基于酶促原理的药物设计.ppt

第四章 基于酶促原理的 药物设计,药物设计学,【学习要求】,1. 掌握酶促反应的基本概念和酶抑制剂设计的基本原理。 2. 熟悉酶抑制剂类药物的发展现状；熟悉NS3/4A蛋白酶抑制剂波西匹韦的设计与发现过程。 3.了解HIV-1 RT、PTKs和NA等药物作用靶酶的结构、功能和抑制剂。,酶（enzyme）是机体内催化各种代谢反应的生物催化剂，是由组织活体细胞合成分泌并对其特异性底物具有高效催化作用的天然蛋白质。,在目前已知的500多种药物作用靶标中，酶是最重要的一类，约占45%。未来将有50007000种功能蛋白将会成为药物设计与研究的实用性靶标，其中约3500种是酶靶。,第一节 酶促反应的基础知识,一、酶促反应理论,（一）底物浓度对反应速度的影响,米氏方程：,在底物浓度很低的条件下与S呈线性关系，结果=SVmax/KM； 当底物浓度接近饱和时，与S无关并且趋于最大反应速度Vmax。,底物浓度对酶促反应速度的影响,（二）E-I 的相互作用,底物或抑制剂与靶酶的亲和力是各种作用力的综合结果（静电作用、范德华力、疏水作用、氢键和阳离子-键）。,Ki=EI/E I,Ki值越小，抑制作用越强。,二、酶的激活与抑制,1. 酶原的激活 这种无活性的酶的前体称为酶原，酶原向酶转化的过程称为酶原的激活。酶原的激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。 2. 酶的变构激活 体内一些代谢物可以与某些酶分子活性位点以外的某部位可逆结合，使酶发生变构并改变其催化活性，称为变构效应。,（一）酶的激活作用,3. 酶的共价修饰激活 酶结构上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这一过程称为酶的共价修饰或化学修饰。,（二）酶的抑制作用,1. 不可逆性抑制作用 不可逆性抑制剂通常以共价键与酶活性位点上的必需基团结合，使之失活。 2. 可逆性抑制作用 可逆性抑制剂通常以非共价键与酶和（或）E S可逆性结合，使之活性降低或消失。,竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制,竞争性抑制作用使酶的表观KM值增大 非竞争性抑制作用不改变酶的表观KM值 反竞争性抑制作用降低反应的表观KM值,可逆性抑制剂的种类,紧密结合的抑制剂：以高亲和力与靶酶结合，酶-抑制剂复合物的形 成使游离抑制剂分子被显著消耗。 缓慢结合的抑制剂：酶-抑制剂复合物的解离速速缓慢，达到平衡过程缓慢。 缓慢-紧密结合的抑制剂：指以缓慢的作用过程完成抑制剂与酶结合的一种紧密结合抑制剂。,第二节 酶抑制剂的设计原理,一、酶抑制剂的发展与分类,1. 控制感染性疾病的酶抑制剂类药物,雷特格韦,西他沙星,达卡他韦,索非布韦,2. 抗肿瘤的酶抑制剂类药物 3. 调节代谢类疾病的酶抑制剂类药物,酶抑制剂类药物及其靶酶,酶抑制剂类药物及其靶酶,酶抑制剂类药物及其靶酶,二、酶抑制剂的合理设计,1. 基态类似物抑制剂 酶促反应的基态由底物和产物组成。基态类似物模拟底物或产物的化学结构，包括底物类似物和产物类似物，以底物类似物为多，通常作用于与底物相同的活性位点。,（一）基于非共价结合的酶抑制剂的合理设计,2. 多底物类似物抑制剂 多底物类似物模拟结合在酶活性位点的两个或多个底物的结构，通过共价键把两个或多个底物或底物类似物结合在一起。与单底物类似物相比，多底物类似物的优点在于与靶酶的结合力大大增强，并且特异性更高。,3. 过渡态类似物抑制剂 由于酶与过渡态之间的亲和力高于酶同底物或产物的亲和力，酶可以降低这种能量壁垒，使反应速率提高10101015倍。过渡态类似物抑制剂是一类特异的竞争性抑制剂，其结构类似于反应中不稳定过渡态的底物部分。,（二）基于共价结合的酶抑制剂的合理设计,1. 基于机制的酶抑制剂 也称为自杀性底物（suicide substrates）。,特点： 同正常底物的化学结构相似，包括电性和立体两个因素； 具有低反应性能的潜在基团或结构片段，在酶的催化阶段，经靶酶诱导激活，转化为反应性能强的活性基团或中间体； 与酶的活性中心共价结合，使酶不可逆失活，具有高度特异性，毒性较低。,2. 亲和标记抑制剂 又称为指向活性部位抑制剂（active-sited directed inhibitors）。 通常也是底物或产物类似物，特征： 分子中与酶可逆结合的部分，即识别基团； 在识别基团上连接或修饰具有反应活性的化学基团或原子，或称活性基团。,第三节 酶抑制剂类药物,一、HIV逆转录酶抑制剂,获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS） 人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）分为HIV-1和HIV-2两种亚型,整合酶（integrase）、逆转录酶（reverse transcriptase，RT）和蛋白酶（protease）是病毒复制过程中的关键的3个酶，任何一个酶的失活都将阻碍病毒的复制。,（一）HIV治疗药物,（二）HIV逆转录酶的结构特征,HIV-1逆转录酶与DNA双螺旋复合物结构示意图,非核苷类逆转录酶抑制剂,奈韦拉平 地拉韦啶 依法韦仑,（三）HIV逆转录酶抑制剂及其作用机制,奈韦拉平等3种NNRTIs与HIV-IRT复合物的晶体结构,二、酪氨酸激酶抑制剂,人类基因组大约编码519种蛋白激酶，94种蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases，PTKs）是其中最主要的一个家族，占激酶总数的18%。在肿瘤靶向治疗中，PTKs抑制剂占据着重要的地位。,在28种已上市的小分子蛋白激酶抑制剂中，用于肿瘤治疗的有26种，其中20种为PTKs抑制剂、6个为丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂；另外2种属于PTKs的JAKs抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib）和托法替尼（tofacitinib）分别用于骨髓纤维化和类风湿关节炎。,（一）PTKs的结构特征,PTKs主要分为受体型PTKs及非受体型PTKs两类。,1. 受体型PTKs的结构特征和类型,受体型PTKs在细胞外存在一个结合配体的胞外区，配体一般为膜结合的多肽或者蛋白类激素，包括多种生长因子。胞内区为一个可以选择性与底物结合并且将其酪氨酸残基磷酸化的催化域，且具有自磷酸化位点。此外，还存在一个跨膜结构域。,受体型PTKs主要包括： 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族，包括ErbB-1（EGFR）、ErbB-2（HER-2）、ErbB-3（HER-3）和ErbB-4（HER-4），此类受体高表达于上皮细胞肿瘤中； 血小板衍化生长因子受体（platelet derived growth factor receptor，PDGFR）家族，通过作用于内皮细胞和间质细胞，促进血管形成；,成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）家族，FGF调节细胞分裂、增殖、迁移及分化的多效生长因子，此类受体在血管形成方面起重要作用； 血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）家族，包括VEGFR-1（FLT-1）、VEGFR-2（KDR/FLK-1）和VEGFR-3（FLT-4）。,2. 非受体型PTK的结构特征,非受体型PTK一般没有细胞外结构，它们通常位于胞质中或者在细胞膜内侧与跨膜受体结合，通过细胞因子受体等执行信号传导功能。包括JAK、ABL、SRC、ACK、CSK、FAK、FRK、SYK和TEC等家族，其中TEC家族成员有BTK、ITK、TEC、BMX等较热门的研究靶点。,从伊马替尼（imatinib）与BCR-ABL的共结晶结构可了解非受体PTKs的结构，C端多为-螺旋结构，N端多为-折叠结构，C端和N端通过一个铰链连接，铰链区（hinge region）的细长狭缝为底物ATP结合口袋。,ABL激酶与伊马替尼的共结晶结构,ATP与PTKs催化域的结合方式如下图所示，通过腺嘌呤结构与铰链区的保守氨基酸残基形成13个氢键作用，在大多数激酶抑制剂的设计中均可看到与铰链区的氢键结合作用；核糖环占据口袋保持三磷酸基团的构象，同时可以和附近的氨基酸残基形成氢键作用；三磷酸基团可以和镁离子络合，并且和活化环产生相互作用，最终将-磷酸转移到底物蛋白质的酪氨酸残基上。,ATP与激酶催化区域的结合模式,（二）PTKs抑制剂,设计小分子ATP或底物类似物，通过与ATP或底物竞争性结合胞内激酶催化区域，阻断分子内酪氨酸的自身磷酸化，阻断酪氨酸激酶活化，阻止下游信号转导，从而抑制细胞周期进程、加速细胞凋亡、抑制血管生成、抑制浸润和转移。,靶向EGFR、VEGFR和ALK等3种受体型PTKs的14个抑制剂中，包括以EGFR为靶点或主要靶点的吉非替尼（gefitinib）、埃罗替尼（erlotinib）、拉帕替尼（laptinib）和阿法替尼（afatinib）；以索拉菲尼（sorafenib）和舒尼替尼（sunitinib）为代表的VEGFR抑制剂；靶向间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）的克唑替尼（crizotinib）和色瑞替尼（ceritinib）。,以BCR-ABL和Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）2种非受体型PTKs为靶点的小分子抑制剂已成功上市6种药物，靶向BCR-ABL的代表性药物为伊马替尼和达沙替尼（dasatinib），是治疗慢性粒细胞白血病的有效药物；而依鲁替尼（ibrutinib）是唯一的BTK抑制剂，用于治疗套细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。,这些替尼类（-tinibs）药物并不是作用于单一的靶点，对其他激酶也有着较强的抑制活性，从多向药理学（polypharmacology）的角度来说，可能是其临床有效性的原因，另一方面也会由于脱靶效应（off-target effect）造成一些不良反应。,这些替尼类（-tinibs）药物并不是作用于单一的靶点，对其它激酶也有着较强的抑制活性，从多向药理学（polypharmacology）的角度来说，可能是其临床有效性的原因，另一方面也会由于脱靶效应（off-target effect）造成一些不良反应。,第四节 案例分析：波西匹韦的发现,一、研究背景,丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要经血液/体液传播。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，约1.8亿人感染HCV，60%70%的感染人群发病，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。,HCV是一种高度易变异性病毒，根据其基因序列的差异，可以分为、和四种基因型，各基因型间没有免疫力，相互之间可以重复感染，这使得研制预防性和治疗性疫苗存在很大困难。近5年抗丙型肝炎药物取得重大突破，下面以NS3/4A蛋白酶抑制剂（NS3/4A protease inhibitor）波西匹韦（baceprevir）为例，说明基于酶蛋白结构的合理设计过程。,NS3/4A蛋白酶对HCV的生长和增殖具有重要作用，是研究抗HCV药物的理想靶标。 NS3/4A蛋白酶的单晶X射线分析提示，其活性中心是处于酶的表面，呈平坦状展开，没有明显特征的疏水性结构域，而且被水分子覆盖。催化核心是由N端的His57和Asp81、C端的Ser139三元体构成。底物P1位置为Cys或The，P1为疏水性、小体积氨基酸Ala或Ser，P2、P3和P4为疏水性氨基酸，P5和P6为Asp或Glu等酸性氨基酸残基。,二、苗头化合物的发现,由于酶与底物的结合以在较大范围发生、多位点的弱结合力为特征，研究筛选小分子化合物以其达到抑制NS3/4A蛋白酶的目的并不成功，而模拟天然底物的长链肽，进行设计与修饰成为有效途径。化合物（4-50）与NS3/4A蛋白酶活性中心的结构相匹配，且酮基酰胺处于合适的位置，可与Ser139发生亲核性进攻，形成稳定的共价键，成为不可逆性抑制剂，如下图所示。,-酮基酰胺片段与丝氨酸的羟基发生亲核进攻形成共价结合的示意图,三、先导化合物的确定及优化,1. 减少氨基酸残基，由十一肽减为五肽,2. 改变侧链基团，再减少氨基酸残基,四、上市药物波西匹韦的确定,在临床前研究中，化合物（4-53）表现出良好的开发价值，被命名为波西匹韦（baceprevir），最终在2011年5月上市。,波西匹韦与NS3/4A复合物的单晶X射线衍射图显示，两个叔丁基分别与S4和S3疏水腔发生疏水相互作用，P2的二甲基环丙并脯氨酸片段呈弯曲构象，与酶的Ala156、His57和Arg155侧链发生最大限度的疏水性交盖，环丁基占据了S1腔，-酮基酰胺的羰基与Ser139形成可逆的共价结合，整个化合物骨架与酶发生多处的氢键结合。,波西匹韦与