基因工程的酶学基础课件

1,第二章 基因工程的酶学基础,Enzymes,2,本章节内容,第一节 限制性内切核酸酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链核酸内切酶,3,本章学习内容,重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。,4,DNA 重组技术的基本工具,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀” 限制酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,5,细菌,供体细胞,取出质粒,取出DNA,用限制酶切断DNA,用连接酶连接目的基因,将重组DNA导入受体细胞,扩增,基因工程图解,8,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,9,2. 性质,内切酶,主要来源于原核生物,即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5-P和3-OH末端,自我保护作用,3. 功能,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,1. 来源,10,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机 制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会 利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的 安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切 割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的 目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,11,12,13,14,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。,（1）限制（Restriction）,15,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）, Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase),GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基, Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase),CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,16,17,（3）限制与修饰系统相关的三个基因, hsd R: 编码限制性内切酶, hsd M: 编码限制性甲基化酶, hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达,这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断,这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。,作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。,18,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,二、限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示,19,2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。,如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒,20,3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中发现的第二个酶,4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。,如 R.Hind 表示限制性内切酶 M.Hind 表示相应的甲基化酶 实际应用中，R常被省略。,21, 型限制性内切酶,目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种：,三、限制性内切酶的类型, 型限制性内切酶, 型限制性内切酶,22,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,1. 型限制性内切酶的基本特性,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,23,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）,（3）辅助因子,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,24,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。 与DNA的来源无关，即没有种的特异性。,2. 类限制性内切酶的基本特性,分离的第一个酶是Hind 基因工程用途最大,25,稀有切割限制酶（rare cutter）,可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。 如Not I （GCGGCCGC）,某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。 如Hind 可识别4种核苷酸序列： Y: C或T R: A 或G,GTYRAC,-3,5-,26,（2）切割位点,切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处,27,27,仔细观察各限制酶 识别的特定序列有何 特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列,28,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,29,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,30,平末端 平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,31,基因的针线：DNA连接酶,32,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,1 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,） 5端凸出（如EcoR I切点）,33,CTGCAG,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,） 3端凸出（如Pst I切点）,34,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易得多。,2 粘性末端的意义, 连接便利,35,36,B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。,A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。, 末端标记, 补平成平齐末端,37,3 平齐末端（blunt end）,在识别序列的对称轴上同时切割,5-,GATATC,-3,3-,-5,CTATAG,如EcoR V,38,4 平齐末端的特点,连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。,粘性末端与平齐末端连接的处理方法,）添补法： 利用DNA聚合酶 (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。,39,）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端,40,不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。,识别位点和切点完全相同 如Hind 和Hsu I,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,5 同裂酶（Isoschizomer), 完全同裂酶：,41,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。, 不完全同裂酶：,42,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,6 同尾酶(Isocaudamers）,43,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,44,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,7 限制酶的酶活性, 星号（*）活性,45,EcoR I和BamH I等都有*活性。,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoR I：,使用的时候要特别注意！,7,46, 诱发星号（*）活性的原因,）高甘油含量 ）内切酶用量过大 ）低离子强度 ）高pH ）含有机溶剂，如乙醇 ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在,酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件,47,在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。,移动切割（shifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,8s型限制性内切酶,48,（3）型限制性内切酶不具有甲基化功能,型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。 它们识别相同的DNA序列，但功能不同。 如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶,前者：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 后者：5-GAA*TTC-3 3-CTT*AAG-5,作用的位点也不相同,49,（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割,定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低,如：Hha切割单链DNA比 切割双链DNA效率低50,50,3. 类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,51,核酸限制性内切酶的类型及主要特性,52,53,四、限制性内切酶酶解反应条件,1. 标准酶解体系的建立,一个单位（U）的限制性内切酶定义： 在合适的温度和缓冲液中，在20l的反应体系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。,推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间,54,2. 酶解过程,配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定,55, 酶解体系,一般20l，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。,加样顺序一般是：,ddH2O buffer DNA 酶,56,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,57, 混匀,移液枪吹打或手指轻弹管壁,若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。,混匀后微量高速离心机进行短 暂离心，使管壁液体全部下沉。,58,反应终止,三种方法：,）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS） 至终浓度0.1%(W/V),）65加热20min或者70加热10min,）酚/氯仿抽提,59, 酶解结果鉴定,快速进行微型琼脂糖凝胶电泳 观察 然后决定是否终止反应,60,酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带,酶存在“星号”活性，造成非特异性切割； 不正确的操作，导致其它内切酶污染； 底物DNA中可能存在其它DNA污染。,电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常,底物DNA不纯； 内切酶不纯； 酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常,61,3. 限制性内切酶对DNA分子的消化,1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,CTTAAG,GAATTC,（1）内切酶与识别序列的结合模式,62,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开,1,2,3,4,1,2,3,4,（2） 完全消化,63,只有有限数量的酶切位点被切开,通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。,1,2,3,4,1,4,（3） 局部消化,64,（4） 几种常用限制酶识别位点,65,66,（5）限制性内切酶识别序列的交叉列表,67,68,69,70,71,72,73,74,75,4. 限制性内切酶酶解反应中的注意事项, 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液,1U的酶液足以在1h内消化10g DNA，酶和底物比例2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度, 浓缩液使用前可用1限制酶缓冲液稀释, 限制性内切酶在含50%的甘油的缓冲液 中，于-20稳定保存,76, 酶分装成小份，避免反复冻融, 反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低, 通常增加反应时间，可降低酶量,77,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1. DNA的纯度,五、影响限制性内切酶活性的因素,纯化DNA 加大酶的用量，1ugDNA用10U酶 延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）,一般采取,78,需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。,79,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2. DNA的甲基化程度,DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam) （修饰GATC中的A）； DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,80,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。,3. 温度,81,是影响限制酶活性的重要因素,4. 缓冲液(Buffer),（1）缓冲液的化学组成,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl： 维持pH,大多数为7-7.6 二硫苏糖醇（DTT）： 防止酶氧化,保持酶稳定性 牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低 浓度的蛋白质溶液中变性,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液,82,（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品, 在相同的缓冲液中反应同时进行, 若需要不同的缓冲液,采用3种方法,)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节 离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）； )先用一种酶切割,然后用2.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物, 再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割； )使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸钾 buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。,83,练习题,何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点 什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？ 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【 】 修复自身的遗传缺陷 促进自身的基因重组 强化自身的核酸代谢 提高自身的防御能力 补充自身的核苷酸消耗,84,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,第二节 DNA 连接酶,一、DNA连接酶（ligase)的发现,DNA复制一定有断口,85,DNA连接酶:,一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶,1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。,86,（1）大肠杆菌连接酶,1. 两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶,只能连接粘性末端，背景低，准确性高,二、DNA ligase的特点,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端,87,（1）必须是两条双链DNA,（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,2. 连接条件,88,（4）DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50 - 100 mM，pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 ， 4 - 16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。,89,1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。,三、连接反应的机理,2. AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi （NMN） 。,3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,90,4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一 条链的5端 P 上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,91,5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。,92,如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端 ？,93,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,94,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,95,连接酶反应的最佳温度是37C。,四、连接反应的温度,1. 最佳温度,但在37下粘性末端的结合很不稳定。,2. 实用温度,所以一般采用 416C,96,增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。,1. DNA末端的浓度,五、影响连接反应的因素,1020倍,2. 插入片段与载体的浓度比例,两种构型：线状分子和环状分子,与DNA浓度及DNA分子长度相关,97,3. 反应温度,黏性末端：1216 平头末端：1020,4. ATP浓度,一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.,ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接 ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。,98,六、DNA连接的反应体系,酶切纯化后的DNA片断 连接缓冲液 DNA连接酶,99,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。,七、平头双链DNA片段的连接操作,100,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,提高平头末端连接效率的方法包括：,101,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,102,核苷酸分子的连接：,DNA聚合酶连接单链DNA 把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上,103,第三节 DNA聚合酶,DNA聚合酶（DNA polymerase),能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3OH末端，催化核苷酸的聚合作用.,104,一、基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 7.Taq DNA聚合酶,105,A A T T G,C,DNA聚合酶的作用,返回,106,1. 共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3OH端,2. 主要区别,T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。,其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,二、常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,107,3. 常用DNA聚合酶的特性比较,108,三、DNA聚合酶在基因工程中的用途,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 ,主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。,（1）大肠杆菌DNA聚合酶的性质,一条单链多肽,53外切酶活性位于N端,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分,就成为Klenow fragment。,109, 底物：,dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）, Mg2+, 带有3-OH游离端的引物, DNA模板,（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,110,标记, 核酸探针（probe）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。,（3）用DNA聚合酶制备探针,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,111,标记,已知序列的核酸片断, 探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,112, DNA聚合酶I 对探针序列的标记,切口平移法(nick translation )：,放射性同位素标记：,当存在dNTP时，DNA聚合酶 I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性。,113,53外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,缺口,缺口,5,5,3,3,5,3,5,3,114,纯化的DNA片断,DNase I制造单链缺口,DNA Pol I进行切口转移,一种-32P-dNTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,从头至尾都被标记,115,2. Klenow fragment,具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenow fragment的性质,DNA Pol I Klenow fragment (76KD）,枯草杆菌蛋白酶,116, 3端补平,5,5,klenow, DNA 3末端标记,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,klenow,（2）主要用途,117,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25oC 1h,118, cDNA第二链的合成,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,119,（1） T4 DNA聚合酶的性质,3. T4 DNA聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。,有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。, 来源, 酶活性,120, 特点,A 当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。,B 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。 C 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。,121,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,122,（2） T4 DNA聚合酶的用途,标记末端（取代合成法或置换合成法）,用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。 再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。, 补平隐蔽末端, DNA 3末端标记,123,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶（35外切）,DNA酶切片断,T4 DNA聚合酶（53聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无dNTPs,124,a. 放射性标记的优缺点：,制作简单 高比放射性 放射自显影效果好,优点：,缺点：,半衰期短（32P只有14.3天） 不易保存 对人体有害 要求在专门实验室操作,125,b. 非放射性标记,i）生物素标记,生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R,可以与dNTP酰化结合成为biotin -1,6-dUTP、 biotin -1,4-dATP、 biotin -1,1-dUTP等。,CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH,也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。,126,纯化的DNA片断,DNase I 制造单链缺口,DNA Pol I 进行缺口转移,biotin -dTTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,生物素-dTTP,生物素-dTTP,利用切口转移法将生物素掺入DNA探针中,127,ii）地高辛标记：,可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程，形成地高辛标记的DNA探针。,生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。,地高辛的结合物是抗地高辛抗体。,128,4. T7 DNA聚合酶,（1）来源,从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：, T7噬菌体基因5编码的大亚基：,T7噬菌体5蛋白。 有53聚合酶和35外切酶活性。, 大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。,129,（2）T7 DNA聚合酶的特点, 持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。, 35外切酶活性高,单链和双链都能降解。, 不受DNA二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍,130, 进行末端标记, 催化大分子量DNA为模板的合成,如M13噬菌体, 补平隐蔽末端,（3）T7 DNA聚合酶的用途,合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。,131,5. 修饰后的T7 DNA聚合酶,（1）T7DNA聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。,（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途, DNA测序,双脱氧法。, 标记DNA 3隐蔽末端, 更有效地补平末端,132,6. 逆转录酶,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：,依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,（1）来源,RNA肿瘤病毒。,（2）AMV的性质,由和两条多肽链组成，最适反应温度为4145,133, 链,有反转录活性和 RNaseH活性。,RNaseH： 以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。,RNaseH,RNA DNA,RNA DNA,134,（3）逆转录酶的用途, 链,RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。, 合成cDNA,以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,135, 合成DNA探针,用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。,随机引物：,随机顺序形成的寡聚DNA片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,136,第四节 DNA修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶,1. 来源,小牛胸腺。,2. 组成,大小两个亚基。,3. 特性,53DNA聚合酶活性,（terminal transferase）,137, 不需要模板！, 需要3OH、二甲胂酸缓冲液。, 底物可以是单链DNA、是3OH突出的双链DNA、平末端需Co2+激活，但反应效率低。, 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。,DNA 5,3,TTT,dTTP ，末端转移酶,138,4. 末端转移酶的用途,（1）同聚物加尾,给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。,外源DNA,载体DNA,5,3,5,3,CCC,CCC,GGG,GGG,dGTP,dCTP,末端转移酶,139,（2）再生酶切位点,便于回收克隆片断。,AAGCTT TTCGAA,5,5,Hind酶切,A TTCGA,AGCTT A,Klenow补平,140,AAGCT TTCGA,AGCTT TCGAA,AAGCATTT TTCGA,AGCTT TTTTCGAA,末端转移酶,dTTP,AAA,AAA,外源DNA,141,（3）DNA3OH末端标记,AAGCTTTT TTCGA,AGCTT TTTTCGAA,AAA,AAA,Hind位点,Hind位点,连接,催化非放射性或放射性标记物掺入DNA片断的3端。 （生物素-11-dUTP等）,142,二、T4多核苷酸激酶,1. 来源,T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2. 功能,其激酶活性位于N端附近，磷酸酶活性位于C端附近。 催化-磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。不论5-OH端突出与否。,143,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,ATP,T4多核苷酸激酶,如果ATP的-磷酸带有32P标记，就可见被转移到DNA的5端。,但天然的DNA的5端都是磷酸化的。,144,3. 多核苷酸激酶的用途,DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（1）正向反应（forward reaction）,145,（2）交换反应标记法,反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸交换。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(-32P)ATP、ADP,多核苷酸激酶,反应效果不理想。,146,三、碱性磷酸酶,1. 碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来。,Bacterial alkaline phosphatase，BAP,（1）细菌性碱性磷酸酶,（2）小牛肠碱性磷酸酶,Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS中加热68oC可完全失活。,147,2. 碱性磷酸酶的特性,催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3. 碱性磷酸酶的功能,（1）防止线性化的载体份子自我连接,148,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT TTCGAA,Hind酶切,A-OH TTCGA-P,P-AGCTT HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,149,A-OH TTCGA-OH,HO-AGCTT HO-A,OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,同一酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。,150,A TTCGA,AGCTT A,AGCTT,A,A,TTCGA,连接酶,-OH与-OH连不住,其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。,3,P-AGCTT,A-OH,5,3,HO-A,TTCGA-P,5,外源DNA,151,第五节 核酸外切酶（ Exonucleases）,是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。,一、单链DNA外切酶,1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）,53外切,识别5-OH,2. 大肠杆菌核酸外切酶（exo ）,53、35外切,识别3-OH、5-P,152,二、双链DNA外切酶,1. 核酸外切酶（exo ）,35外切,识别3-OH,主要用途：,在DNA双链的末端产生出单链区域。,5,5,5,5,exo ,与klenow配合进行3端标记,-OH,HO-,153,2. 核酸外切酶（ exo）,53外切。,主要用途：,使DNA双链变成单链（短）。,5 P-,-P 5,5,5, exo,成为测序模板。,识别5-P（但不能降解5-OH）,154,3. T7基因6核酸外切酶,53外切。,用途与 exo一样。,既能识别5-P，又能识别5-OH。,5,5,5,5,已被克隆到大肠杆菌中表达。,155,156,第六节 单链DNA内切酶,一、S1核酸酶,1. 来源,稻谷曲霉（