《禽病实验室诊断》PPT课件.ppt

禽病诊断,河南农业职业学院动物科学系 闫民朝 TEL实验室诊断 一、血清学试验 (一)凝集试验 1.直接凝集试验 凝集反应即细菌、红细胞(Hb)等颗粒性抗原与相应的抗体在电解质参与下,抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象称为凝集反应。参与反应的抗体称为凝集素,抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。,(1)平板凝集试验 取洁净玻板一块,用蜡笔按试验要求划成数个方格,并注明待检血样的号码;用生理盐水倍比稀释血清,加入抗原,用牙签(或火柴棍之类)自血清量最少(血清稀释度最高)的一格起,将血清与抗原混匀,注意抗原用前摇匀,并置室内,使其温度达20以上。混合完毕用酒精灯稍微加温,使达30左右,58min内记录结果。,按下列标准记录反应强度： :出现大的凝集块,液体完全透明。 :有明显凝集片,液体几乎完全透明,即75%凝集。 :有可见凝集片,液体不甚透明,即50%的凝集。 :液体混浊,有小的颗粒状物,即25%凝集。 :液体均匀混浊,即不凝集。 该法为一种定量方法,常用于检测待检血清中的相应抗体及其效价。如一般以以上血清最高稀释度为该血清的凝集价。也用定性作为禽病阳性判定,协助临床诊断及流行病学的调查。注意：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。,(2)试管凝集试验 既可用已知抗原(细菌混悬液)检测待检血清,又可用阳性血清检测待检抗原。 每份血清用4支试管,另取3支对照管。 用0.5%石炭酸生理盐水将被检血清稀释成四个稀释度。第5管中不加血清,设为抗原对照。第6管中加1:25稀释的阳性血清0.5ml个阳性血清对照。第7管中加1:25稀释的阴性血清0.5ml作为阴性对照。 各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍的抗原0.5ml,并充分混匀。 放入37下作用410h,取出后放室温1824h观察并记录结果。,试管凝集试验操作示意表 单位:ml,弃去1.5,(3)玻片凝集法 又称快速凝集反应,为一种定性试验,常用于鸡白痢的诊断及流行病学的调查中,也用于鸡传染性鼻炎,鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等的诊断。现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明：用滴管吸取标准诊断液(即鸡白痢凝集标准抗原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净的玻片或干净普通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿,采血一滴(约0.04毫升),使之与诊断液混匀,可用牙签或火柴棍搅匀,或稍微靠在桌边缘摇动玻片,频频变动玻板水平位置,使混合均匀。,如在13min内细菌和红细胞从混合液滴的边缘开始逐渐凝集成较大的颗粒,呈片状、团块状,将红细胞凝集成许多小区,液体几乎完全透明,外观是花斑状,则判为阳性反应;如在23min之内不出现凝集现象,而且玻板上的混合液均保持原来的状态,或者中间部分较浓,四周较稀薄的混悬物,则可判为阴性反应。该反应温度条件在室温2030进行。,类似的还可用血清进行快速凝集反应,其方法为选用洁净玻片或载玻片,下面衬以黑色展板,在玻片上滴一滴血清或相当凝集价的稀释血清,再滴一滴鸡白痢凝集标准抗原(诊断液)混合均匀,几分钟后观察凝集成块情况,判定阴阳反应。如阴性反应,则混和液保持一致混浊的红色。,(4)微量凝集法 该方法原理均同试管凝集法,只是操作在微量滴定板(反应板)上进行,抗原、抗体用量很少,故称微量凝集试验,即用数根稀释棒并排在型或型微量滴定板上揉搓,将待测血清作系列倍比稀释,随后滴加抗原振荡混合,置37温箱或温室内一定时间(1224h),判定结果方法同平板法。,2.间接凝集试验 即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关的小颗粒(载体)的表面,此吸附抗原(或抗体)的载体颗粒与相应的抗体(或抗原)结合,在有电解质存在的适宜条件下发生凝集现象。亦称被动凝集试验,常用的载体有动物的红细胞,聚苯乙稀乳胶活性炭等,吸附抗原后的颗粒称为致敏颗粒。,现将最常用的间接血凝试验介绍如下： 间接血凝试验是以红细胞为载体,将抗体(或抗原)吸附在红细胞表面,用来检测微量的抗原(或抗体),吸附有抗体(或抗原)的红细胞也称致敏红细胞。间接血凝试验目前多采用微量法,可选用型或型微量反应板,将待检血清在血凝板试验用的反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀释,再加等量致敏红细胞悬液,振荡混匀后,置于一定温度数小时或于2530放置过夜,观察凝集程度。以出现50凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝价。 试验应设如下对照:致敏红细胞加稀释液的空白对照;已知阳性血清对照;已知阴性血清对照;未致敏红细胞加阳性血清对照。,(二)免疫琼脂扩散试验(AGP) 抗原与相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中会自由扩散,形成肉眼可见的沉淀带称为免疫琼脂扩散试验(沉淀试验)。 可用已知抗原沉淀未知抗体,也可用已知抗体测定未知抗原,特异性强,可用于禽流感(AI)、禽霍乱、鸡白痢、马立克(MD)、传染性法氏囊炎(IBD)、传染性支气管炎(IB)、传染性鼻炎(IC)、传染性脑脊髓炎(AE)、病毒性关节炎(REO)、鸡包涵体肝炎(IBH)等的诊断。,1.琼脂的制备方法 琼脂凝胶中含1%的优质琼脂粉、0.1%石炭酸、8%NaCl,水浴加热至全溶,分装于三角瓶中,于4条件下冷藏备用。用前将其置入沸水浴中融化,待温度下降至5060时倒入培养皿中(或玻片上),厚度为35mm 。然后打孔(孔直径4mm,孔距34mm)。结束后在火焰上轻轻烘烤(封底),即可加样。,2.操作方法：用已知抗 原测定血清抗体时,中 央孔加入已知抗原, 1、4孔加阳性血清对照, 2、3、5、6孔加待检血 清;用已知阳性血清测 未知抗原时,中央孔加 已知阳性血清, 1、4孔 加已知抗原对照,2、3、 5、6孔加待检抗原材料 (加满即可,不可外溢)。 然后加盖,置于37恒 温箱中反应2448h后观察。,3.结果判定：阳性者在两孔之间会出现一条肉眼可见的沉淀带。阴性者无此现象出现。1.抗原抗体分子量相同,浓度也相同。2.抗原分子量小扩散系数大浓度相同。 3.抗体分子量小。 4.分子量相同,但抗原浓度高。5.抗原分子量高且浓度高。6.抗原浓度高,抗体分子量小。,(三)血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) 1.原 理 正副粘病毒科的病毒(如ND、AI、IB、EDS-76等)可凝集红细胞,而特异性抗体可抑制这种凝集,即凝集抑制。,2.HA的操作方法: 112孔先加50LpH为7.2的0.01mol/LPBS液或生理盐水;第1孔中加入50L抗原(如ND病毒)振荡混匀;逐级稀释至第11孔时弃去50L,第12孔不加抗原,做为红细胞对照;112孔各加0.5%鸡红细胞悬液50L,振荡1530s,使其混匀,静置于37作用2040min观察结果; 待对照孔中的红细胞全部沉入孔底中间,即可判定各 孔的红细胞凝集情况,以病毒最大的稀释度孔出现100%凝集现象者为这个病毒的凝集价,即一个血凝单位。,HA试验操作示意表 单位:l,弃去50,3.HI的操作方法: 111孔先加25L稀释液;1孔中加入25L待检血清(或已知阳性血清);逐级稀释至第10孔时弃去,第11孔不加血清,为阴性对照第12孔不加血清和抗原,为红细胞对照;111孔各加25L4单位抗原,振荡30秒,37作用20min;112孔各加0.5%红细胞悬液,振荡1min,37作用2030min观察结果;待第11抗原对照孔的红细胞均匀铺在管壁上(100%凝集)时,检查孔中完全不凝集为该血清的血凝抑制价。,HI试验操作示意表 单位:l,4. HA和HI试验的应用 用于AI、ND、IB、EDS-76等 病毒的鉴定 这些病毒都能使家禽的红细胞发生凝集,然后用特定的抗体来抑制,若出现凝集抑制则可确定是该种病毒。,HI试验可用于发病禽群的诊断 比如用ND疫苗免疫过的鸡群中,ND抗体水平为78lg2,最高不超过10lg2,其群体中抗体水平呈正态分布,10lg2以上的仅占10%以下,4lg2以下的仅占1%。而被ND强毒感染并发病的鸡群中,HI抗体可高达1113lg2,并且鸡群中的抗体水平不呈正态分布,10lg2以上的占25%,4lg2以下的占1030%。同时结合其它诊断方法以确诊。,可以进行抗体检测 可检测家禽的血清抗体或卵黄抗体(母源抗体),对禽群的免疫状态进行评价,以指导免疫。首次进行ND免疫时,母源抗体(半衰期为5d)水平应在3lg2时进行,以后再免时应在45lg2之间时进行,过高时则会产生免疫干扰,过低则易发病。,可检测抗体效价 可检测高免血清或高免卵黄的抗体效价,从而对其进行质量评价。高免血清或高免卵黄的抗体效价在9lg2以上时,才可用于传染病的紧急预防或发病早期的治疗。,(四)红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验 又称红血球吸附和红血球吸附抑制试验。某些病毒如鸡痘病毒、正、副粘病毒等,在培养的细胞内增殖后,可使培养的细胞吸附某些动物的红细胞,而且只有感染细胞的表面吸附红细胞,不感染的细胞不吸附红细胞,因此可以作为这种病毒增殖的衡量指数。红细胞吸附现象也可被特异抗血清所抑制,故可作病毒的鉴定方法,尤其对一些不产生细胞病理变化的病毒,不失为一种快速有效的鉴定方法。,操作方法：细胞经培养长成单层后,常规接种病毒,经一定时间培养,弃培养液,加0.40.5%已洗涤的红细胞悬液,置室温(1820)作用一刻钟(某些病毒置4或37);加少量生理盐水,轻轻洗涤,去未吸附的红细胞,放在低倍显微镜下观察。如红细胞粘附于单层细胞中的感染细胞表面,病毒大量增殖时,可见整个单层细胞粘满红细胞,则均判为阳性。进行抑制试验时,用Hanks液将经病毒接种培养后的培养液洗涤2次,然后加入1:10稀释的抗血清,室温或3730分钟后,弃血清,加入红细胞悬液,如上进行红细胞吸附试验,镜检红细胞吸附强度,与对照相比,完全抑制为阳性。,附：Hanks(汉克斯氏)液： 原液甲1:NaCl160g,MgSO47H2O2g,KCl8g,MgCl26H2O 2g,按顺序加入到800ml双蒸溜水中,一物溶解后再加另一物。 原液甲2:CaCl22.8g溶于100ml双蒸溜水中。以上两液混合,加双蒸溜水达1000ml,加2ml氯仿防腐,保存于5。 原液乙1:Na2HPO412H2O3.04g 葡萄糖20gKH2PO41.20g按顺序加入到800ml双蒸溜水中。 原液乙2:0.4%酚红液100ml(0.4%酚红液将是0.4g酚红置乳钵中,边研磨边涂加入0.1N的NaOH11.8ml;酚红应完全溶解,置于100ml量杯中,最后加双蒸水至100ml)。将酚红液与葡萄糖等混合液混合,加双蒸溜水至1000ml,加入2ml氯仿防腐,保存于5。 按下列方法配成汉克斯氏液:原液甲1份,原液乙1份,双蒸溜水18份,此液在5下可存1个月。使用前以1.4%NaHCO3(9磅10min灭菌过),无菌操作,校正pH到7.4(依需要定),大约每20ml的Hanks液加0.5ml的NaHCO3可达pH7.4,此时颜色为黄红色。,(五)补体结合试验 可溶性抗原,如蛋白质、多糖、类脂类、病毒等,与相应抗体结合后,其抗原抗体复合物可结合补体(是球蛋白,主要是r球蛋白),但这一反应肉眼无法观察到,而通过加入溶血系统作指示系统,包括绵羊红细胞、溶血素和补体,通过观察是否出现溶血,来判断反应系统是否存在相应的抗原抗体,该过程称补体结合试验。参与补体结合的抗体称补体结合抗体。 注意在预备试验及正式试验中,均需已知的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清供滴定补体、滴定抗原或作对照用。,(六)病毒中和试验 中和试验在家禽病毒病的诊断工作中,常用于用已知病毒来检查未知血清,也可用已知血清来鉴定未知病毒,还可用于中和抗体的效价测定,其原理：病毒(抗原)与相应的抗体中和以后,可知病毒丧失感染力,该反应具有高度的种、型特异性,而且一定量的病毒必须有相应量的中和抗体才能被中和。,(七)免疫标记技术 利用某些能够通过某种理化因素易于检测的物质标记抗体,这些被标记的抗体与相应的抗原相结合,通过对标记物的测定,从而确定抗原的存在部分和定量。该技术目前广泛应用的主要有：免疫荧光技术、同位素标记技术(即放免沉淀)和免疫酶标技术(包括ELISA)等等。,二、病原学检查 1.病料的采集 应从发病早期比较典型的病例中采集,通常在有显著病变的不同器官和不同部位采取,如发生AI时的气管粘膜、肺、脑等组织,高热期的血液。,2.病料的涂(抹)片镜检 用有显著病变的不同器官、不同部位涂(抹)数片,固定染色后镜检。可对具有特征形态的病原微生物或虫卵作出诊断。,3.病料的处理 每克组织中加入510ml灭菌生理盐水研磨(若为病毒性病料,可于每ml研磨液中加青、链霉素各1000IU),之后于4下作用24h,或37下作用1h,然后以1500转/min离心15min,取上清液作为接种、培养材料。,4.病原的培养和鉴定 细菌、真菌、螺旋体等可用人工培养基培养。而病毒由于没有完整的酶系统,不能在无生命的培养基中生长,可用禽胚、动物或组织进行培养。病原培养后,根据其形态学特征、培养特性、动物接种试验及免疫血清学试验等方法作出鉴定。,5.动物接种试验 选择对该种传染病病原体最敏感的SPF动物进行人工感染试验。将病料用适当的方法进行人工接种,然后根据对不同动物的致病力、发病后的症状和病理变化特点来诊断。,家禽寄生虫病的诊断 诊断方法有：流行病学、临床症状、剖检变化、实验室检查等。要确诊必须找到病原。如虫体、卵囊、虫卵、或虫体片段等。,一、蠕虫病的诊断 1.虫体检查： 大的虫体可直接用肉眼在粪便中观察,较小的虫体,可用水洗沉淀法检查：将粪便少许置于一大平皿内,加适量水并搅拌均匀,静置5分钟,虫体将下沉(密度较大),将上层粪渣弃去。反复34次,每次沉淀5分钟,在最后的含虫体的粪渣中查找虫体,较小的虫体也可涂片镜检。,2.虫卵检查 (1)水沉淀法 用于吸虫虫卵(密度大)。取约5g粪便置于100ml大小的烧杯内,加10倍量的水,用玻棒搅拌均匀后,用双层纱布过滤到另一烧杯内,再倒入试管内,将滤液静置约15min,弃去上清液,保留沉渣,加水混匀。反复23次。吸取试管底部沉渣,涂片盖上盖片后置于低倍镜下镜检。为节省时间,可将上述滤液注入离心管,于1000转/min下离心2min,弃去上清液,加水混匀,再重复一次,弃去上清液,吸取沉渣镜检。,(2)水漂浮法 用于线虫及绦虫