RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节.doc

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节【摘要】 目的: 研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法: 通过克隆RGS1基因、 转染RAW264.7细胞、 建立稳定转染的细胞系, 利用流式细胞术检测, 基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果: RGS1基因能够抑制NFB转录因子活性; RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达, 降低CD80表达; 在不同Toll样受体配体刺激后, CD40、 CD80和PD1水平低于对照组。同时, RGS1基因使IL6、 IL15的表达明显升高, IL10、 IL1的表达明显降低。结论: RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌, 影响Toll 样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。 【关键词】 免疫调节 RGS1基因 免疫相关细胞免疫细胞表面刺激分子和由此产生的细胞因子在调节免疫反应过程中起关键作用, 对肿瘤免疫, 移植排斥反应和自身免疫性疾病的发生、 发展、 转归有着重要的影响。已经发现免细胞中有多种基因表达的改变1。我们前期研究中发现卵巢肿瘤细胞能够导致抗原提呈细胞RGS1上调, 提示了RGS1可能在免疫调节过程中起作用。RGS1（regulator of G protein）是GTPase激活蛋白, 由许多成员组成。这个家族的成员能在免疫细胞如T细胞、 B细胞和树突细胞表达。有研究表明, RGS1基因与趋化因子诱导的免疫细胞迁移有关, 从而对免疫功能进行调节2。我们通过建立RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞系, 观察其对细胞表面分子表达的影响和细胞因子分泌模式的改变外, 为RGS1在免疫相关疾病治疗的潜在应用提供实验依据。1 材料和方法1.1 材料 RAW264.7细胞购自美国ATCC公司。NFB荧光素酶质粒和NFB碱性磷酸酶(seap)质粒由美国约翰霍普金斯大学免疫实验室赠与; 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5质粒由本实验室构建; pcDNA3.1/V5His TOPOTA Expression试剂盒购自Invitrogen公司; PCR缓冲液、 dNTPs、 Taq、 Agarose Gel DNA 纯化试剂盒购自TaKaRa公司。LipofectaminTM2000, SuperScript. OneStep RTPCR with PlatinumTaq购自Invitrogen公司。RNA TRIzol 试剂购自北京鼎国公司。Great EscAPeTM SEAP 购自Clontech 公司。TritonX100, 羊抗鼠抗体为Sigma公司产品。Trypsin 胰酶（Lot: AMG 16843）为HyClone公司产品。OPTIMEMI 无血清培养基购自Invitrogen公司。PRMI1640 购自HyClone公司。类标准胎牛血清购自兰州民海生物公司。G418硫酸盐, 硫酸卡那霉素购自Amresco公司。1.2 方法1.2.1 克隆RGS1基因测序并建立稳定转染的RAW264.7细胞系 按照Invitrogen公司提供步骤,从肿瘤相关树突状细胞扩增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA 3.1 His/V5 Topo 载体, 测序确定RGS1基因。RPMI1640培养基加入100 mL/L新生牛血清培养RAW264.7细胞。取4105细胞加入24孔板培养过夜。1 g 鼠RGS1pcDNA 3.1/V5质粒溶于50 L OPTIMEM培养基, 颠倒混匀。2 L Invitrogen LipofectaminTM2000溶于50 L OPTIMEM培养基, 颠倒混匀后室温孵育5 min。混合DNA溶液与LipofectaminTM2000溶液, 颠倒混匀后室温孵育20 min。吸出24孔板中培养基, 加入100 L混合溶液培养8 h。加入500 L含血清培养基培养24 h。用400 mg/L 浓度的 G418和 100 mL/L血清培养基筛选培养15 d。1.2.2 检测稳定转染细胞系转染率 取4105稳定转染细胞于流式染色管中1 600 r/min 离心5 min, 弃上清, 加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清, 用1 mL (1 g/L)多聚甲醛固定细胞。加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清。加入TritonX100 室温静置5 min, 加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min, 弃上清。染色: 2 mL PBS 1 600 r/min, 离心5 min, 弃上清后加入100 L PBS吹散细胞,用1 g/L多聚甲醛固定, 然后1 g/L Triton 穿透, 加入1 L FITC标记的antiV5抗体, 避光放置15 min。加入2 mL PBS 1 600 r/min离心5 min后弃上清, 加入100 L PBS吹散细胞, 取50 L滴于载玻片上, 荧光显微镜观察。1.2.3 RGS1基因对转录因素活性的影响 NFBseap质粒与RGS1基因共转染RAW264.7细胞, 通过化学发光方法检测RGS1基因对转录因素NFB活性的影响。准备细胞: 100 mL/L 新生牛血清DMEM培养基培养RAW264.7细胞, 细胞计数后按每孔4105细胞铺入24孔板, 加入1 mL培养基（不含抗生素）培养过夜。 按照Invitrogen LipofectaminTM2000使用说明书方法共转染RGS1基因及NFBseap质粒。转染36 h后每孔收集110 L细胞上清液于0.5 mL 微量离心管中, 12 000 g离心10 s, 去除细胞沉淀, 吸取100 L上清液于新0.5 mL微量离心管, -20保存。通过化学发光强度检验（Clontech Great EscAPeTM SEAP）,利用化学发光分析仪检验化学发光强度, 并处理数据。1.2.4 FCM检测RGS1基因对免疫相关细胞RAW264.7表面分子表达水平的影响 培养RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞及未转染的RAW264.7细胞（对照）,实验组与对照组分别用不同的Toll 样受体配体脂多糖（LPS）, Poly I: C, 肽聚糖（peptioglycan, PGN）, 细菌 DNA （BDNA）刺激48 h后, 细胞计数后取1107细胞与15 mL离心管中, 1 600 r/min离心5 min, 加入5 mL PBS冲洗后, 1 600 r/min离心5 min, 弃上清。离心管中加入700 L PBS缓冲液, 平均分入7个预先标记好的流式管中, 加入相应抗体后, 避光放置15 min。每管加入2 mL PBS, 1 600 r/min离心5 min, 洗去未结合抗体, 1 g/L多聚甲醛固定。FACSCalibur流式细胞仪测定荧光强度, 并用FACSort流式细胞仪Cell Quest软件分析实验结果。1.2.5 RGS1基因对免疫相关细胞RAW264.7细胞因子表达水平的影响 分别培养1107 RGS1基因稳定转染的RAW264.7细胞及未转染的RAW264.7细胞（对照）。倒出培养瓶中的培养基, 5 mL PBS冲洗1次。加入1 mL TRIzol溶液, 消化细胞5 min, 转入2 mL微量离心管中。离心管中加入1 mL氯仿, 充分颠倒混匀, 冰上放置15 min, 4 12 000 g离心15 min, 分离RNA、 DNA与蛋白。小心吸取上层清亮溶液至新的2 mL微量离心管中, 加入0.5 mL异丙醇冰上放置30 min, 沉淀RNA, 4 12 000 g离心15 min。小心倒出上清, 离心管中加入1 mL酒精冲洗沉淀, 4 8 000 g离心5 min。小心倒出上清, 室温放置15 min, 充分挥发残余酒精, 加入50 L去RNA酶蒸馏水溶解沉淀。取10 L溶液用于基因芯片分析（美国约翰霍普金斯大学）, 剩余溶液-20保存。2 结果2.1 稳定转染细胞系建立 我们从肿瘤相关树突细胞扩增提取RGS1基因片段并克隆到pcDNA 3.1 His/V5 Topo 载体,测序确定RGS1基因正确之后进行转染。转染RGS1pcDNATM3.1/V5质粒的RAW264.7细胞在400 mg/L G418 1640培养基选择下培养15 d后, 取4105细胞, 用抗V5抗体染色后, 稳定转染细胞在紫外光下表现为绿色荧光, 阳性细胞比例超过80%（图1）。图1 RGS1基因稳定转染细胞系V5抗体荧光染色（略）Fig 1 Fluorescent micrograph of RGS1 stable transfected cells with V5 antibody staining(200)A: Morphological observation of cells; B: Observation of transfected cells under fluorescent microscope.2.2 RGS1基因对RAW264.7细胞转录因素NFB活性的影响 用RGS1载体与NFBseap报告基因共同转染RAW264.7细胞, 24 h后取上清,利用试剂盒检测化学发光强度（图2）。在未加刺激条件下,控制组转录因素活性较低,加入1 mg/L TLR4配体LPS刺激之后,转录因子的活性明显增强, 但转染RGS1基因细胞的转录因子活性要显著低于未转染基因细胞组。经过25 mg/L TLR3配体PolyI: C刺激之后, 转录因素活性明显升高, 未转染RGS1基因的细胞转录因素活性的增加更为明显。2.3 RGS1基因对RAW264.7细胞表面分子表达水平的影响 转染RGS1基因的RAW264.7细胞与对照细胞分别经过抗体染色之后, 经过流式细胞术分析表面分子表达水平的变化, 发现CD86表达明显升高, CD80表达稍有降低, 其余没有明显变化（图3）。然后利用100 nmol/ L TLR9配体BDNA, 1 mg/L TLR4配体LPS, 50 mg/L TLR2配体PGN以及25 mg/L TLR3配体Poly I: C刺激转染RGS1基因的细胞, 发现可以使细胞表面CD40, CD80, PD1分子表达水平与对照组相比明显降低, 而CD86的表达水平未见明显差异（图4）。图2 RGS1基因对转录因子NFB活性的影响（略）Fig 2 Effect of RGS1 on NFB activity with or without stimulation of LPS and Poly I:C图3 FCM检测RGS1基因转染的RAW264.7细胞表面分子表达（略）Fig 3 FCM analysis of expression of surface molecules by RGS1 transfected RAW264.7 cellsNote: The black, red and green lines are representing the unstained cells, RGS1 transfected cells and untransfected cells, respectively.图4 RGS1基因转染的RAW264.7细胞经不同Toll 样配体刺激后细胞表面分子的表达（略）Fig 4 The expression of surface molecules on the RGS1 transfected RAW264.7 cells stimulated with different Toll like receptor ligandsNote: The black, red and green lines are representing the unstained cells, RGS1 transfected cells and untransfected cells, respectively.2.4 RGS1基因对RAW264.7细胞因子表达水平的影响 提取转染RGS1基因的RAW264.7细胞总RNA进行基因芯片分析, 与对照细胞相比, RGS1基因使细胞因子IL6 和IL15的表达明显升高, IL10和IL1的表达显著降低（表1）。表1 RGS1基因转染的RAW264.7细胞总RNA基因芯片分析（略）Tab 1 Global Microarray analysis of RGS1 transfected RAW264.7 cellsNote: TRAW264.7: RGS1 transfected RAW264.7 cells.3 讨论 RGS蛋白控制G蛋白信号转导, 加速G亚单位的GTP酶活性, 与其相关的G蛋白耦联受体也包括部分细胞因子受体, 因此靶细胞上RGS的表达可以改变对化学因子的反应性3。目前发现RGS1蛋白在淋巴细胞中可以被诱导表达4, 功能主要包括影响趋化因子诱导的B细胞的移动5和树突细胞的移动6, 并且影响B细胞对细胞趋化因子的反应及增强脱敏作用3。我们前期的实验已经证实对癌细胞引导的免疫耐受树突细胞进行基因芯片分析中有多种基因表达的改变, 其中包括RGS1基因。本研究中进一步探讨了转染RGS1基因的RAW264.7细胞表面分子和细胞因子分泌的变化。 本实验中, 我们转染的RGS1基因细胞的转录因子NFB活性要显著低于未转染基因细胞, 表明RGS1可能通过抑制NFB从而产生抑制肿瘤生长的作用, 已经知道NFB可以调节刺激肿瘤细胞增殖的基因表达, 促进肿瘤的生长和转移7。Toll样受体（TLR）信号可以激活NFB信号, 促进DC细胞成熟2, 8。经过TLR配体LPS和PolyI: C刺激之后,转染RGS1基因的细胞转录因子活性仍然受到抑制, 可能阻断了TLR相关信号向下游传导。经不同Toll样受体配体刺激后细胞表面分子的表达有不同程度的变化, 转染RGS1基因的RAW264.7细胞CD40、CD80和PD1的表达在刺激之后受到明显的抑制。其中, CD40是调节免疫反应的重要的共刺激分子, 其可以通过 NFB上调IL6、 黏附分子(CD54)和抗凋亡蛋白表达, 促使细胞增殖。转染RGS1基因后使CD40表达下调, 可能抑制其与配体结合后促进肿瘤细胞的生长的效应, 也可能是RGS1免疫调节的机制之一。另外, 转染RGS1基因的RAW264.7细胞协同刺激分子CD86的表达明显升高, 而CD80的表达有所降低。有研究表明, CD80/86也是T细胞重要的协同刺激分子, RGS1蛋白对其表达调控可以影响T细胞功能, 影响其增殖和迁移9。 同样, 在实验中我们检验转染了RGS1基因的RAW264.7细胞重要细胞因子的表达情况, 与对照细胞相比, IL15的表达明显升高, 已知它可以促进NK细胞增殖及细胞毒活性。表达同样增加的IL6为重要的炎性因子, 可增加T、 B细胞的增殖, 分化, 并肿瘤的黏附, 刺激肿瘤特异性抗原的表达10。肿瘤耐受树突细胞RGS1基因表达的上调并由此IL6的水平增高,反映了RGS1基因可能的对免疫功能的调节作用, 具体机制还需要进一步的研究。 RGS1基因在免疫调节过程中的具体的分子机制尚不十分清楚。在本实验当中, 我们所用TLR配体刺激的剂量也可能对结果产生影响, 具体还需要深入研究。我们推测, RGS1基因有可能作用于Toll样受体信号通路的下游分子发挥阻断作用, 同时其对未活化细胞表面分子表达改变的机制仍不十分明了, 均有待深入研究。【参考文献】 1 Beriou G, Peche H, Guilonneau C, et al. Donorspecific allograft tolerance by administration of recipientderived immature dendritic cells and suboptimal immunosuppressionJ. Transplantation, 2005, 79(8): 969-972.2 Shi GX, Harrison K, Han SB, et al. Tolllike receptor signaling alters the expression of regulator of G protein signaling proteins in dendritic cells: implications for G proteincoupled receptor signalinJ. J Immunol, 2004, 172(9): 5175-5184.3 Han JI, Huang NN, Kim DU, et al. RGS1 and RGS13 mRNA silencing in a human B lymphoma line enhances responsiveness to chemoattractants and impairs desensitizationJ. J Leukoc Biol, 2006, 79(6): 1357-1368.4 Kehrl JH. Heterotrimeric G protein signaling: roles in immune function and finetuning by RGS ProteinsJ. Immunity, 1998, 8(1): 1-10.5 Bowman EP, Campbell JJ, Druey KM, et al. Regulation of chemotactic and proadhesice responses to chemoattractant receptors by RGS family membersJ.