课件：流式细胞术应用概述分析解析.ppt

流式细胞术应用概述,流式细胞术系列讲座之概述,流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用 免疫学检测和科研应用 肿瘤学检测和科研应用 凋亡分析 血液学检测和科研应用 其它应用,主要内容,流式细胞术的一般介绍,第 一 部 分,什么是流式细胞术？,流式细胞仪(Flow Cytometer): 是集合光电子物理，光电测量技术， 液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM): 是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。,流式细胞仪特点,多参数测量和分析（散射光和荧光）； 快速测量和分析 每秒可达1000-10000个细胞 分选纯度可达99%以上。 获取的数据分析结果更具有统计学意义； 通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒,FACSCalibur,特点： 光路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析,临床型（台式机）,流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量,细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度,流式细胞仪分析数据常见图形： （二维）点阵图 (Dot Plot),适用于：双参数分析,流式细胞仪分析数据常见图形： 直方图(Histogram Plot),适用于： 单参数分析 仅需要观察某个荧光强度的变化,流式细胞仪分析图谱,SSC（侧向散射光）-反应细胞内颗粒多少,FSC（前向散射光）-反应细胞大小,散射光信号,特征信息荧光（Fluorescence）信号,FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）,流式细胞仪分析图谱,双色直接染色,设门：选择要分析的细胞群体,设定阴性、阳性范围,流式细胞术在临床检测和科研中的应用,第 二 部 分,一、免疫学检测和科研应用,1、细胞表面分子标记 （以淋巴细胞亚群检测为例）,原理,人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。 T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4和CD8T细胞两个亚群； B淋巴细胞特异性标志为CD19； NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3 利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进而得到各亚群的比例。,T淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测： T cells, T subsets, NK cells, B cells,淋巴细胞亚群及功能,CD4+CD25+CD127-Treg检测,淋巴细胞亚群及功能,淋巴细胞亚群与疾病,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%, 表明即将或已发生排斥 CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染 0.2时, 必须停用免疫抑制剂 CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增加, 提 示巨细胞病毒感染,慢性疲劳, 感染后综合征, 纤维肌痛, 类风湿性关节炎, 过敏等,疾病预防,淋巴细胞亚群检测意义,鉴别活动期和非活动期SLE,2、胞内分子流式细胞术检测 （以Th1/Th2细胞因子检测为例）,Th1/Th2细胞,Th1/Th2细胞,Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应 引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症 刺激来源：病毒、某些细菌 Th2型介导体液免疫反应 引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、 促进I型变态反应（过敏反应） 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原,Th1/Th2细胞,PMA+Ionomycin 刺激4-6hr,流式细胞术检测胞内细胞因子,新鲜分离PBMC 加PMAIo刺激后6h 测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g,Th1/Th2失衡相关疾病,胞内寄生的病原生物感染性疾病 Th1细胞及其细胞因子 保护性免疫 Th2细胞及其细胞因子 发病，如结核病， 或慢性感染 变态反应性疾病 Th2细胞及其细胞因子 过敏性哮喘等（IgE ） 自身免疫性疾病 Th1细胞及其细胞因子 常为炎性增强的标志 Th2细胞及其细胞因子 免疫耐受/抑制有关 肿瘤免疫 Th2细胞及其细胞因子 肿瘤发病，,Th1/Th2细胞检测意义,疾病治疗,发病机制研究,使用Th1和Th2相关的细胞因子 IFN-治疗麻疯病,用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染,使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎,疾病治疗监测,二、流式细胞术在肿瘤学中的应用,肿瘤发生发展,1、DNA倍体和细胞周期分析,细胞周期和DNA倍体分析的原理,1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平,2、性细胞DNA含量为1C,3、处于增殖期至分裂期细胞由 2C增加至4C,4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C,细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量,Diploid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23,G0/G1,S,G2/M,Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21 Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19,可检测标本,新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。 冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织 常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。 通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。 蜡块包埋的标本需进行特殊处理,意义,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60,DNA倍体和S期比例-指导治疗2 卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症 -早期 (I/II期) DNA倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2 卵巢癌-晚期,2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999,2、肿瘤相关基因编码蛋白检测,P53,乳腺癌,与病理学分级有关, 并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃 癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级, 肿瘤预后, 转移及肿瘤大小密切相关,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞 淋巴, 单核细胞等 受激素或生长因子调节的腺上皮 前列腺上皮, 子宫内膜等 干细胞或增值细胞 皮肤的基底细胞, 肠上皮 寿命长的分裂细胞 神经元 胚胎组织,Bcl-2在肿瘤组织中的表达,肾脏肿瘤 肾癌, 肾盂乳头瘤, Wilms瘤, 肾嗜酸细胞瘤 前列腺癌 B细胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲状腺癌,nm23,nm23与多种肿瘤的转移及预后相关,肝细胞癌 甲状腺肿瘤 乳腺癌 结肠癌 肉瘤,CD44(CD44s/CD44v),3、 Cyclin(细胞周期蛋白)检测,P-gp在肿瘤组织中的表达,乳腺癌, 膀胱癌, 胃癌, 食管癌, 卵巢癌, 前列腺癌等,化疗前高表达,化疗后高表达,肾细胞癌, 结肠癌, 肝癌,肾上腺皮质癌, 胰腺癌等,化疗前低表达,非何杰金氏淋巴瘤, 成神经细胞瘤, 急性髓白血病等,化疗不敏感,化疗敏感,化疗不敏感,4、肿瘤多药耐药性(MDR)检测,4、凋亡检测,详见下一部分,三、流式细胞术分析凋亡,细胞凋亡与疾病的关系 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染 不足与过度并存：动脉粥样硬化,凋亡与疾病,细胞凋亡过程,在凋亡诱导因素的作用下,线粒体的膜电位改变,caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,DNA断裂 形成凋亡小体,凋亡的检测方法,1. 形态学检测 光学显微镜 荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI ) 电子显微镜 2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（可用FCM） 3.线粒体膜势能的检测 （可用FCM） 4. DNA片断化检测 （可用FCM） 5. TUNEL法 （可用FCM） 6. Caspase-3活性的检测 （可用FCM） 7. 凋亡相关分子的检测（可用FCM） 促凋亡分子: Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid 等 抑凋亡分子: Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等 8. 相关信号通路分子的检测（可用FCM）,1.磷脂酰丝氨酸外翻分析 (ANNEXIN V标记法),【原理】 细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻； Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合 ； 碘化丙啶(propidine iodide, PI)可以区分活细胞和死细胞。,结果分析,结果分析-优,结果分析-差,如何获得好的结果,细胞状态要好； 细胞处理的火候问题：药物浓度、时间需要摸索； 染色后，不能固定细胞，应尽快检测。,2.线粒体膜势能的检测,【原理】 线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡则不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 常用染料有：Rhodamine 123 、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide DiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等,结果分析,3.DNA片断化检测,通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同“DNA倍体分析和细胞周期分析”,4.TUNEL法,流式也能进行TUNEl检测，其检测原理与经典TUNEl原理基本一致。利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。 流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。,经典TUNEL法原理,结果分析,结果分析,结合细胞DNA含量分析效果更佳,5.Caspase-3活性的检测,Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子。 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。 用荧光标记的抗活化Caspase-3的抗体进行胞内染色，可以通过流式细胞术分析其活性 在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降,四、流式细胞术在血液学中的应用,1、流式细胞术白血病免疫分型,白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。 急性白血病的分型基本上分三个阶段：,FAB分型(1976) (morphology，M ),MIC分型（1986） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C ),WHO分型(2001) （MICM） (morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C) (molecular biology, M),急性白血病分型历史,急淋 （ALL）,急性白细胞FAB分型,急非淋 （ANLL） 急性髓细胞白血病(AML),L1型,L2型,L3型,M0: 微分化型髓系白血病； M1：未分化的原粒细胞白血病； M2：部分分化的原粒细胞白血病； M3：急性早幼粒细胞白血病； M4：急性粒、单核细胞白血病； M5：急性单核细胞白血病； M6：急性红血病或红白血病； M7：急性巨核细胞白血病。,MIC分型以形态学为基础、免疫学和细胞遗传学作补充，相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。,MIC分型,形态学 (morphology， M ) ：传统的骨髓片检查 免疫学 (immunology， I ) ：免疫组化 流式细胞术 细胞遗传学 ( cytogenetics，C ) ：染色体分型,利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞内的免疫标志，可准确反映白血病细胞的所属系列（TB髓）及分化程度。 检测分析时，首先根据CD45表达强弱和细胞颗粒度，在CD45-SSC图中确定幼稚或异常的细胞群体。然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率。,白血病免疫分型原理,流式细胞术白血病免疫分型优点,细胞形态学，免疫学和细胞遗传学三者相结合是当今公认的白血病分型方案，其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。流式细胞仪可方便、快速、准确地完成白血病的免疫学分型，其意义在于： 准确寻找和计数幼稚或异常的细胞群体； 用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病； 形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL），但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记； 混合性白血病； 帮助确定髓系白血病所属类型； 慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤； 微小残留白血病。,CD4、CD8、CD61、CD56、CD38,本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合,CD3CD79aMPO,可以确定白血病分别属于T/B/髓系,表面染色,胞内染色,全套,进一步细分,其它,必要时可以加用,泛白细胞标志：CD45,标本来源,（1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺,样本保存,要 求： 室温条件(16 -28 )存放； 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液体（如 生理盐水或组织培养液）。,保存时间,肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小时； EDTA抗凝标本，存放时限只有12 24小时，因为髓细胞在此条件下会裂解； 柠檬酸（ACD）抗凝的外周血标本可存放72小时以上。但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的ACD会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡,正常骨髓流式分析图,CD45/SSC 图中可见： CD45 强阳性SSC 低信号的细胞群为淋巴细胞(褐色细胞群体) 中等强度的CD45 表达SSC 信号最强的细胞群体为粒细胞(蓝色及红色细胞群体) CD45 表达与SSC 信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体(绿色细胞群体) CD45 阴性SSC 信号最低的有核红细胞和细胞碎片,根据骨髓细胞CD45/SSC 图中分布情况设门圈定各类细胞 R1 门为成熟淋巴细胞 R2 门为正常单核细胞位置 R3 门正常粒细胞位置 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置 R6 门为幼稚髓细胞出现位置 白血病细胞通常会在R4 R6 两门位置处出现,举例,B-ALL CD19、CD20、CD10、cCD72、CD34、HLA-DR阳性,M3: CD13和/或CD33阳性，CD15阳性，CD34、HLA-DR、CD14阴性，偶尔表达CD2。MPO阳性。,混合表型,目前急性白血病的分类仍较复杂，流式细胞术免疫分型能提高分型的准确性，但不是疾病的诊断。 理想分类法应该以形态学为基础，结合免疫学和细胞遗传学、分子生物学提供信息。 国际血液学家及血液病理学家2001年3月里昂会议上的造血和淋巴组织肿瘤的WHO分类法，应用MICM分类技术力求反映疾病本质，成为国际上一种新的分类标准。,白血病免疫分型总结,2、流式细胞术多发性骨髓瘤免疫检测,正常浆细胞与骨髓瘤细胞在免疫表型上存在明显差异，前者为CD38+CD19+CD56-，而后者则为CD38+CD19-CD56+/-。 此外，B系的其他标志（如CD10、CD20等），非B系标志（如CD2、CD5、CD7、CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD14等）在骨髓瘤细胞中也可能有异常表达。 因此，通过多参数流式细胞术，进行多种表面标志标记，可以很方便地区分正常浆细胞和骨髓瘤细胞，对MM的诊断和预后判断有重要价值。,【原理】,3、网织红细胞血小板检测,计数外周血中检测网织红细胞和网织血小板,4、血小板自身抗体检测,血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。,血小板活化实验,活化标志：CD62P（P选择素）、PAC-1（IIbIIIa复合物） 血小板特异性标志：CD61,5、血小板功能分析,6、夜间阵发性血红蛋白尿,正常人CD55和CD59表达完全阳性。 PNH表达分三型（以CD59为例）： I型，CD59表达完全阳性，荧光强度同正常人； II型， CD59表达部分阳性，荧光强度介于I和III型之间； III型， CD59表达完全阴性。,7、造血干细胞检测,干细胞的特征,CD34、CD45与核酸染料联合应用，通过合理的设门策略才能够准确检测CD34+干细胞比例； 也可以用相关试剂盒进行绝对计数,五、流式细胞术在科研中的其它应用,1、流式细胞术检测吞噬细胞的吞噬活性,吞噬细胞,小吞噬细胞,大吞噬细胞,中性粒细胞,单核细胞,单核细胞巨噬细胞,中性粒细胞,举例 流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能,荧光素标记细菌 中性粒细胞吞噬荧光素标记的细菌,快速、客观、重复性好,人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图,Cayman吞噬功能检测试剂盒 （可采用流式细胞仪或荧光显微镜等检测） 分析PMA刺激增加THP-1细胞株的细胞吞噬功能 方便！直观！快速！ 细胞吞噬功能涉及多发性硬化、Alzheimer、动脉粥样硬化，细菌，霉菌等众多疾病的研究，是细胞功能变化的一个重要方面。,pHrodo 噬菌作用流式分析试剂盒（100 assays）,快速标记生物微粒，用于细菌和全血的噬菌作检测。,2、免疫细胞细胞毒活性流式检测,细胞毒活性检测方法,MTT法 3H-TdR摄入法 流式法,CFSE/PI双标记法,实验原理,1.羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE、CFSE),是一种膜通透性的荧光素染料， 能与胞内蛋白中的氨基反应形成稳定的染料蛋白加合物（绿色）,2.碘化丙啶 (PI),是一种膜非通透性的荧光素染料，不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色（红色）,3.靶细胞先行CFSE染色，然后将效应细胞和靶细胞以一定的比例作用一定时间以后，加入PI，流式细胞仪检测，CFSE/PI双标记的细胞即为死亡的靶细胞。,3、流式细胞术CFSE染色分析细胞分裂增殖,Divisions: 3 2 1 0,CFSE FL-1 (Log),Divisions: 3 2 1 0,实验原理,Calculating precursor frequency 0 15