级研究生生第四章_放射性核素标记化合物.ppt

第四章 放射性核素标记化合物 第一节 概述,一、放射性核素标记技术和放射性核素标记化合物的含义 放射性核素标记技术 Radionuclide labeled technique 放射性核素标记化合物 Radionuclide labeled compounds,第四章 放射性核素标记化合物 第一节 概述,一、放射性核素标记技术和放射性核素标记化合物的含义 放射性核素标记化合物是化合物的分子结构中某一分子或原子被放射性核素原子取代后的化合物。 14C-尿素-14CO2 -32PATP 1-14C乙酰胆碱,二、放射性核素标记化合物 （一）放射性核素标记化合物的特点,结合牢固 有合适的放射性物理半衰期 容易测量,二、放射性核素标记化合物 （一）放射性核素标记化合物的特点 （二）同位素标记与非同位素标记,（1）同位素标记(isotopic labelling)：被标记化合物中固有元素被其放射性核素的同位素取代所形成的标记。 有机化合物：14C 、3H 硫、磷化合物：35S 、 32P 特点：所得化合物的物理化学及生 物特性与原化合物基本相同,（2）非同位素标记(non-isotopic labelling) ：非固有元素 131I-蛋白质、 125I-蛋白质 125I-类固醇激素 特点： 组成不完全相同 物理化学及生物特性有所改变,二、放射性核素标记化合物 （一）放射性核素标记化合物的特点 （二）同位素标记与非同位素标记,（三） 放射性核素标记化物的命名,无机化合物：131I-NaI、35S-硫酸 有机化合物：1-14C-醋酸 （1）定位标记（Specific labeling ） 5(S)-3H-尿嘧啶 （2）准定位标记（Normal labeling） 6,7(n)-3H-雌二醇,（3）均匀标记（Uniform labeling） U-14C-葡萄糖 （4）全标记 （General labeling） G-3H-胆固醇,（三） 放射性核素标记化物的命名,（5）双标记或多标记 （Double labeling and multiped labeling） C3H3-35S-CH2CH2CH(NH2)-COOH 13CH3-14COOH,（三） 放射性核素标记化物的命名,放射性比活度 Specific activity 放射化学纯度 Radiochemical purity,（四）放射性比活度与放射化学纯度,（五）不稳定性 1.核衰变 2.辐射自分解 3.脱落 4.位移,（四）放射性比活度与放射化学纯度,碘标记化合物的基本特性 125I、131I、123I: 半衰期、能量适宜 125I、131I：价廉易得 125I：易于探测,第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记,124Xe + 1n - 125I + ,124Xe(n, ) 125I,Xian 氙,碘标记化合物的基本特性 一、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术 特点：苯环比直链易于标记且稳定 （一）基本原理 形式：Na*I-*I- - *I2 或 *I+ （二）常用标记方法 分类：直接标记法间接标记法,第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记,Na *I 氧化剂 *I2或*I+ 酪氨酸残基,1. 直接标记法,lao,1.直接标记法 (1)氯胺T法,原理： 次氯酸使*I-氧化 特点： 简便、快速 便宜易得、 标记效率高、 重复性好、反应易控制 是使用最广泛的碘标记技术 还原剂：偏重亚硫酸钠（焦亚硫酸钠）,氯胺T法注意事项 氯胺T溶液应新鲜配制 氯胺T 用量应严格控制 偏重亚硫酸钠也应新鲜配制、 1.5-2倍于氯胺T pH7.4-7.8, 0.2-0.5M磷酸缓冲液 减少反应体积 反应时间：10s-3min 室温进行,1.直接标记法 (1)氯胺T法,1.直接标记法 （2）乳过氧化物酶法,原理：当少量H2O2存在时,乳过氧化物酶与H2O2结合,释放出新生氧,使*I-氧化。 特点：反应十分温和 放射性比活度高 能保持生物和免疫活性 缺点：标记率比氯胺T法低,30%40%。 还原剂：缓冲液或半胱氨酸或巯基乙醇,乳过氧化物酶法注意事项, H2O2应分次加入 乳过氧化物酶用量应控制 在标记蛋白量的1%以下 采用双酶标记法(葡萄糖氧化酶) pH 3.0-8.0 反应时间：30-60min,1.直接标记法 (3)固相氧化剂法,原理：将氧化剂交联在琼脂糖凝胶上或涂在塑料管或塑料珠子表面,形成不溶性的固相氧化剂。 特点：能简化标记 中止反应不需加还原剂,1.直接标记法 (3)固相氧化剂法, 固相酶法 将乳过氧化物酶或葡萄糖氧化酶交联到琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上, 反应条件仍同于上述酶法。, 氯甘脲(Iodogen)法 1，3，4，6-四氯3,6-二苯甘脲 将氯甘脲用氯仿溶解后涂于反应管底部，用N2气吹干，置-20oC冷藏备用。,1.直接标记法 (3)固相氧化剂法, Iodo-Beads法 将氯胺T的衍生物N-氯苯磺胺共价连接到无孔的聚苯乙烯小珠表面。,1.直接标记法 (3)固相氧化剂法, 固相酶法 氯甘脲(Iodogen)法 Iodo-Beads法,1.直接标记法 (3)固相氧化剂法,1.直接标记法 (4)N-溴替丁二酰亚胺 (N-Bromosuccinimide),原理： 溴代瑚玻酰亚胺的作用与氯胺T和Iodogen法相似。 特点：标记率高、操作简单、快、安全 可标记较低浓度蛋白质 缺点：体内实验可能产生微量毒性,三、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术 1. 直接标记法 (1)氯胺T法 (2)乳过氧化物酶法 (3)固相氧化剂法 固相酶法 氯甘脲(Iodogen)法 Iodo-Beads法 (4)N-溴替丁二酰亚胺,2. 间接标记法,又称联接标记法 是先将放射性碘 联结到一个小分子载 体上,再将这个小分子 物质与蛋白质结合。,3-丙酸-N-琥珀酰亚脂,2. 间接标记法优缺点,优点： 避免了蛋白质和氧化剂直接接触 Bolton-Hunter试剂主要联接到 蛋白质分子表面的赖氨酸残基的 氨基或蛋白质的N-末端上 缺点： 较大分子的引入 碘化蛋白质的放射性比活度和 碘的利用率均较直接标记法低,二、核酸的放射性碘标记技术,放射性碘-碱基 方法：解链 三氧化铊 碘-碳共价键,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 游离放射性核素 标记的杂质 辐射自分解,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 1.基本原理 （1）纸层析(paper chromatography) （2）薄层层析(thin layer -) 硅胶或氧化铝-吸附力和分配系数 离子交换树脂-携带电荷 聚酰胺-氢键,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 1.基本原理 2.基本操作 （1）选择固定相 （2）选择展开剂 （3）点样与展开,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 1.基本原理 2.基本操作 3.测量结果 （1）放射自显影 （2）分段测量 （3）放射性扫描,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 1.基本原理 2.基本操作 3.测量结果 4.注意事项 （1）层析系统：有效分开 （2）高比活度：加载体 （3）多次点样,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 （二）标记物的分离纯化 1.纸层析和薄层层析 2.柱层析 （1）凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography) （2）离子交换层析 （ion-exchange chromatography）,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 （二）标记物的分离纯化 1.纸层析和薄层层析 2.柱层析 （3）亲和层析 (affinity chromatography) （4）放射性高效液相色谱仪,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 （一）标记率测定 （二）标记物的分离纯化 1.纸层析和薄层层析 2.柱层析 3.透析法,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 二、标记化合物的鉴定和质量控制 （一）放射化学纯度的测定,特定组分的放射性（cpm） 放射 化学纯度= 100% 各组分的放射性之和（cpm）,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 二、标记化合物的鉴定和质量控制 （一）放射化学纯度的测定 （二）放射性浓度 （三）放射性比活度 1.直接测定计算法,放射性浓度 (KBq/ml) 放射性比活度 = 化学浓度(g/ml),第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 二、标记化合物的鉴定和质量控制 （一）放射化学纯度的测定 （二）放射性浓度 （三）放射性比活度 1.直接测定计算法 2.色谱扫描面积计算法,特定组分峰的 各段放射性之和 标记率（%）= 100% 全层析谱 各段放射性之和,投入标记的放射性活度标记率 放射性比活度 = 投入标记的待标记物质的化学量,（三）放射性比活度 1.直接测定计算法 2.层析谱放射性测定计算法,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 二、标记化合物的鉴定和质量控制 （一）放射化学纯度的测定 （二）放射性浓度 （三）放射性比活度 1.直接测定计算法 2.色谱扫描面积计算法 3.自身取代计算法,第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定,一、标记化合物的提纯 二、标记化合物的鉴定和质量控制 （一）放射化学纯度的测定 （二）放射性浓度 （三）放射性比活度 （四）生物活性和免疫活性的测定,（四）生物活性和免疫活性的测定,方法：鉴定生物活性时, 让其与受体结合; 鉴定免疫活性时, 让其与抗体结合。,三、标记化合物的辐射自分解与对策,（一）辐射自分解的类型 1.初级内分解 2.初级外分解 3.次级分解,H2O,H2O,O, OH,1. 初级内分解 2. 初级外分解 3. 次级分解,核衰变释放的 射线,核衰变产生 子体核素,产生激活物质,三