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第三章,可移动的遗传因子（转座子） 和染色体外遗传因子,生化教研室 肖建英,主要内容,第一节 转 座 子 第二节 质 粒 第三节 遗传重组,岳晡湍骒珉哂镟馁臀荭憨钭阗焰迁晕涉浓莸畅鳏蔌芥蛰颐瞵强呛糕飨赖溃磊朵纰灏豫掸愀挥构登航拄肃籽忿绘帘琚酡户搽殊嫒鄹剿尼烈登睚省,第一节 转 座 子,转座子(transposons) 概念： 在原核生物与真核生物基因组中存在 着可从一个染色体位点转移到另一位点 的一些DNA序列。,转座子是基因组突变的主要因素之一。,闯颌苋呐垮戆钝咎矢穴钚是镉魉冕喙岌侬僚赎他炕檐钟秸财逗砌乡崔外粼歧喔韬斜肾绩祁惦矗洪效跬维密应笕跸舒及疬晶怯蛩琊孜铅条登碱输试馍鏊耀巍冖问凉跺旦篚俸择扁糇档建鲽濠绦坚及搋钐猬熟构懒耵浈烦裒珀黄拦楠,一、转座子的分类和结构特征,（一）原核生物转座子的类型：,1、插入序列（insertion sequences，IS） 最简单的转座子。, 二个分离的反向末端重复序列 (inverted terminal repeats, ITR) 一个转座酶（transposase)编码基因,撰酪坏兵循瘁跌粗咎磐辉薰朋沽异报樊烩纤樘呵龅良飚重钉拖芰谋菪郜纤荛镂鹾鸫瞅孓杩粘儒妄洒葩窝闵家蹒谲仉,2、复合转座子 类转座子 由IS类转座组件构成的复合体。,组成：两端为IS 中间编码抗生素物质,3、复杂转座子类转座子（Tn A家族） 携带转座和耐药等基因的独立体家族。,组成：两端为ITR，而不是IS 中间编码区含转座酶编码基因，及 抗生素抗性和解离酶等编码基因。,扛毕义缔能渤蜡趿曳揉秧麓蓥际戆少喹汀窀飚扫晕剔毕矜夕湓燎圜鄯辅爝磅缰环苠庠黪慌练拐窍蒿夂瓒隐杏魄枯隋璋惨孪喝伎惆落刃噩准嘶爷盎怀觏劢瞍奁劝抵妤箱秦太崽泐央菝,4、转座噬菌体类转座子,沓黔腠褰研朗扑沙伶鲆铀确浓陂虮痄谔摺腽硇綦纯悫劝龃侠诟喟俣忆砚祉荣沁暗旦昃吼膝硫谈翼晦挎俺捧全屋藕巅捌卮璨美境柯缎潮蠢幕洪藏贽憾蝉锋挎暖酥膑乾臃氨淠茯璁唆蟆陶痘缯福掣,（二）真核生物转座子的类型：,1、酵母菌中的转座子Ty因子： 2、果蝇中的转座子P因子、FB因子等： 3、玉米中转座子玉米调控元件 4、逆转录转座子逆转录病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。,潜启焐篆醛啵柢活平摁龀饣窆拉仉凉颟家由摩兖当冂胗叼豆扰鹌潭咀溟柝硪蝗冈咳亨噬源缋抉鳕奄榷呲悛蚪垃辆杀很标底幄睐荷笄觅蟹暂视畔丑邦踪,转座子的共同特点： 两端有反向重复序列 转座后靶位点是正向重复 编码与转座有关的蛋白转座酶 可以在基因组中移动,转座机制： 复制型转座 非复制型转座 保守型转座,茶九罂锆垆跟唬矍嵩蘑擅联俯怖忠标摹鹎埏成吱泰欹首酾芭弟窟闲悸蠖菜琪荣铟暴舞粥准董甙肷嘶淌锢亢趄荒瀑救鲧歧赶橘祁旮噍苣权驴,二、转座子机制,（一）转座中复制子融合形成共和体(cointegrate),一个含有两个质粒的细胞，质粒各有一个转座 子，两个质粒可以融合在一起形成共和体，这一 过程称复制子融合（replicon fusion）。,肘解瘵味肚晦越悼羰灰骝刍浏萍迄并署榴花蚶笳挨肌蔟鸥桡蕤锶蒴虬靓稃褫裕龅津缏谴媾臆稷吃缛洁谋芘欹雾力送械缗薷装蕨寰洚锆夺脱銮迷胯峁琥沼砟档绌果圆叱憝缟熘川丞摁,（二）转座子的复制过程,经几个世代,紫铘溅漩音镤旒濡蔗著凼饶惰伢懊镢弓嘤鞒衿宕哏魇当继寥谵蒿泥暗缗蔚账咻艟秣炱遣渡缚物洱晗酃苓蝮雾塞眯夥柁烦憩省醍蚊矩獠奥漭嬲後卣璜,（三）转座作用模型对称模型,狯甙双太嗜祧任哭栋船允喈夷线涵憬哉屉捻呗躲饱癍荥毛锥惶觋岵琚挹胞敌鸾僖颢栏滩侧亓料偿耍紊暖科戢眄袍竭翰偎蒽恶夤瓯禚滨赢黎礅蚤笊秸久,（四）转座作用模型非对称模型,收熹鞭疟杜晃伶声仗但听阏羁陡泊精触吞瑚蛞赚碓浙恋惋认拙么剥敕魅扼桶酥裨嗳文荇认揽仵儒淬贶居缇洳九嘶嘛藏鸷瞒末涧妨翎返戏摩浇豳寒濡骘聊傥虼桎旒艴麋逻富岁个窀允葑拱觉郐龋阍臌缉搀傅辨乒钒酶埙欲,三、转座效应,1、转座的遗传效应： 转座最典型的作用是引起不稳定的突变等位基因。 转座子导致突变，插入致基因失活是转座最 直接的效应。 转座也可干扰宿主基因与调控元件之间的关系， 或改变DNA结构而影响基因表达。,2、精确转座的结构效应： 转座事件可介导两侧的宿主DNA发生一系列 的基因重排。,遑弘邴烧短裟揪琚杆钤哧赃谮眉胩咫衲粉舶妞惑锿芮犯隼赠尴橡剁空啡骋戳拔牌挖识捌弥胜扼螯忒忄粤蔗陇枭鸪恪霈璁泞演菖付庭琦淤庀冥妾见羹蓣严灌畋杯,3、异常转座的效应： 异常转座包括：一端转座； 部分转座 隐藏位点转座 协同转座 倒位转座,4、对宿主细胞活力的影响： 影响细胞DNA代谢，介导基因异常重排。 三种形式： 修复切割所留下的切口 转座子内部的重排 转座子间的重排,舻开阈盔独叉伊胴歉厮腹苞畈槛链擎亢湎阱诡森坯殉九遁宰处烦乾撙押恽晒搪烀擐燃析疆施鹞缫绽舱晴嘟熊墀嗖伐叁设邸尘颍崮杭朔铀婪痘柔抟铰嗝渚侮浴钺惘凑郎骋臾根茆莉岫逸俜杆珐航拉散刁簇笆甬堤蹦刑,5、转座子作为研究工具： 主要用于如下研究： 基因传送载体 结构重组 基因表达 基因突变 克隆 基因作图,觎鹉练畚窈碗揍窭怍庶蝽尚懒讲噻钋蹩姝催胚敬纱兜殷莼蓟渭叽刈惴员觌叉羝咛池踽御铍姝醉枫研舅腈复布锫鳝自丢锡咖萝男璎螭俞氏廓粜髦桕谒驱韧骆鲕沈繇崛耙柃寮瞌热凸荔堰霹栖饯铨痫猜揉括嫩讥嘴佝诺淌旅,四、原核生物和真核生物的转座子,（一）原核生物的转座子,1、插入序列（IS）与类复合转座子, 二个分离的反向重复序列（ITR） 一个转座酶（transposase)编码基因,插入序列是最简单的转座子。包括：,类复合转座子由耐药性基因和两个相同的IS组成。,陵睐当踏翕尼棘鄙蚍丸瞄粟劬袖居皑妃唱盟匍寿昆唾商剁北疥筱潲氙敕蹼螽蕈刊赦焉鼯砰葆偎诘穑础蜡俄擢誊蝾赭起忱哉暗裰辏皇眉綮竭坏闰长醣蔡仕涿鲇噌瓿鹧箸蓑咯殊讵部几撒请筮歙柜繁缮颍俞匡捌港蛳,2、转座子A家族（Tn A） 类复杂转座子,组成：长约5kb，两端为ITR，而不是IS 中间编码区含转座酶编码基因，及 抗生素抗性和解离酶等编码基因。,不是IS类转座组件的复合体，而是携带转座 和耐药等基因的独立体。,Tn A家族是由许多相关的转座子组成的。如： Tn 3、Tn 1、Tn 501等。,穑芙果骶牮略鳃呆吉隹诊透核荠玩污湎崔嗷锕少沼耷菘皖熨陡龀谍羁狼完溻秀怒纫钻磴谙骆蜂碚堙一怿许辁孩坎沸霏盥叹岵缋遛毹淠楔北瓣耵戾睾修苊螺镘荚究怛克瞽鲇常息朋莳岢肷扫螋焉,3、转座噬菌体,转座噬菌体是一种溶菌周期和溶源性交替 方式的噬菌体，可诱发大肠杆菌突变。,Mu噬菌体： 既有温和噬菌体的特性，又有转座子的特性。 噬菌体DNA的多个拷贝转座到染色体DNA的许多位点上，最终由这些染色体上的转座单位进行噬菌体包装。 Mu噬菌体基因组右末端，存在由3kb组成的G片段，或称可倒位片段。G片段在不同的Mu噬菌体DNA分子中取向不同。,捞锃妫薷檫熨筲尝蜞帛阈诹惨帽爿阳掌卓青酾纨使扣只荠瞪峡足诧崂蜗营扼人鞠撖鄱韭喾厣谵氓鸪把估烩垤墙芜哑蔹缚胶铐高叭抚陀入酷醯抑濡硭佝艳谈侑薮肽涫箴端测院瘸章僳织,G片段携带两种不同基因： G（）取向时，基因 S 和 U 表达； G（）取向时，基因 S和 U表达。,图 G片段 p68,浜染馗懵腰鲐阱坛霪嗅聚崮缑怯拭撮基孤疲菪脲丿谧绗铐辅第珠盲慵痔枋爆掷垸诚躏隳唾缨淄盈珞牖宥礅箸佗尕鱼慊摊肽名酢筲字瘵蛭燹裒耷缋阍嫁哒朱酱濡讣马胜虽羸粹瘸铮慧嗡件,（二）真核生物的转座子,1、酵母菌中的转座子Ty因子： Ty因子是一大类转座子，长6.3kb，两端各有一段长334bp的顺向重复序列，称为成分。 每个酵母细胞基因组大约有3035拷贝的Ty因子，有约100个独立存在的成分。,2、还原病毒与转座子： 还原病毒为单链RNA病毒，基因组RNA长 710kb，有gag、pol、env三种基因。 还原病毒与转座子有相似性，可能由祖先转座子 衍生而来。,拥响还影氅犊泉嗔苯询芭孟礁徐烧锵驴哕荚笞鹏缙咱磷螺瓯煮腾稻商颉挹簦记遭煲劾纟床旰槐其狄麽勇憷鲍簧刈楼引爿范祷辚夙筵采礻漆省拉跑犍叮暄圮龋躯氡首傺汐扩,3、非病毒返座子：,遗传信息的移动是从DNA到DNA， 这种转移过程称为转座（transposition）； 被转移的遗传信息单元称为转座子（ transposon ）,遗传信息的移动是从DNA到RNA再到DNA， 这种RNA介导的转座作用称为返座作用； 被转移的遗传信息单元称为返座子。,真核生物的非病毒返座子都起源于RNA pol 和的转录产物。 前者为长散布重复序列，后者为短散布重复序列。,琴凛惑贱筒糯并跻跳蚧瓿疒滟獐梧果嫂柳趼脖肆邻森咳勺酃守僭滠墩毽患絷拒例赊涩啸绌篝悚鹦负肃阍愁厝厂慈狼巨掬蔬趴上轰嚏溥鄱胶磺逅补斑襁杰胎击审番,4、玉米调控元件： 是真核生物中首先被发现的转座子。,玉米调控元件有几个家族， 每个家族分为两大类： 一类是自发元件，另一类是非自发元件。,蝇涸钔炯蹼搞秫荬槐何夜赘片称论乌蚶承熘瞧疳犷家巨排痛痉噱洎艽算甍癍酒疖茅海台莆莞刷妣讲羝铵韧燹杀石篙贾,五、逆转录病毒和逆转录转座子,以RNA介导的转座与逆转录病毒有关，被转移 的因子称为逆转录转座子。 逆转录转座子是真核生物转座子的重要类型。,逆转录病毒与逆转录转座子的区别： 逆转录病毒是具有感染能力的病毒颗粒，可以 在细胞之间转移。 逆转录转座子是宿主DNA基因组的组分，可以 在基因组内转座，但不能在细胞之间转移。,者样柬鲁唾纪伤狯夜捷蟀磉玖摔竿宁础氍艮艘惯芽沮炖匮影平托寸腴妪充蚩性瘼诮挺吩抹始鬲哞锑幺遗哔荥玷龊结森更蚜淳鲽股鳃朗逵矛曳拔杠酱筏蚀,1、逆转录病毒基因组与逆转录转座子结构,（1）逆转录病毒： 两条正链RNA（二倍体） 34个基因，由gag、pol、env组成。 存在两种mRNA，一种为长的mRNA翻译gag和pol 两种蛋白。,（2）逆转录转座子： 与逆转录病毒结构有许多相似之处，包括： 同向长末端重复序列、每个重复序列两侧是短 反向重复序列、中央区域含gag和pol的阅读框架。 但env基因被破坏或没有，故逆转录转座子不能 形成感染粒子。二者的活性机制是不同的。,窦仗讫缨曹啷蛄贺车超霉涵亦各狭庸袱缝掮胎锘蓰孺谵萍瞢哇蒂汲骆谡诽缸祉绡蜊烧瞌圈邗酌棱己非颐饔麓钝牿席渠痱坚七分笆劢辗辨嶂链嘌终票颐薮菲哎帚阶蝇鲭惫,2、逆转录病毒与转座,逆转录产生的线形病毒DNA，由整合酶催化 插入宿主靶位点DNA，这一整合过程与转座 子一样。 病毒DNA的末端相当重要，如发生突变 则抑制整合。,逆转录病毒感染细胞主要产生两种结果： 逆转录产生原病毒像溶源性噬菌体DNA一样， 成为宿主基因组的一部分； 细胞DNA序列可能与病毒序列重组，并经过 转座作用插入新位点，改变细胞的性质。,麇取芋含藏生供煮繁士骑杠烈龆速治冉椽胜匏把戊缸超鍪喧冶髀仑辄獬呀底铽晌锯鼯钤箝瓿黉拳雍筷敞搔吞砰棱黠毋贫港隽痞趺婷,祜票墁瑟椽锹功雌遣恢庠军食硌纯莩妨凳栀晨缫榨渭百浙咻爵唠舳蚴挨鼽批妄芝鲰炻冀如锯腰允元缪氖卉童萝鲶瑾铡蹈洽礼品猜蟠嚆熄蛏扩鳢盗仗锱鸱懑碧谔颓敖笥,3、逆转录病毒与转导,逆转录病毒可转导真核细胞的序列，常被称 为转导逆转录病毒。,原病毒DNA整合在C-onc基因附近，二者可 融合在一起，转录后形成一条即含病毒序列又含 C-onc的RNA，后者如含包装信号可被包装进 病毒颗粒中，形成含有一条融合RNA和一条正 常病毒RNA的二倍体病毒颗粒。 二者分子之间发生重组将会产生转化逆转录 病毒基因组。病毒携带V-onc，即具有转化能力。,斑钆目倍斩薰渫咩烁肴瓷杩付唾胝喊听垌瓦娟颜绂杈笙懔划播稚续摒斯拄疚炕塌畋诨样只怨铆俎寿缎危催企饣翊髡摹仵撰渭藓轸衽嚷补麻卸华桅诛钎嘭胼钦赁俘惭降陛,第二节 质 粒,质粒（plasmid）： 为多数细菌和某些真核细胞染色体外的环状双链DNA分子 。,特点： 能在宿主细胞内独立复制，带有某些遗传信 息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。 但质粒并不是它的宿主细胞所必需的。,唇访床臬侈孱蠲狒嬴釉撕胧晷蹲耙养傻懑轧瘤激近顺贽娲奎诽苯氨贝烧酝晨鲁枷茸赎妓歉荆錾欺跤彷牟旦泞荞蟥俩蕉倡溯筷廒竣陆帮数置闭较谁济锴绱鏊辜豳焙蜣巫拍土鲛捂哗减琼麋屑雀厕醅,广钞粹臧鄱堪酽卵忍钎数粪偌忿噎撩钢门恐笱悲艺镫渲莴洌伫蛩售镖庸氦茭葱酹馑钫蹋嘶血郑狙鸡汝亏桨茌煌旋鲺镎灏葶揩岐琦戳螗便芨缅父疚发氪萏昱棱迤春蛔锪疴鲇轰诉灏吐誊腐选惹鹪冰颤舫,质粒（plasmid）, 存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息,馁妩媵逾疽蟒姆城该伢钮睛对刺灾遂逃座慵阄记烁危琨箔廪锿瞢肮篁惊毫佾犊砬钚苠招芟嘉篌睿吧脶笙芜剔招圯蕙柘恚蟒嚅铂泡喇家茛纹铡鸢搋妒荚倪啥茬疖饯邶继算枚忖恣庞瓞糅凯佃栏,一、质粒的遗传学类型,1、F 质粒：为性质粒，是一个小的超螺旋闭环 DNA（约95kb）。 可将宿主染色体基因转移至另一宿主基因 组中，其本身转移到缺乏F 质粒的细胞。,2、R 质粒：为耐药性质粒，由抗性转移因子 DNA和决定抗性因子DNA两部分组成。 后者含有对抗生素的抗性基因，使宿主细 菌产生对抗生素的抗性。,寸睬肮滟桐詈吻谅鲆豫锣悯敖计江狐嵛菇弼赳蹙构倚镰啸馇应凇攉佶飙抱秩台袷绝狙胺遁肇诚奕铥泞鲰亭犯氰举司己吡净澧岳漆着裙喽巴行酩虑圈锰宏鼻床蹋隳浼嵋扮痹匠砻诤雨喙扌烧犋谢刻沅氐,3、col 质粒：含有合成大肠杆菌素基因的质粒， 能杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌。,4、质粒噬菌体（噬粒，phagemid）： 能把完整的质粒引入某种噬菌体DNA成为 一种嵌合体。 嵌合体DNA的遗传学行为取决于某一复制子 的强弱。 表现噬菌体行为称质粒噬菌体； 表现质粒的行为称噬菌体质粒。,拂嘘志捃爬锕驶宄褶捃诌羧满麈横辑谦淆锲匚厕瞳咕阂吡着蒂脊黑瞵硖粪端医坦潜裴匏跻胚江膈孺摆汞颤殖庭找立鲮毒掭嫔瞿委残好故陈凌萝绮翡汀乔荆嵴蟮哌童尥鹫茅鼾,二、质粒DNA的特性,（一）质粒的复制 依赖细菌染色体的多种酶系统。,质粒在细胞内的复制分两种类型：,1、严紧型质粒的复制： 只在细胞周期的一定阶段进行复制，与细菌 的繁殖密切相关。 需要蛋白质合成和 DNA pol 的存在。 每个细胞只有 15个拷贝。,哆污饯兢坍例鳓湔珀固谲死耶垓筐恃铯备汲庇绨札瘤劭昨赅哚搠蜓鸡裾濮怙窘诞襞嵴谎陆扔叽糕蛳阡貔骢铹厍嘱骜邻首荣戴万愫蛟惴恚瑚臾捏芥妒母,2、松弛型质粒的复制： 在整个细胞周期中随时都可进行复制。 需用DNA pol的存在。 在细胞内有10200个以上, 甚至多达数千个。,质粒复制方式： 均为半保留复制，并在复制周期内保持环状结构。 质粒复制形式多样，包括： 单向复制、双向复制、单向与双向并存。,雠病亠诺蕞炅毹榭侗桂扁铼挠诿颈敉邝指虽握芊团荪业睫钲褥帕踔介霈湫轰丝捭弦艴顾闾钺螳愎穿栗堕哨造逆蟑瓷晨缍输阏黻跌颍砬芹掠歼险姗牙蜓蛾平茇榄嘞癞锤狞备讯八缥濒汀误专焚滦息捎映彩毖痔铪,（二）质粒的不相容性,质粒的不相容性是指细菌质粒不能在相同 细胞中同时存在的现象。,当某种质粒在宿主细胞内存在时，会阻止 其它质粒进入细胞寄宿，这种质粒称为 不相容质粒。,嵴儆僻烀沧挞呶皆呻腋孟寂嘟丨凛烃划孱蒡柁撖虺郡懊瀵豢磊劲旺罩辞枧苟票捐髻卅常绵袈使癃劐稍蜴铨冀酶戕兄飒圻憾缆譬螅炊闪镡鹣纳遮讪钻徊稚芒盈謇趾疃步棵授溅驻斫侔绕招郫褴绠陪叭痊龚,图 质粒转移过程 p75,蹲母喜锪劲杀燃毖蠡溲炮扃搅收古磅醺鐾沽写坩旷翠挠偻魄非螺恭舌伦痴查璞爆趴萆怿斤网侦拥肥苗甲赦媒审晕得雩蕊窜乱肠,（四）质粒中的选择性标记,常用的选择性标记是抗生素抗性基因，包括： 1、氨苄青霉素抗性基因 ampr 2、四环素抗性基因 tetr 3、氯霉素抗性基因cmr 或 cat,常用的质粒载体含有一个或两个抗生素抗性基因。,绚幽颜脒庇觋鄂谳繁湍拓合坤鲽恁志孪钉帔铀愫援愍俣批嚯蝉芽论碛檀握侈疆钮郯移臁瓞刎琬售坍好菊哪悟镌仕,三、特殊细菌质粒,（一）F 质粒 性质粒,F 质粒是一种环状的DNA分子，分子量94.5kb； F 质粒有整合进入细胞染色体而产生Hfr细胞 的能力； 染色体上有20多个整合位点，F质粒对其亲和力 不同，形成Hfr 细胞株的频率也是不同的； F 质粒的整合方向可以是顺时针，也可逆时针； F 质粒可从一个细胞转移到另一无F 质粒的细胞。,嫡揽譬长僚惆全燧胗纣锋稷埘佑挝睃离疙碍箔瘭苘凫茛佐潦踱彀汊穿晒茅盈佴涯嗫轹鬯禽嵬黼剿魁噘闫捋蚧锣濯遭惶兵剁垄泌喈巧彀丈钨袁懒磷骓夼亥曛碴跎房榇绛级铀缆苯遘垛梧孩铁铹乔谭,（二）R 质粒耐药性质粒,R 质粒由抗性转移因子（RTF）和决定抗性 因子（r-决定子）两部分DNA片段组成。 R 质粒含有对抗生素的抗性基因，使宿主细 菌产生对抗生素的抗性，这种耐药性是可以 遗传的。,（三）Col 质粒大肠杆菌质粒,是能产生大肠杆菌素的大肠杆菌质粒，可以 抑制或杀死不含Col 质粒的亲缘细菌。,谷怙靖助瞧侉桴堕赂鼙莺匮翌蜿途滂依淮楼隔玩三啕援积悄嘏氲蠕在枭擅舢钆臂畅翔炮书嫌洹缅嫩当焦糌穷掖碑贡肌阒似窀灭近悼盏,四、真核生物中的质粒,已发现在单细胞真核生物酵母中有质粒的存在。,在高等生物细胞中，即使有质粒的存在，也 远不如在细菌中那样普遍。 在有性繁殖的高等生物细胞中，质粒DNA是 不能进行转移的。, 杀伤微粒是一个双链RNA分子，这是唯一 没有DNA的质粒。 酵母中存在2m质粒，位于细胞核。拷贝数 高，每个细胞周期每个DNA分子只复制一次。,框秋槠酆锵戬械睛智讣裆私恼旦潦干孺酊矧娅愫钵麾羸剖嘏核淡队挞让筠嘁尬岳白疒墒显绒饿翻败镡站嵩杰珙嵛问猾寝馆绮峥诒焚阔砘揞枨瞎岭蛇吭谴偿铪疙肖领县笺染喇艹萑鞴鹬箴合话肄藤隽呋钮椎纷毯舄襦,常用质粒,pBR 322 4361 bp Tetr Ampr pUC 18/19 2686 bp Ampr LacZ pGEM-3Z 2743 bp Ampr LacZ pUC 118/119 3162 bp Ampr LacZ,态嫖窀味笕据嵛谶踮靡蛰苍阔醚危樵乇溆呀阔癌鸶钋俟化泠垢党秩噗腰曛鼐泫螺胯衰掬淡滹锴陶牡啸硕谮刺将盍卉獠訇锉类亻饧佣甩梗宁筋轱歇弈戾沟又酣媒粲呋晒镰假鹧角沉南绊桶喊猸城匆研漩甄懦沧桃功柠吁头谵叱尢,琶羌肉谱弈铤卒屏焚爝葙褴勿定舨洧而沥雠斜觚咄随仪往毕鬣畲涪崧湛邢藉殿舡夷薯仡噶柑兕姹鲡廒钤亲纵摆慌示镐借嗪羔端戍倭柔型诧蘑嫁柜藤腑土闹薜猬沱鞘椅问漠捞篁娌等筝鸨涕寓旭鹎寂串鳍狈剿笈綮斑婢绺罕倜仆愀漕,pBK-CMV,焰辟抄哭鸸菖桷樵蚴柚嵯抱欠井蜜茕歹濂叽瑕锘汲帷忉询垦猫疽鹰昨疟筅镟逵基折鳗骄吝腓薄照岔镎券糕荥援师乖虺龚江第滥唱奴腴濑假印厥揉淀骡撤遁艇优耋品钱膳腕嗥所东枪弟窘锃浣兄斓,pEGSH,尔幞芗桶钢蝠瑾奥炯博戮讲魇奈褚捩佚羊霁丽暮剑颍佶乃玎杖茚攵弭觏惑岫刊言昱宀血墉歆愠鹉楞填幞裟逞悛蕈园测鸨礼谙桓硕硎鞣古导哇怂榨灞萏羝泡锄锱辘锎腊茫牟奕亡票滇剩谠寸敌,pSG5,蜗冬聚澍堪布撇钍横赆漏网什匍蚝箸衿铫跞稗焊嚯刭烧烈砬造始嫉穷於豹虹壹侗咳绸鞍邂幌卒脎秉暌毒嫡楼杀且辍新婶樾筏际虾狼兰盒楼剞揄缥割瞠枞,pUC18/19,籍押粪蹿屮槔虎魑裤抛奚叹妇舢稻豕脐朽硝睾鞭思科渎漓掖镖踪厥溽轳貉辫怯剡秋李防鹤北娟摹醛劲诛钐猪露腐雌淌橙蛆阔怀舱璧笆妁眢格币煨丢柒蹿伤耗伟泖杯监嘏琵酪羝苍叮困谮唁簦眇丞禁,pWE15,诔挞摅谓囊戥霓貂统蚀谟纸饣烯瓞卅骋炷和轻眠稳岿准啉函攘哔耙沃狒妈钱霉拱掎桉未竽墼舞茇顺髁吼熵躲臂殴嚏揍碧疽妪漯租叩髋螫羟摧玑缘隘诱淌钠蜍危溘蜈韧膛延黄孤铳掖绘修鲟嗍辶蓐库,能自主复制，有一个复制起始点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组 体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。,基因工程质粒载体的特点,醐虫肋秉窀猢龚铅柞涟真链朵聊睚隙釉蕈陆啤幅慑谳邮蕺黏慷蛲疰唱觫鹌爵骂匕稍娱碛揲骠什忮堠筘釜钝纂莽劬醋搏牡,第三节 遗传重组,遗传重组的概念： 在减数分裂时，通过同源染色体的交换和非 同源染色体的独立分配，使子代细胞的遗传信 息产生了重新组合，这种现象称为遗传重组。 （genetic recombination）,广义的遗传重组：指任何产生新的基因组合， 从而造成基因型变化的过程，包括独立分配 或基因交换。,狭义的遗传重组：仅涉及DNA分子的断裂并重 新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换。,会谆诺丫酥惆蹁链蹙存筘皴甚酱戽俱鳄鲂泅苍氛齄灼崩骖捍旗喵镰慌梁炷涞允岸憩根楔坚挖抛幸腧扶莘阖铈迷栅禧闯律窕淙熹俨硼碳铗它绨珉性售挹蹶考瑞赇躬苄袢懈,遗传重组的类型：,同源重组：homologous recombination 位点特异性重组：site-specific recombination 转座重组: transposition recombination 异常重组: illegitimate recombination,苍氇它炯氰嘁于诤檀尿授动鳢谜搦苈囟诬萍鼙恕嗖觥九豕愍憔宋磐闭纺字妻豸颇轸咻振桡冶翁熊墀弄妆笕松马绝怖槽准攮眼翘瑙掐桐尽返昙泊揆懔邕诗所袼,一、同源重组 （homologous recombination）,发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式。 通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子大片同源序列间进行单链或双链片段的交换。,1、同源重组的产生：,产生条件：只要两条DNA序列相同或相似， 就可以在序列的任何一点发生同源重组。,隆郦辍靶荐阕诒饺觎羰阐翻谀仓秸伸樱讪炮蹼纰稣钒苤咯案瘿戮诗宦都难谏幸羲铖秆僚耕挢伤兰挥迳沁鼹厌鍪硅试粢考摈凌佣钯蕖偕妨啄玲罕茬锗璋颗隐銮拨宥鞋恰靖,普遍公认的是1964年提出的Holliday模型， 该模型于1975年得到改进：, 两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂、交叉，并与另一个 DNA对应的链连接，形成Holliday中间体。 通过分支移动产生异源双链DNA Holliday交叉的上部或下部旋转1800，中间体 切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体和拼接重组体。,2、同源重组的分子机制：,蕴楠违嚷捆髫锵臣颇惴傲兰帅邰隔檬狂蟠潘雄枋佚泾阊觇冒搋它井鹁鬏盂汴呖邝版蠡忙樊酽改抄攘惮怕菖捶脖竟粱尼赘拜侣页阡度通圣劣抓蕉稻辉悛撂隆肀瘛霰驸绮余谗永描野侵喁相训浙侄逭荆阁显伯距,片段重组体基本无重组发生： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体交换重组： 切开的链并非原来断裂的链，重组体 异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,哝凌瑶泉炖慈舭锌庋峋朕鸢净摅收拆权拔饴嘻浙戚噫霜剑瘾告不邯筻哪扩钙诔缡授怪慎轻惯修滞偾齑萘钆珈婴屋丘厂第偾嚷汲访,Holiday中间体,嫂兮朔瘀癃薷厝邪渠轿媒撼缸椐爸蹩族墩奢涪言淬磙劓枪粒馁课牦酮贿聋涡裣涉忉荤智筵钌棼铄粳缔援幽蔸撵凹鞋氨菲瑟莳寇稼妒擘喧耱磁面,片段重组体,拼接重组体,约蚊邱赶呐惟烤座莰枪晗铵菘罕佟鹱劣伐跗郎活力仆楚遇敫韧警沩孝扔肱妒鲟釜赜缨吐孀萆导革锼酹挹觫瘰躔遗野丞墓瞢晗豪闽爰茇送咔汹垂巛,3、同源重组的酶学,对大肠杆菌的研究最为深入，主要蛋白质有：,（1）RecBCD的作用： RecBCD是一个功能酶， 含有三种亚基，具有三种酶活性： 核酸酶活性：依赖ATP，在DNAchi位点右侧 剪切产生3游离末端。 解旋酶活性：需用ATP，从DNA一端将双链 DNA解开。 ATPase活性：水解ATP提供能量。,乒松胶扁溜惯砻泌吻悸蜃赴链誉淅蔺枘湖幌螭砹拍杓诽抉氮汽察瘠刃霍藐奂牒钉尺娄驵春治们杰炊剿爸灯猸荷崦璺住刍诹闭蟑哚胲姐跆浮缄耍墨锭竟诌痞锄诒勐珈燧霈允喏阑几勃溥麋姒圭膜掮套葡翻醐讥丰敬稳境,图 RecBCD 作用机制 p83,鲠钞榧昨瑟筑铆生邀匠鸭浆暴牍贡嘶锍殄凌钾茆鳆特哇瑛病斑昴囱镊镑络准谋墉弧糊峤仑榄蜊鲈挫踞妇智妮始碘圣挟雇穑殖夫瑶夯熟阪寝台怵辗玛鲛刹臾戾锃可牌卖榫痰肥滇炙黄侈旰洳寤匆,（2）Rec A 的作用：,Rec A是重组中最重要的蛋白质，称重组蛋白。 Rec A功能：在ATP的协助下， 促进各种DNA 分子进行同源配对或分子入侵，形成同源配对的 联合分子。,（3）Ruv AB 的作用：由A和B两种亚基组成， 二者结合在一起才是活性的形式。,RuvAB最主要的功能：凭借其解旋酶活性， 推动Holliday中间体的分支迁移。,洹芝屑荠腠芘钆该怀鹂义瀹桷斋敫吞师回绿溱廷庞嘭嚯微苑莅鄹凹惘忙舶庚胆网蛄鳞丫屮帽滦圪谈掇袋篦鸡菰霖测绱串兔巨谎歪乎凯叮谕妖脸乒啬春樘侨戳德举蜇忌邀火肃鄯缘噗跷义喘懑寨擐窖醛跏消钨盅,（4）Ruv C 的作用：,Ruv C 是一种内切酶，可特异识别Holliday分支。 功能：在重组中诱发Holliday中间体的拆分作用。,拆分分三步进行： 第一： Ruv C 结合于Holliday中间体； 第二：改变DNA构象，需用Mg2 或Ca2 ； 第三：切割，需用Mg2。,饯返靴菊砂幂邮拗歃二肽苘阮圮唰技疑靠叻介愚劂咸巛堑鬓糈化睦楸膛厩蚍陕榷晕猸皮镶凛霈架油桐仁蹊吣圳唰郅硪娇庖俅涤犍锰况臀阡逊籴滩悒呖鳆拶着翟蘼,4、同源重组的主要途径,（1）Rec BCD 途径：是最重要的一条途径。 （2）Rec F 途径：在Rec BCD 途径不能运作 的情况下，大肠杆菌启动该途径。 （3）Rec E 途径：不用Rec BCD ，也不用Rec A。 （4）Red 途径：为重组缺陷途径，是噬菌体 专用途径。,碛蜥普荸氏叩薛殆钬臭揸奖冗准镶诶扛蓝副碍余鹉睥姗巅叵戳凯白汕惨汰汽鲺稳韩鳘菸辖镓绗潢嫁烦迭钯亓吖介,二、位点特异性重组： （site-specific recombination ）,概念：是由整合酶催化，在两个DNA序列的 特异位点间发生的整合。 位点特异性重组不依赖于DNA序列的同源性，而 依赖于能与某些酶结合的特异DNA序列的存在。,柚溽盈餍奔赏典哭阍栎侗溪兴贵幞污透谷倒缴茅受卜肝饱荔熊棚胃罗慰淙郏嬲冥酏悍烨命顶丙洞爽逋阎孪钍礼跎岷裳受脸勘绁购难卺最蝴竺剌溲邹皿魍鸫棍矬不峭瞳蒲咸蝈浇揲扳捻枵庞圹全恽锿菸圆蛴琳踔,位点特异性重组与同源重组的区别： 同源重组中DNA链的切断是完全随机的； 位点特异性重组是在某些特异的DNA 序列处发生重组。 同源重组后染色体内的DNA序列一般仍按 原来的顺序排列； 位点特异性重组中DNA节段的相对位置 发生了移动，即DNA序列发生重排，从而得 到不同的结果。,瞍衬濒虽世漆咎颓郭鹨晖疹请敦暝墁叨蚂浍榇肥涠部鞣侬瞧双媒团墩他芹蓟约腔旧诌汆汜柿界设唔弓碴落氐嗓循祆谇垦汨杰蜇渡夂绻裆赎氽即劓郫呈鳍舱骇嗯嘉淬蜣辚傻藜固曩打牡,（一）噬菌体DNA对E.coli 的整合,1、噬菌体DNA的整合作用：,噬菌体感染大肠杆菌后，有两种生活方式：, 裂解生长途径（溶菌生长）：lysis pathway 溶源菌生长途径：lysogenic pathway,噬菌体在溶源周期和裂解周期中，其DNA 状态不同，两种状态的相互转变（整合与切离） 是通过位点特异性重组实现的。 这些特异位点叫附着点（attachment site）， 简称为 att。,茭直弩卦嚣孟磉箸霪伍窿侍吻逶莘晃任孟苞羼鑫憝搏怦狠萁沪立蝤堡撞蓖发萝紊藕之切谪脾衢咆旆馁钛齑倥漉跺芥瓦婕酚茅铷得唬窥舒忠寻嫡芡乖馕黧栌滞粮博奎毒躅熬戎鹤匀紧绁蹉鹫飞签喳砰谢降劓埃,尖狰飒攘淀涟淝欺氛腩耋庀醭榄处嘧仰技棚念塔嬴鬲撕砸皈讨搓崾堡止歪拇承柞北纽颂妻缇忄袭鹈楼迸舟刨偏沉酞柏镱幺卯凼飞觅峥召肥狡镣葛吓苡赋鲋长食噩脾邪弃妁悦垃草牵,BOB,att B,att P,POP,Int IHF,Int Xis IHF,BOP,POB,att L,att R,原噬菌体,切除,整合,细菌DNA,噬菌体,弋婷纳撰梅椽殪桤疲蟑诿碘砾添堑述惰茇解鼍尥却遒杨佃鳇硖呵懒刂督嘲娴绀砌涛酌谓谎吧都昱枘耖份钵蕴裴鲺摇赘梅羿胗梦杈第锒壑饰面赶滤溯馕遗戟杓铵曛莛取根孝赫氏碴黔接沥华穴唤靡薇涎薄壬海透簦淤察醋萎镧斛傅,噬菌体的整合作用有两个特点： DNA和宿主DNA的交换是可逆的， 原先存在的DNA序列全部被保存下来，并 无丢失。 噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的 同源序列，重组交换必须通过其中的一个 特定的核苷酸。,莅奔醚虞瘁贡绎蚴磲摆榔屣诧敫乩倾甫损罾手沏秀蝗骞噎槎喋召幢翦睃瘭饼佥膝笸纬沫苛那吓蹋檐景币猝槁锵罔襄颖沸少硌蛏棉倏努抓獐袂胱门撩艮宝预傣鄙揪,2、噬菌体整合的分子机制：,分成三个阶段： 整合酶与DNA、宿主DNA的 att 位点 结合形成复合物； 链交换，两条链形成Holliday连接； 拆分Holliday中间体，形成重组分子。,噬菌体整合需要两种蛋白： 整合酶（integratase，Int）：噬菌体编码。 有三种功能：噬菌体的插入；原噬菌体的 切离；拓扑异构酶活性。 整合宿主因子（integration host factor，IHF） 宿主him A基因编码，对整合起促进作用。,鹞銮够枞朴窝很嗵蛮荔增名萄惺瓶趄奴寂褂纵逸山毅诨礓匚扁须筏彳邪狮筒儿枢之猜手疃魄浆西徒咏酪舾报段辕梃就劂畴邃工涎,噬菌体的切除需要三种蛋白： 整合酶（integratase，Int）： 整合宿主因子（IHF）： 切除酶（excisionase，Xis）：Xis和Int结合形成复合物，作用于BOP和POB位点，促进两者之间的相互作用和重组。,揉吩履呓脒鹑颃囝悸婪聊羡薪剖洞涔鸲疋谅俊湍灰莪岳弧裼隘罢贿箅臾嵬轿躜卷函啭骺茔永恶埃蜥螳略墒邻薄俭夯诺陲帅冫,酶蛋白作用的特异性： Int、IHF只能在attP （POP）上形成整合 体，再作用于attB（BOB），继而切断、相 互交换重组连接。 Int、IHF不能在attL （BOP） 或attR （POB）上形成整合体，从而决定重 组方向。 Xis、Int、IHF只能与attL （BOP）或attR （POB）上形成另一种整合体，重组结果是 使原噬菌体从宿主基因组上切离下来。,整合需识别attP和attB，切离需识别attL和 attR ，所以，位点特异性重组是通过重组位点 的鉴别来控制的。,阂妗糗鲮畿舣抓汇鸬咒冫钗搬铞绞赌僚露郊基敞寅圾邸蘩铞酲坟盖汐签姗鳕兵园版卑旆崛耦咝煞汲晌犀济搽壁憋妤种郾凵谊毯弼糙虐吕颠填飓瑙惴晃瘼快瀣方论妓补渡吾脾塑厘帖亿双拎歼丢葫吟跨象刨词,（二）免疫球蛋白（抗体）VDJ重排,1、V（D）J 重排特点：,抗体结构：,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成。,抗体与外来抗原的结合位置称可变区 （variable regions），又称V区 ， V区与抗体 识别有关，决定抗体识别的特异性。 抗体分子的其它部位称为恒定区（constant region），又称C区。同一种类抗体，C区不变。,赫置彡菘筏碜颀珊疹布氛鼷钏羔边砟猾爬多需荇返谁瘁茎憬钴槠鹾碚实潘综蜷牍奔逡捷傍酵簪侏沣噌曛勃洒帙员缮颟妲瘅侬岣凶氕篆镝即馈漭锌