硝基苯对蚕豆根尖细胞致畸效应的研究学位论文.doc

Abstract学 号：2003032011学 位 论 文硝基苯对蚕豆根尖细胞致畸效应的研究唐春凤指导教师姓名：张晓军申请学位级别：学 士专业：生物技术论文提交日期：2007-6-9论文答辩日期：2007-6-9授予学位单位：牡丹江师范学院授予学位日期：答辩委员会主任：论 文 评 阅 人：牡丹江师范学院生物系14- -摘要采用蚕豆根尖细胞的微核试验和染色体畸变试验方法，以不同浓度的硝基苯为诱变剂，选择不同的处理时间，测定蚕豆根尖细胞的有丝分裂指数、微核率和染色体畸变率。结果表明：硝基苯能诱发较高频率的微核率，处理4和24 h时微核率随着硝基苯的浓度的升高而增加，但高于一定浓度后反而呈下降趋势。不同浓度的硝基苯在不同处理时间均使蚕豆根尖细胞产生较高频率的染色体畸变，且产生多种类型的染色体畸变。因此，硝基苯对蚕豆根尖细胞有明显的致畸效应关键词硝基苯 蚕豆 有丝分裂 微核率 染色体畸变率AbstractStudyon Teratogenic Effect of Nitrobenzene on Vicia faba Root Tip Cellswith different concentrations of nitrobenzene as mutagen,weused the micronucleus assay and chromosome aberration assay to determine mitotic index,micronucleus rate and chromosome aberration rate of Vicia faba root tip cells.The result showed that nitrobenzene could increase the icronucleus rate of Vicia faba root tip cells.Within certain range of concentration of nitrobenzene and treating for 4h and 24h,the rate of micronucleus was found to increase systmatically with the added concentration of nitrobenzene,and then to decrease systematically with the concentration.At different time of treatment,different concentrations of nitrobenzene could apparently down mitotic mdex.Nitrobenzene also caused high rate and various types of chromosome aberration.Thus,nitrobenzene had systematical teratogenic effects on Vicia faba root tip cells.Keywords itrobenzene；Vicia faba；mitotic；the micronucleus rate；the rate of chromosome aberration目录 目录摘要IAbstractII1 引言12 材料和方法22.1 研究地点22.2 研究材料22.3 研究方法22.4 统计方法23 结果33.1 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞微核率的影响33.2 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响43.3 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响43.4 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂的影响53.4.1 间期63.4.2 前期63.4.3 中期63.4.4 后期63.4.5 末期6讨论10参考文献12致谢13千万不要删除行尾的分节符，此行不会被打印。在目录上点右键“更新域”，然后“更新整个目English Catalog 千万不要删除行尾的分节符，此行不会被打印。在目录上点右键“更新域”，然后“更新整个目录”。3 结果1 引言毒理学是研究化学物质对生物体毒作用性质和机理、对机体发生这些毒作用的严重程度和频率进行定量评价的科学。它已从单纯研究毒物的学科，飞速发展成为一门现代的综合性的学科（纪云晶，1991）。这门科学引起了人们的高度重视。这是由于随着工农业生产的发展和科学技术的进步，人们在日常生活中接触到的化学物质越来越多，有许多环境化学物迫切需要进行毒性评定，阐明其对肌体健康的影响，为制定环境卫生标准、评价环境质量、采取防治对策提供科学依据。环境毒理学是应用毒理学方法研究生活环境(空气、水、土壤、公共场所、家用化学物品等)中已存在或即将进入的有毒化学物质及其在环境中的转化产物对人体健康的有害作用及其作用规律的一门科学,它既是环境卫生学的一个重要组成部分，又是毒理学的一个分支学科。以往毒理学研究主要以整体动物试验和人体观察相结合，在相当一段时间内，这仍然是重要和必要的手段，随着分子生物学的理论和方法应用与毒理学研究，逐渐使外源性化学物的毒性评价方法发展到体外细胞和分子水平的毒性测试与人体志愿者试验相结合的新模式（Elespuru R K A，1996）。硝基苯作为有机合成原料，用以生产苯胺染料。在生产染料、香料、炸药等有机合成工业中，在贮存、使用、装卸、运输的过程中有可能发生泄露并污染自然环境，并对环境生物产生相应的毒害（杨建洲，张昌辉,2005）。蚕豆根尖细胞微核试验技术在环境污染物检测中已被我国定为“生物检测技术”而得到广泛的应用（屈艾等，2001)。蚕豆根尖微核试验方法及染色体畸变试验方法近年来逐渐应用于环境诱变剂的检测及致突变研究。该植物检测方法被认为是用作致突变性分析的一种很好的测试系统。为此本文研究了不同浓度硝基苯，及不同处理时间对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数、微核率、染色体畸变率的影响，以期探明硝基苯对植物细胞的致畸效应。2 材料和方法2.1 研究地点牡丹江师范学院 生物系 基因工程研究所及细胞生物学实验室2.2 研究材料蚕豆（Vicia faba L.）产于浙江洞头。硝基苯由沈阳试剂一厂生产，批号89063购于牡丹江市化学试剂商店，为分析纯。用蒸馏水将硝基苯配成5 mgL-1、10 mgL-1、20 mgL-1、30 mgL-1、40 mgL-1、100 mgL-1 6个不同浓度。2.3 研究方法选择饱满、大小均匀的蚕豆种子于蒸馏水中浸泡1 d，让其吸胀，然后铺展在垫有湿滤纸的培养皿中，盖上湿纱布，于培养箱中23 下恒温培养，12 h换水1次。待根长至1左右，分别用蒸馏水及5 mgL-1、10 mgL-1、20 mgL-1、30 mgL-1、40 mgL-1、100 mgL-1 6个不同浓度的硝基苯分别处理4 h和24 h后恢复培养24h，切取根尖，用卡诺氏固定液（无水乙醇:冰醋酸=3:1v/v）固定24 h，置70%乙醇于4 冰箱中保存。取根尖分生组织，常规制片。用改良石炭酸品红染液染色（钱晓微,1998;钱晓微等,2003）。压片镜检，观察统计细胞有丝分裂指数、微核千分率、染色体畸变千分率，并对具有畸变的细胞进行显微摄影。（试验分组及处理见表1）2.4 统计方法均采用spss10.0数据处理系统进行方差分析。 3 结果3.1 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞微核率的影响由表1可知硝基苯能诱发较高频率的微核及染色体畸变，12个试验组的微核率明显高于对照组（p0.05或pb，cc。从20 mgL-1开始，dd、ee、ff、gg。表1 实验分组及硝基苯对蚕豆根尖细胞微核率的影响Table 2 The effects of Nitrobenzene on the rate of chromosome aberration of Vicia faba root tip cells组别 硝基苯浓度 处理时间(h) 根尖数 1000个间期细胞微核数/根尖 微核率Group Nitrobenzene process time No.of root tip Micronucleus No.of1000piece Micronucleus Concentration(mgL) interphase cells/root tip rate( S)a(对照)0 4 10 1 2 2 1 1 0 2 2 1 2 1.40.70b 5 4 10 4 3 4 5 2 4 6 5 5 4 4.21.14*c 10 4 10 7 8 10 8 9 8 8 9 10 10 8.71.06*d 20 4 10 16 15 15 16 15 15 14 16 17 15 15.40.84*e 30 4 10 12 10 10 11 11 10 11 9 10 9 10.30.95*f 40 4 10 6 8 6 7 7 5 6 7 8 6 6.60.97*g 100 4 10 3 2 3 3 4 4 3 4 3 2 3.10.74*a(对照)0 24 10 1 1 2 1 1 0 0 1 1 0 0.80.63b 5 24 10 5 6 3 4 5 5 6 4 4 5 4.70.95*c 10 24 10 9 10 9 9 11 8 8 9 9 10 9.20.92*d 20 24 10 6 5 6 7 6 8 6 6 5 5 6.00.82*e 30 24 10 5 5 6 4 5 3 5 4 4 3 4.40.97*f 40 24 10 2 2 3 3 2 3 4 5 2 3 2.90.99*g 100 24 10 1 2 2 2 1 1 2 2 0 2 1.50.71*注：各组比较，*代表p0.1，*代表p 0.05，*代表p0.001。Note:each group comarison with the control . *expressing P0.1, * expressing P 0.05. * expressingP 0.001.3.2 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响由表2可知硝基苯能诱发较高频率的畸变.畸变率随着浓度的升高而增大，在c和b时出现峰值，既组硝基苯浓度为10 mgL-1，而组浓度为5 mgL-1时。而后随着浓度的升高而畸变率下降。而在硝基苯高浓度时畸变率低于对照组，既ga，bb。从10 mgL-1开始，同浓度的。 表2 硝基苯对蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响 Table 2 The effects of Nitrobenzene on the rate of chromosome aberration of Vicia faba root tip cells组别 硝基苯浓度 处理时间(h) 根尖数 1000个间期细胞中染色体变细胞数/根尖 染色体畸变率 Group Nitrobenzene Process No.of root tip Chromosome aberration the rate of chromosome concentration time No.of1000piece aberration （mgL-1) interphase cells/root tip ( S)a(对照)0 4 10 3 2 0 1 1 2 2 1 3 3 1.81.03 b 5 4 10 8 10 9 9 10 7 9 8 10 11 9.11.20 *c 10 4 10 17 16 18 18 19 19 18 19 20 19 18.31.16*d 20 4 10 10 11 11 12 13 12 12 10 14 11 11.61.26*e 30 4 10 4 4 3 5 6 5 5 5 4 3 4.40.97*f 40 4 10 1 1 0 4 4 2 3 2 2 2 2.11.29*g 100 4 10 0 0 1 1 3 0 2 0 1 1 0.90.99*a(对照)0 24 10 4 3 5 3 3 2 2 3 4 3 3.20.92b 5 24 10 10 13 13 12 12 11 12 11 10 9 11.31.34*c 10 24 10 7 6 7 6 6 8 8 7 8 7 7.00.82*d 20 24 10 3 4 4 5 5 5 4 6 2 5 4.31.17*e 30 24 10 5 3 4 2 1 2 2 0 1 1 2.10.74*f 40 24 10 0 3 0 0 1 2 1 2 2 2 1.31.01*g 100 24 10 1 0 0 1 1 1 0 1 2 1 0.80.63*注：各组比较，*代表p0.1，*代表p 0.05，*代表p0.001。Note:each group comarison with the control . *expressing P0.1, * expressing P 0.05. * expressingP 0.001.3.3 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响表3表明，与对照组比较，不同处理时间的两组随硝基苯浓度升高，分裂指数升高。当的浓度为10 mgL-1，的浓度为5 mgL-1时达最大值。而后随着浓度的升高，分裂指数降低，在同一处理浓度下，随着处理时间的延长分裂指数升高。 表3 硝基苯对蚕豆根尖细胞分裂指数的影响Table 3 The effect of Nitrobenzene on mitotic index of Vicia faba root tip cell组别 各根尖分裂指数%（x） 平均分裂指数( S)Group Mitotic index Average of mitotic indexa (对照) 3 2 2 1 2 4 2 1 3 2 2.20.92b 6 4 1 5 3 3 2 4 3 3 3.41.43*c 5 6 6 7 6 4 8 6 7 3 5.81.48*d 1 5 2 1 3 3 3 1 4 4 2.71.42*e 2 3 1 2 2 1 1 4 0 2 1.81.14*f 1 0 0 1 3 2 1 1 1 1 1.1 0.88*g 0 0 1 2 1 1 0 0 1 1 0.70.67*a(对照) 3 0 3 2 1 2 1 1 1 1 1.50.97b 10 9 9 11 6 10 10 8 12 11 9.61.71*c 4 6 6 3 6 5 7 9 7 6 5.91.66*d 5 4 4 2 4 3 7 4 5 3 4.11.37*e 2 2 0 2 3 4 3 3 5 1 2.51.43*f 2 3 2 2 1 1 0 3 1 1 1.60.97*g 1 1 2 1 0 0 2 1 0 1 0.90.74*注：各组比较，*代表p0.1，*代表p 0.05，*代表p0.001。Note:each group comarison with the control . *expressing P0.1, * expressing P 0.05. * expressingP 0.001.3.4 不同硝基苯浓度及处理时间对蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂的影响由镜检结果可知，硝基苯对蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂的影响，在细胞周期中的间期、前期、中期、后期及末期均发现异常现象。由表4可知，前期，在不同处理时间的各组，染色体畸变率随着浓度的升高而升高，当b浓度为5 mgL-1 ；b浓度为5 mgL-1时出现峰值。而后随着浓度的升高而降低。而将同浓度不同处理时间的两组进行对比发现aa、bc 、dd 、ee、ff 、gg。中期在不同处理时间的各组，染色体畸变率随着浓度的升高而升高，当c浓度为10 mgL-1；c浓度为10 mgL-1时出现峰值。而后随着浓度的升高而降低。而将同浓度不同处理时间的两组进行对比发现aa、bc 、dd 、ee、ff 、gg。后期在不同处理时间的各组，染色体畸变率随着浓度的升高而升高，当c浓度为10 mgL-1；b浓度为5 mgL-1时出现峰值。而后随着浓度的升高而降低。而将同浓度不同处理时间的两组进行对比发现aa、bc 、dd 、ee、ff 、gg。末期在不同处理时间的各组，染色体畸变率随着浓度的升高而升高，当c浓度为10 mgL-1；b浓度为5 mgL-1时出现峰值。而后随着浓度的升高而降低。而将同浓度不同处理时间的两组进行对比发现aa、bc 、dd 、ee、ff 、gg。 3.4.1 间期细胞分裂间期的异常主要出现微核（如图1、2、4）、双微核（如图2）、四微核（如图3）。3.4.2 前期前期的畸变率不高，异常表现主要有前期微核（如图5）。前期的微核是由上次有丝分裂过程中染色体受损或染色体活动异常而形成的（钱晓微，2004）3.4.3 中期中期染色体异常主要是断片（如图6.7），染色体排列异常（如图8）中期断片是这次有丝分裂过程中染色体受损或染色体活动异常而形成的。3.4.4 后期后期异常主要有：染色体的滞后现象（如图12.16）、断片（如图10.12.14）、黏连（如图9.10.11.12.13）、桥（如图16）、双桥（如图9）、多极分布（如图11.15）等。3.4.5 末期末期的异常现象主要有断片（如图22.23）、桥（如图17.18）、滞后（如图18.19.20.21）、解螺旋不同步（如图21.23）、合胞体（如图24）微核的出现：可能是上次有丝分裂过程中染色体受损形成的断片或染色体活动异常而造的。染色体的滞后现象：绝大多数染色体正常移向两极，仅个别染色体或片断滞留于两极之间。这反映了个别染色体移向两极的速度和进程是不同的。染色体的黏连：由于染色体的损伤和纺锤丝的破坏而造成后期的两组子染色体不能正常分开，部分子染色体间出现融合现象。染色体桥的形成：染色体桥的形成是细胞分裂异常和染色体畸变的主要特征之一。桥的形成是由于染色体断裂再融合形成双着丝粒和无着丝粒的染色体断片的结果。所以染色体桥的形成往往伴有染色体断片的出现。染色体的多极分布：正常的有丝分裂后期染色体在纺锤丝的牵引下，均等地分向相对的两极，而经硝基苯处理的蚕豆根尖细胞有丝分裂后期则出现了不均等的三极异常分布的分裂相。染色体解螺旋不同步：有丝分裂末期实际上是一子核重建过程，当染色体到达两极后就开始解螺旋。由于个别染色体活动异常而出现解螺旋不同步，即大部分染色体已解螺旋形成染色质，个别未解螺旋仍以染色体状态存在。合胞体的出现：由于后期出现了不均等的多极异常分布，以及个别染色体受损或染色体活动异常，从而导致合胞体的形成。 表4硝基苯对蚕豆根尖细胞各期染色体畸变率的影响 Table 4 The effect of Nitrobenzene on the rate of chromosome aberration of Vicia faba root tip cell组别 各期染色体畸变率（%） ( S) 总染色体畸变率Group chromosome aberration rate per phase The total chromosome 前期 中期 后期 末期 aberration Prophase Metaphase Anaphase Telophase rate ( S) a(对照)0.140.49 0.540.72 3.13 1.21 1.960.87 1.81.03b 3.220.63* 4.950.50* 9.660.94* 8.251.03* 9.11.20*c 2.580.52*10.210.85*19.861.32* 20.141.23* 18.31.16*d 1.960.84* 6.830.74* 10.911.05* 10.031.09* 11.61.26*e 1.010.76* 4.140.61* 7.640.96* 7.970.96* 4.40.97 *f 0.690.60* 2.560.83* 5.020.88* 5.421.11* 2.11.29*g 0.310.45* 1.700.76* 2.881.24* 2.010.89* 0.90.99*a(对照)0.160.53 0.630.84 4.281.04 2.341.20 3.20.92b 3.650.72* 4.970.73* 13.970.95*12.751.13* 11.31.34*c 2.130.85* 5.860.55* 8.631.22* 7.990.97* 7.00.82 *d 1.870.54* 4.420.67* 6.741.19* 6.820.93* 4.31.17*e 0.960.46* 3.050.81* 4.860.97* 5.061.06* 2.10.74*f 0.560.77* 2.480.62* 3.021.20* 3.471.10* 1.31.01*g 0.210.58* 1.010.79* 1.311.23* 1.891.04* 0.80.63*注：各组比较，*代表p0.1，*代表p 0.05，*代表p0.001。Note:each group comarison with the control . *expressing P0.1, * expressing P 0.05. * expressingP 0.001.32198765421112423222154871：间期微核；2：间期微核、双微核；3：间期四微核；4：前期微核、合胞体；5：前期微核；6：中期断片；7：中期断片；8：中期断片、染色体排列异常；9：后期染色体双桥、黏连；10：后期断片、黏连；11：后期黏连、多极；12：后期滞后、断片、黏连；13：后期黏连；14：后期断片；15：后期三极；16：后期染色体桥、滞后；17：末期染色体桥；18：末期滞后、染色体桥；19：末期滞后；20：末期滞后；21：末期滞后、染色体解旋不同步；22：末期断片；23：末期断片、染色体解旋不同步；24：核异常22千万不要删除行尾的分节符，此行不会被打印。“结论”以前的所有正文内容都要编写在此行之前。致谢 讨论本研究发现，由表5可知，硝基苯能诱发较高频率的微核和染色体畸变。12个试验组的微核率明显高于对照组（p0.05或pb，cc。从20/L开始，dd、ee、ff、gg。这可能由于随着硝基苯处理时间的延长、浓度的增大，对细胞的损伤加剧，不仅导致细胞内染色体畸变的产生，而且有效地阻止该细胞内纺锤丝微管蛋白的聚合作用而使得细胞滞留在分裂期，进而使间期的微核率下降。也可能由于硝基苯处理时间的延长和浓度的增大而导致细胞周期的延长，从而使得一些受损的细胞未完成有丝分裂过程，导致微核率下降。研究表明，微核的形成途径有两条：一条途径是由于前一分裂周期G2期后产生的染色体断片在分裂过程中不能与正常染色体协调活动，在进入间期时，即被排斥于核外形成的；另一条途径是由于各种形式的落后染色体、未及中板集合染色体以及染色体分组造成的（李宏，1997）。两组的染色体畸变率均随浓度的增加而升高。当组硝基苯浓度为10 mgL-1，而组为mgL-1时染色体畸变率达最大值。随着浓度的进一步增加而逐渐下降。在同一处理浓度，不同时间，同浓度的硝基苯处理，染色体畸变率bb，从10 mgL-1开始，同浓度的。说明不同浓度硝基苯在不同处理时间下均能诱发较高频率的染色体畸变，且随着处理时间的不同其产生的效应有异。试验发现硝基苯能诱发多种染色体畸变类型：间和前期微核；中期断片；后期微核、染色体滞留、染色体桥、断片、黏连多极。本试验最为突出的是双桥和断片；末期断片。染色体畸变的产生可能是多途径的。微核的形成、染色体滞留、均可能是由于硝基苯破坏了纺锤丝的功能或形成，也可能是干扰了染色体某些自身的运动规律而使染色体不能及时到达赤道面，造成落后。染色体的黏连、融合及桥的出现，可能是由于硝基苯直接或间接作用于DNA分子，造成DNA断裂损伤，从而形成新的重接，出现染色体黏连、融合、染色体桥、断片之类的重排。硝基苯还导致染色体分极，关于细胞分裂的构造和极性确定，目前尚未搞清楚。一般认为不同物种的细胞分裂极的构造和确定可能是由不同机制控制的（辛享泰，梁万福，1997）。蚕豆根尖有丝分裂中分裂极的构造和极性确定很可能属于“极板”构造。我们知道有丝分裂前期,在每条染色单体上，都含有一段特殊的DNA序列,称着丝粒DNA。其所在部位称着丝粒(centromere)。前期较晚时期，在着丝粒处逐渐装配另一种蛋白质复合结构，称动粒（kinetochore）。动粒和着丝粒紧密相连。从前期向中期转化过程中的另一重要事件是纺锤体的装配。纺锤体是一种与细胞分裂和染色体运动直接相关的一种临时性细胞器。主要由微管及其结合蛋白构成。染色体依靠动粒捕捉，由纺锤体极体发出的微管与染色体一侧的动粒结合，形成动粒微管，而另一侧微管与染色体另一侧的动粒相联结。在动粒中有两种蛋白：Mad蛋白、Bub蛋白。他们使动粒敏化，处使微管和动粒接触，Mad2和Bub1与染色体装入纺锤体有关，只要动粒被微管捕捉，Mad2和Bub1就消失。不捕捉，不消失。而染色体不被微管捕捉而滞后，就无法进入后期。动粒在与微管联结之前，会发出抑制信号，抑制细胞周期向下一个阶段运转。实验证明：硝基苯破坏了滞后染色体尚未与微管联结的动粒，使染色体滞后，但细胞可以向下转化。所以，造成有丝分裂紊乱，在中后期出现多种畸变。 试验发现，不同浓度的硝基苯均能引起蚕豆根尖分生组织细胞分裂指数上升（钱晓微，2004），当c、b出现峰值。而后随着浓度的升高分裂指数下降。这可能由于硝基苯较低浓度时，延长细胞分裂时间，缩短分裂间期的时间间隔，使整个分裂周期缩短，且分裂水平高于正常水平；但随着浓度的不断上升，情况同低浓度下的刚好相反（段昌群，王焕校，1995）。说明硝基苯在不同浓度下对细胞分裂的影响效果是不同的。而同一处理浓度不同处理时间的两组，说明随时间的延长，分裂指数升高。这可能是由于在有丝分裂期，硝基苯阻止该细胞内纺锤丝微管蛋白的聚合作用而使得细胞滞留在分裂期，造成分裂指数升高。 通过不同浓度、不同时间处理可观察到部分细胞核紧贴细胞膜分布，随浓度的递增，根尖的水解效果渐差，细胞分散程度越来越低，出现聚集和重叠现象，并且细胞核呈现凝缩、深染。细胞核变形不规则，核拉长变形，细胞核出现一到多个芽现象。因此，适当浓度的硝基苯随时间延长可诱导蚕豆根尖细胞的凋亡发生，这与张跃华老师的报道相似（张跃华等，2007）。表5 硝基苯诱发的有丝分裂指数、微核率、畸变率的比较Table5 Comparison with the mitotic index,the micronucleus rate and rate lf chromosome aberration induced by Nitrobenzene组别 分裂指数 % 微核率 染色体畸变率 Group Average of mitotic Micronucleus the rate of chromosome aberration index ( S) ( S) ( S)a 2.20.92 1.40.70 1.8 1.03b 3.41.43