壁生长，24h后进入对数生长期。1.3 总RNA提取 取对数生长期GES-1细胞1106加入1ml TRIZOL 试剂，匀浆后室温静置5min，加0.2ml氯仿涡漩振荡15s，室温放置23min。4、12000rpm离心15min，将上清液移至另一新管，加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置10min，4、12000rpm离心10min，弃上清液，加75%乙醇(DEPC处理水配制)1ml，涡漩漂洗1次，4 7500rpm离心5min，弃上清液，空气干燥15min，沉淀溶于0.01% DEPC-treated water，置5560水浴中孵育10min，取少量用于RNA含量及纯度测定，其余分装后置-70冰箱保存。1.4 cDNA的合成 用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链，反应体积10l，反应体系中加入：总RNA2.0g，Oligo(dT)15引物0.5l，25mmol /L MgCl2 2.0l，10mmol/L dNTP 1.0l，10buffer 1.0l，RNase Inhibitor 0.25l，AMV(25U/l)0.6l，ddH2O补足10.0l，30孵育10min，42孵育30min ,99 5min终止反应，5 5min灭活反转录酶。-20冻存备用。1.5 PCR扩增反应 反应体系如下：反转录产物1.0l，25mmol /L MgCl2 0.5l，10buffer 2.5l，引物各0.25l，Taq酶(5U/l)0.3l，ddH2O补足25.0l。PCR反应条件为：95预变性30s，然后按95 30s、56 30s、7230s进行35个循环，最后72延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.6 DNA测序 PCR产物由大连宝生物公司测序。2 结果2.1 RT-PCR结果 PCR产物琼脂糖电泳结果为单一条带，大小约504bp，与预期相符(图1)。2.2 DNA测序结果 经与GenBank比对，扩增产物序列与MYCT-1 cDNA序列完全相符。3 讨论MYCT-1基因主要分布于细胞核，可能与细胞信号转导有关。组织表达谱分析发现MYCT-1在各种正常组织中均有表达，而在胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤表达下调，说明它对维持细胞的正常功能是必需的，可能是一个新的抑癌基因。利用细胞模型研究其功能是常用的方法之一。图1 PCR扩增产物电泳结果M：DL2000 marker 1：MYCT-1RNA干涉(RNA interference,RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象，这一机制能够特异性地降低目的基因的表达，是生物体内普遍存在的生理现象。通过对这一现象的深入研究，利用体外合成双链RNA诱发RNA干扰，这一技术被不断完善，并广泛用于基因功能和基因治疗研究。在本研究中，选用人胃黏膜细胞系GES-1作为研究模型。GES-1细胞系可在体外长期稳定传代，且在裸鼠中不致瘤，已广泛用于离体癌变的研究。有无MYCT-1基因表达，是GES-1细胞能否作为研究模型的关键。用RT-PCR方法检测了培养细胞的MYCT-1表达水平，结果表明可以从细胞总RNA提取物中扩增出MYCT-1 cDNA片段，DNA测序证实扩增序列与GenBank报道的序列完全相同，证实GES-1细胞可以作为RNAi模型用于MYCT-1基因功能研究，为下一步工作奠定了基础。【参考文献】 1 邱广斌, 贺光, 孙开来，等. 6q25区域一个新基因MYCT-1的克隆及特性分析. 中华医学遗传学杂志，2003, 20(2): 94-97.2 Qiu GB, Gong LG, Hao DM, et al. Express of MTLC gene in gastric carcinoma. World Journal of Gastroenterology, 2003, 9(10): 2160-2163.3 欧阳小明，黄世章，梅开勇. MTLC基因在乳腺癌组织中的表达及其意义. 中国煤炭工业医学杂志，2006, 9(7): 695-696.4 刘水平, 贺剑鸣. MTLC 基因