《细胞的破碎》PPT课件.ppt

细胞破碎技术,第二章,细胞破碎技术,第一节 细胞壁的结构与组成 第二节 细胞壁的破碎 第三节 包涵体,第一节 细胞壁的结构与组成,细胞壁是微生物菌体比较复杂的结构。不仅取决于微生物的类型，还取决于培养发酵液的组成、细胞所处的生长阶段、细胞的存储方式以及其它一些因素。不同微生物菌体细胞壁的结构有一定差异。 一、细菌 细菌的细胞壁坚韧而有弹性，由不同的肽链结合组成质量均匀的网状结构，其厚度因细菌不同而有差异，可抵御外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。,第一节 细胞壁的结构与组成,细胞壁的主要成份是肽聚糖，由N乙酰葡糖胺（见图2-1a）和N乙酰胞壁酸（见图2-1b）构成双糖单元，以（1-4）糖苷键连接成大分子。N乙酰胞壁酸分子上四肽侧链，相邻葡聚糖纤维之间的短肽通过肽桥或肽键连接起来，组成机械性很强的网状结构，像胶合板一样，粘合成多层。各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同，但在四肽侧链的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。 革兰氏阳性菌细胞壁（见图2-2）较厚，约2080nm。含1550层肽聚糖片层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。,第一节 细胞壁的结构与组成,图2-1 细菌细胞壁的主要组分,第一节 细胞壁的结构与组成,革兰氏阴性菌细胞壁（见图2-3）细胞壁较薄，有12层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类和蛋白质等在稳定细胞结构上非常重要，如果被抽提，细胞壁将变得很不牢固。,第一节 细胞壁的结构与组成,二、真菌和酵母 真菌的细胞壁含有几丁质（N-乙酰葡萄糖胺的一种聚合物）纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外还有蛋白质、类脂、无机盐等。而酵母的细胞壁（见图2-4）由特殊的纤丝状物质构成，主要成份是甘露聚糖（31%），葡聚糖（29%），蛋白质（13%）和类脂质（8.5%）。酵母中的葡聚糖的为 -1，6-葡聚糖通过-1，3键与D-葡萄糖中第一侧链交连而不溶于水。 所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕成一股又粗又壮的链，嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子的多糖基质中，看起来像钢筋混凝土，从而解释了真菌细胞壁的机械强度和硬度。,第一节 细胞壁的结构与组成,三、藻类 藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类物质。,M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠,图2-4 酵母细胞壁的结构示意图,第二节 细胞壁的破碎,细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械法中的球磨机和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。其它的方法大多尚停留在实验室应用，工业化的应用还在探索之中。 一、球磨法 球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式（见图2-5）或卧式（见图2-6）两种，在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。,第二节 细胞壁的破碎,图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨 图2-6 Netzsh LM20砂磨机,第二节 细胞壁的破碎,破碎作用遵循一级动力学定律： （2-1）,式中 Rt时间内释放的蛋白质数量（mg/g）； Rm100%破碎细胞释放的蛋白质数量（mg/g）。 k破碎的比速率，s-1； t球磨机工作的时间，s。,第二节 细胞壁的破碎,将上式由开始工作到t时刻积分，可得：,（2-2）,式中 x为R/Rm，t时刻释放蛋白质的分数，x数值越大，表示破碎程度越高。 一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞的百分数。,第二节 细胞壁的破碎,式中 N0原始细胞数量； N经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数量。 N0和N可由直接计数法和间接法求得。 直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计数法进行计数。 间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质含量或酶的活性进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量R与所有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。,（2-3）,第二节 细胞壁的破碎,破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。 在用球磨法破碎细胞的过程中，影响因素有以下几个方面： （1）搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加，剪切力增大，细胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的热量产生和磨球的磨损以及因剪切力引起产物失活，因此对于给定处理量和对蛋白质的释放要求下，存在着最佳效率点。实际生产中，搅拌器外缘速率控制在（515）m/s之间。,第二节 细胞壁的破碎,（2）细胞的浓度 在细胞破碎过程中，产生的热量随浓度的增大而提高，增加了冷却的费用。因此最佳的细胞浓度由实验来确定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时，细胞浓度控制在40%左右。 （3）球粒大小和装填量 磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的研磨机中，球径为0.2mm较好；而工业化规模操作中，球径 0.4mm。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控制在80%90%之间，并随球粒直径大小而变化。,第二节 细胞壁的破碎,（4）温度 操作温度控制在540范围内对破碎物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨室温度，在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过冷却剂来调节磨室的温度。 （5）流量 高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎程度和释放蛋白质的产量。 （6）微生物特性 一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细胞的机械强度比酵母要高。一台20L球磨机在最适条件下，每小时可加工200kg面包酵母，而在同样条件下，处理细菌细胞仅为1020kg。,第二节 细胞壁的破碎,二、高压匀浆法 高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进料速度的针形阀（见图2-7）。当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服从一级反应定律。,（2-4）,第二节 细胞壁的破碎,式中R为蛋白质释放量；Rm为蛋白质最大释放量；N为悬浮液通过匀浆器的次数；P为操作压力；k为与温度有关的速度常数；指数d值对于有机体是抵抗破碎能力的一种量度，不同的有机体其值不同，如酿酒酵母d=2.9，大肠杆菌d=2.21。 在高压匀浆机操作中，主要影响因素有：,图2-7 高压匀浆机的排出阀装置图,第二节 细胞壁的破碎,（1）温度 破碎率随着温度的升高而增加。当悬浮液中酵母浓度（450750）kg/m3，操作温度由5提高到30时，破碎率约提高1.5倍。但是高温破碎只适用于非热变性产物，如果温度高于40时，蛋白质在破碎过程中会发生变性。因此，进口处用干冰来调节温度，使出口处的温度维持在20左右。 （2）压力 操作压力的合理选择非常重要。提高压力需增加消耗，压力每升高100Mpa会多消耗3.5KW能量；压力每升高10Mpa，温度将提高2；另外压力过高将引起高压匀浆机排出阀座剧烈磨损。通常非结合的酶，操作压力为5.45107Pa，菌体浓度10%20%（质量分数），处理一次即可。在操作压力为55Mpa的条件下，通过6次匀浆假丝酵母得到30%可利用蛋白质。 一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。,第二节 细胞壁的破碎,三、超声破碎法 超声破碎法是另一种液相剪切破碎法。其实验室装置见图2-8 。,图2-8 连续破碎池的结构简图,第二节 细胞壁的破碎,当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。在超声波破碎过程中，蛋白质释放遵循一级反应定律：,（2-5）,式中 x为释放蛋白质的分率； k为蛋白质释放常数,min-1； t为超声波发射时间，min。 蛋白质释放常数k取决于输入声能，由实验确定。对于从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液)，用190声瓦的20HZ声频的超声波处理时： k=b(P-P0)0.9 （2-6）,第二节 细胞壁的破碎,式中 b为常数； P为输入功率，J/(kg.s)； P0为由超声波引起的空穴的临界功率，J/(kg.s)。 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量，当产生的气泡破裂时，绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收，为避免高温，在破碎池中设计了冷却水夹套，并在开始时先把悬浮液冷却至05，并不断将冷却液连续通过夹套，短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作，以防止高温使蛋白质变性。 为提高破碎效率，在破碎池中可添加细小的球粒（可以是钢制的或玻璃的），以产生“研磨”效应，提高细胞破碎率。 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法，由于向大量的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难，因此在工业还未采用。,第二节 细胞壁的破碎,四、酶溶法 酶溶法是利用细胞壁水解酶使细胞壁溶解，释放出胞内物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。 细胞壁溶解酶有内-N-乙酰壁酰胺酶和内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，水解N-乙酰壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1,4键；N-乙酰壁酸-L-丙氨酸酰胺酶系切开肽聚糖与肽之间结合点的酶，又称自溶素，在微生物细胞的自溶上起着重要的作用。酞酶切开肽聚糖中肽段部分的肽键，单独存在时有一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存时有明显可促进真菌细胞壁的溶解。针对细菌细胞壁的结构和组成，使用酶溶解细菌细胞壁时，通常选用两种以上的酶协同作用，使溶解作用增强。,第二节 细胞壁的破碎,酵母细胞壁溶解酶主要成份是-1,3葡聚糖酶，当它与磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同时作用时，对溶解酵母的作用显著增强。而-1,3葡聚糖酶与甲壳质酶协同作用时可溶解由甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。 酶溶法的优点有：对设备的要求低，能耗小；抽提的速率和收率高；产品的完整性好；对pH值和温度等外界条件要求低；由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。但是酶溶法受酶的费用限制。,第二节 细胞壁的破碎,五、化学渗透法 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法称为化学渗透法。例如在发酵液中添加酸碱、脂溶性有机溶剂（甲苯、丁醇、丙酮、氯仿等）和某些表面活性剂，改变菌体细胞壁或膜的通透性，使细胞壁破裂，使胞内物质释放出来。 酸碱用来调节溶液的pH值，改变细胞所处的环境，从而改变两性产物蛋白质的电荷性质，使蛋白质和蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而溶解到液相中去，便于后面的提取。 有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把胞内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂。,第二节 细胞壁的破碎,表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界面上定向并改变界面的性质的某些有机化合物。表面活性剂分子中间同时具有憎水基团和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达到一定时，它的分子会产生聚集生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。憎水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，使膜的通透性改变或使细胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水相中。此法特别适用于膜结合蛋白酶的溶解。表面活性剂按分子结构中带电性的特征可分为：阴离子型（如直链烷基苯磺酸盐），亲水基团带有负电荷；非离子型，如碳原子数在12以上的高碳脂肪醇，在分子中没有带电荷的基团，其水溶性来自于分子中所具有的聚氧乙烯醚基和端点羟基；阳离子表面活性剂，亲水基团带有正电荷；两性表面活性剂，在水中同时具有可溶于水中的正电性和负电性基团。一般来说，使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些。,第二节 细胞壁的破碎,六、其它方法 除上述各种方法外，常用的方法还有以下几种。 （1）反复冻融法 将待破碎细胞在15至20条件下冷冻，然后在室温下融化，冷冻时膜的疏水键被破碎而疏水性增强，胞内水形成冰晶粒而使细胞内盐分浓度加大，反复冻融多次，使细胞破裂将胞内物质释放出来。 （2）干燥法 将待破碎细胞用不同方法进行干燥，菌体细胞失水，细胞内盐分浓度增大，细胞渗透性发生变化，然后用丙酮，乙醇或缓冲溶液等溶剂抽提胞内物质。干燥的方法有空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。对不稳定生化物质进行干燥时，常加入半胱胺酸，巯基乙醇和亚硫酸钠等还原剂进行保护。,第二节 细胞壁的破碎,（3）渗透压冲击法 将两种不同成分或不同浓度的溶液，中间用半透膜隔开，则两种溶液因性质不同可由一方向另一方渗透，这种现象叫渗透现象，其推动力是渗透压。菌体细胞膜是天然半透膜，把待破碎细胞经一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，在高渗压溶液中细胞脱水，细胞质变稠，发生质壁分离。然后转入低渗透压溶液中或缓冲溶液中，细胞快速吸水膨胀而破裂，使胞内物释放到溶液中。用此法处理大肠杆菌时，可使磷酸脂酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等释放至溶液中。蛋白质释放量一般为菌体蛋白总量的4%7%。但此法对革兰氏阳性菌不适用。,第二节 细胞壁的破碎,（4）冷热交替法 将待破碎细胞在90维持数分钟，立即放入冰水浴使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。 无论是运用机械法还是非机械法都要既能破坏微生物菌体的细胞壁，又要得到不发生变性的蛋白产物。因此，选择合理的破碎方法非常重要，通常选择破碎方法遵循以下一般原则： 提取的产物在细胞质内，选用机械破碎法； 在细胞膜附近则可用温和的非机械法； 提取的产物与细胞壁或膜相结合时，可采用机械法和化学法相结合的方法，以促进产物溶解度的提高或缓和操作条件； 为提高破碎率，可采用机械法和非机械法相结合的方法。如面包酵母的破碎，可先用细胞壁溶解酶予处理，然后用高压匀浆机在95Mpa压力下匀浆四次，总破碎率可接近100%，而单独用高压匀浆机破碎率只有32%。,第三节 包涵体,利用DNA重组技术，把重组体DNA引入宿主细胞，使其在细胞内表达，便可得到一定的蛋白质。目前已成功的利用大肠杆菌发酵生产胰岛素，人的生长激素，人胸腺激素1，、干扰素，牛生长激素，乙型肝炎病毒抗原和口啼疫病毒抗原等。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成。所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。这些目标产物蛋白在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物活性。在利用大肠杆菌生产蛋白的过程中，重组蛋白大多数情况是以包涵体形式存在。要从包涵体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞细胞破碎离心分离包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性。,第三节 包涵体,一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面： 重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来； 由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小； 与重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体； 重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀； 与重组蛋白的本身的溶解性有关； 在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。,第三节 包涵体,由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此可选择破碎细胞的方法，得到包涵体。例如人干扰素的提取中，先把发酵液冷却至10以下，离心（4000r/min）分离，除去上层清液，得到菌体，将细胞悬浮于10倍体积PBS缓冲溶液中，于冰浴下进行超声破碎，反复5次，每次5s，离心（4000r/min）分离后，用0.1%TritonX-100的溶液充分搅拌均匀，进行洗涤。洗涤三次后，离心（10000r/min20分钟），可得到包涵体。细胞破碎后离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如TritonX-100）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。,第三节 包涵体,二、包涵体的变性溶解 包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDS）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pH9.0的碱溶液或盐酸胍等。 十二烷基磺酸钠（SDS）是曾经广泛使用的变性剂。它可在低浓度下溶解包涵体，主要是破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。但是结合在蛋白质上的SDS分子难以除去。一般SDS的使用浓度为1%2%（w/v）。,第三节 包涵体,尿素和盐酸胍可打断包