课件：基因工程的工具酶.ppt

第三章 基因工程的工具酶,第一节 基因工程的工具酶 第二节 DNA的切割反应,第一节 基因工程的工具酶,一、限制性内切酶（Endonucleosase） 二、 T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） 三、核酸酶 四、聚合酶 五、 DNA修饰酶,一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase）,（一）限制性内切酶的发现与分类,1）限制修饰系统： 细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰。,2）限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+SAM Mg2+ ATP Mg2+SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处,（二）II类限制性内切酶的命名及特性,命名原则,Haemophilus Influenzue d 嗜血流感杆菌d株,属名 种名 株名,H i n d III H i nd III,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点,几种最常用的限制性核酸内切酶,二、T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase）,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3端羟基和5端磷酸基因，脱水形成3-5磷酸二酯键。,三、核酸酶,作用：降解磷酸二酯键 分为：外切酶 内切酶,（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana) 单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化 （二）E. coli外切酶III 只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。,（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌） 特性： 1. 降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度 2. 降解发生的方式为内切 3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境，Zn2+激活 4. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍,（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链 （五）RNase H： 切割DNARNA杂交双链中的RNA序列，使杂交双链变成单链DNA结构,四、聚合酶,（一）,（二） Klenow酶,该酶无5-3外切活性，保留了5-3聚合活性及3-5外切活性。 基因工程中利用该酶： 修复限制性内切酶造成的5突出的粘性末端 标记DNA探针 催化cDNA第二条链的合成 末端终止法测序,3 5,G,A,新链合成方向,5,C,（三） T4 DNA聚合酶,（四）T7 DNA聚合酶 测序酶 （五） Taq DNA聚合酶 耐高温，主要用于PCR反应,DNA聚合酶活性 RNase H活性 DNA内切酶活性 核酸结合活性,（六）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA 5mRNA 5TTTTTTTTTTTTTTT 3cDNA,3AAAAAAAAAAAAAA 5mRNA 5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,反转录酶 Mg2+dNTP,反转录酶的基本特性： （RNase H） 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,5 3RNA 3 5DNA,5 3RNA 3 5DNA,3 5DNA,反转录酶,反转录酶,五、DNA修饰酶,有大量的修饰酶，主要的有以下几种： 1） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5端的磷酸基团。 2） polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5端增加磷酸基团。,5 3 3 5 ,p,p,OH,HO,3） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。,5 3 3 5,A,T,G,C,A,T,A,G,C,A,DNA重组技术中最常用的工具酶,第二节 DNA的切割反应,一、缓冲系统的组成 二、酶切操作 三、酶切结果分析 四、多酶联合酶解 五、定位酶切位点 六、 限制性内切酶的star活性,一、缓冲系统的组成,II类酶的酶活条件： Tris-HCl pH7.5, 25-50mM； 10mM MgCl2 ； NaCl 0-150mM； DTT 1mM,根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下三种情况： 高盐：100-150mM 中盐：50-100mM 低盐：0-50mM,二、酶切操作,DNA量的确定，加入酶量的确定，反应体积的确定（20l），反应时间的确定，1-1.5hr，一般为37，但也有例外，如Taq I在65C时活性最高。 单位限制性内切酶定义为：在最佳缓冲系统和20l体积中反应1小时，完全水解1gDNA所需的酶量。,三、酶切结果分析,（一） 酶切片段的检测 1） 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。,2） DNA分子的检测 a. 染色EB，DNA分子小于25ng，很难检测到。 b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子。,（二）估计DNA分子的大小 根据DNA分子的迁移率，可以用公式计算出分子量 D= a b (logM) D是移动的距离，M是分子量，a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变。 也可根据已知大小的片段进行比较，误差约在5%左右。,四、多酶联合酶解,对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解；,五、定位酶切位点,建立酶切图谱需要的酶类 确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目 进行双酶切 比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱 含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间的酶切或者在4条件下进行）,六、 限制性内切酶的star活性,在pH不合适，或甘油浓度过高10%时，限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一