SNAP25-N蛋白高表达菌株筛选及分离纯化论文.docx

英文摘要SHANDONG 山东理工大学毕业设计（论文）题目:SNAP25-N蛋白高表达菌株筛选及分离纯化学 院：生命科学学院专 业：生物技术学生姓名：郭飞指导教师：刘翠翠毕业设计（论文）时间：2016年 3月 2 日 6 月 15 日 共 17 周IISNAP25-N蛋白高表达菌株筛选及分离纯化摘要SNAP25（synaptosomal associated protein of 25 KD，突触小体相关蛋白）是一种可溶性的N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性因子结合蛋白受体(SNARE),位于质膜的胞浆面,是由两个SNARE motif（形成SNARE复合体的结构域） 以及中间的连接部分组成。突触小体相关蛋白能够介导神经细胞中在神经突触上发生的囊泡的融合，在神经递质的释放中具有重要作用。 SNARE motif 结构域是由四条-螺旋组成的，呈正向平行排列互相结合为排列紧密的杆。这四条 -螺旋中，其中一条来自VAMP，一条来自 Syntaxin，一条来自SNAP25的N端结构域（SNAP25-N），一条来自SNAP25的C端结构域（ SNAP25-C）。SNARE复合体参与囊泡融合，参与囊泡的对接及融合，以及由囊泡和细胞膜参与的胞吐行为。SNAP25-N蛋白对囊泡转运、突触融合及细胞信号转导有重要意义。连接部分具有四个半胱氨酸，半胱氨酸通过棕榈酰化将SNAP25锚定在靶膜附近。这意味着SNAP-25不含有跨膜结构域。实验的目的是通过对SNAP25-N蛋白菌种的活化，单克隆培养，诱导表达等过程，筛选出具有高表达量的SNAP25-N菌株，其中要通过调节培养的温度、培养的时间、转速、诱导剂的量等条件来选育出能够表达出目标蛋白SNAP25-N的高产菌株。进而利用摸索出的条件进行扩大培养，获得大量目标菌液，进行离心、细胞破碎，然后通过柱层析法获得所需要的目标蛋白，应用SDS-PAGE凝胶电泳来检测所获得的目标蛋白是否正确,并且检测杂蛋白是否洗净。最后选取含量较高的蛋白溶液通过标准曲线测得蛋白浓度。通过实验，在操作过程中掌握相关的实验方法，熟练仪器的使用，规范的实验操作，提高实验能力。关键词：SNAP25-N、高产菌株、扩大培养、蛋白含量AbstractSNAP25 is a kind of soluble N - ethyl maleic imide sensitivity factor binding protein receptors, located in the cytoplasm of plasma membrane surface, is made up of two c2-style motif, and in the middle of the connection parts. Synaptic corpuscle related protein plays an important role in the neurotransmitter release, can be mediated the fusion of the synaptic vesicle.Domain c2-style motif structure is composed of four alpha helix, positively to parallel arrangement in combination with each other for closely packed rod. These four alpha helix, one from the VAMP, from a Syntaxin, a from SNAP25 n-terminal domain structure, a from SNAP25 the c-terminal domain structure. C2-style complex in vesicle fusion, participate in the docking and fusion, and by the vesicles and participate in the membrane cell behavior. SNAP25 -n and vesicles transhipment, synaptic fusion protein and cell signal transduction. Connection part has four cysteine, homocysteine through palm acylation anchor SNAP25 near the target film. This means that the SNAP - 25 does not contain transmembrane domain structure.Is the purpose of the experiment through activation of SNAP25 - N protein strains of monoclonal culture, induced process, such as filter with high expression of SNAP25 -n strains, to adjust the cultivation of the temperature, time, speed, breeding conditions such as amount of inducers to able to express the high-yield strains of target protein SNAP25 - N. Then figure out the conditions for expanding training, get a lot of target bacteria liquid, centrifugal, cells, and then by column chromatography to obtain the required target proteins, using sds-page gel electrophoresis to detect the target protein is correct and miscellaneous protein obtained if wash. Lastly, high content of protein solution by standard curve measured protein concentration. To grasp the method of experiment, through the experiment of skilled instrument use and specification of operation, improve the ability of experiment.目录目录第一章 引言11.1 课题的背景和意义11.2 研究进展11.3 研究目的2第二章 实验方法32.1 仪器和试剂32.1.1 实验仪器32.1.2 实验试剂42.2主要试剂配方52.2.1 LB液体培养基52.2.2 LB固体培养基52.2.3 IPTG52.2.4 10XSDS-PAGE上样缓冲液（Loading Buffer）62.2.5 SDS-PAGE胶体相关溶液配方61、配胶82.2.6 脱色液82.2.7 裂解缓冲液82.2.8洗涤缓冲液92.2.9洗脱缓冲液92.3 实验过程92.3.1 SNAP25-N蛋白高表达株筛选92.3.2 菌种扩大培养102.3.3 目标蛋白的提取112.3.4 目标蛋白浓度检测11第三章 实验结果133.1 单克隆培养133.2诱导表达133.3 SNAP25-N表达测试133.4 SNAP25-N蛋白检测143.5 标准曲线构建15第四章 实验结论与讨论164.1 实验结论164.2 实验讨论16文献翻译193第一章 引言第一章 引言1.1 课题的背景和意义SNAP25即突触小体相关蛋白主要存在于中枢神经系统的蛋白质，与其共源的膜蛋白突触小泡蛋白（VAMP），质膜蛋白突触融合蛋白（syntaxin）,这三者被称为突触小体相关蛋白受体（SNARE）蛋白，在介导突触小泡和融合方面有重要作用。SNAP25在进化上属于保守的蛋白质，具有60个氨基酸组成的保守序列组成的中心，共具有206个氨基酸残基，不具有跨膜区。SNAP25在钙离子依赖的神经递质释放的过程中，能够通过本身序列中部的丝氨酸残基来锚定在膜泡上，以此来提高区域蛋白浓度，引导形成足够的SNARE复合物，进而帮助细胞外分泌过程的进行。SNAP25分布在神经末梢以及神经轴突膜上。VAMP作为首位发现的SNARE核心成员，具有相当高的保守性。VAMP2是最具代表性的同工型，此外还包括VAMPl和VAMP3。其中VAMP被证实是神经系统所特有的，而VAMP2和Cellubrevin则在不同细胞内广泛分布。Syntaxin质膜蛋白突触融合蛋白分布在神经细胞突触前膜上，是一种特异性地的跨膜蛋白。早期被作为分子量为35 kD的synaptotagmin-1结合蛋白,但随后发现是一种与细胞质膜融合相关的关键蛋白。Syntaxin通过与SNAP25和VAMP蛋白聚合,进而形成SNARE复合体。SNARE(soluble NSF attachment protein receptors)复合体，是神经突触中介导囊泡融合的核心蛋白，由VAMP、syntaxin和SNAP25三种蛋白组成的。SNARE复合体是发挥细胞膜融合作用的关键部分，介导神经细胞突触内的囊泡和突触前膜的融合。在神经末梢中钙离子所引发的神经递质的释放需要三种SNARE蛋白VAMP、syntaxin、SNAP25来介导融合过程的发生。SNARE蛋白形成螺旋复合体能够提供融合所需要的能量及驱动力。该螺旋复合体是由VAMP和syntaxin的胞质部分同SNAP25形成一个四螺旋复合体，其中SNAP-25蛋白提供两个-螺旋，而Syntaxin蛋白和v-SNARE蛋白各提供一个-螺旋，在复合体的核心区域中包裹了大量的疏水氨基酸残基，这些残基间的疏水作用对SNARE复合体结构具有稳定作用。VAMP结合在-螺旋 SNAP-25 C端附近，而syntaxin结合- 螺旋SNAP-25 N端附近。虽然利用X射线晶体学方法SNARE核心复合体的结构已经被解析出来，但是SNARE蛋白如何与其他蛋白协同诱发囊泡融合的机制仍然不清楚。1.2 研究进展1987年，对早期细胞高尔基体内囊泡运输相关分子的研究时鉴定出非常重要的NSF蛋白，它在分泌囊泡中由供体向受体亚细胞结构运输中必不可少。随后的研究发现NSF不能直接与高尔基体膜相互作用，而是需要接头蛋白，称为SNAP(Soluble NSF Attachment Protein)。随着不断地研究发现，在运输泡膜及细胞质膜上发现了受体蛋白SNARE。1988年，Trimble等人在电鳐发电器官的神经末梢发现VAMP。到90年代，泡膜的分泌机制的研究得到了突破性的进展, 从而发现了复合体SNARE，是细胞分泌的关键性蛋白，这种蛋白与包括内分泌细胞、免疫细胞、神经元细胞在内的各种细胞的分泌发生有关。在突触融合过程中的研究中发现了许多相关的SNARE蛋白。到1993年，SNAP-25，Syntaxin等核心蛋白也被相继发现 。2013诺贝尔生理学奖获得者美国的科学家詹姆斯罗思曼、兰迪谢克曼以及德国的科学家托马斯祖德霍夫，他们通过实验及假设等方法发现了细胞的囊泡运输调控机制。他们根据大量的研究结果构建起囊泡融合模型。詹姆斯罗斯曼和同事根据各种现象及实验研究提出了SNARE假说：他们发现动物细胞融合需要可溶性蛋白NSF和可溶性NSF附着蛋白SNAP的参与。罗斯曼的假设中提出，膜融合的特异性是由SNAP受体蛋白即SNARE提供的。每一种运输囊泡中都有一个特殊的V-SNARE视为供体，能够与目标膜上的T-SNARE受体相互作用识别。当受体与供体相互结合时，囊泡和目标膜才会相互融合并形成稳定的结构。托马斯聚德霍夫在神经突触的研究中有重大贡献。他发现了突触结合蛋白，是一种跨膜蛋白。当囊泡上的突触结合蛋白与细胞中的钙离子结合时，囊泡就会与SNARE等蛋白的相互作用，根据不同的信号快速或缓慢地释放出神经递质。除了突触结合蛋白之外，聚德霍夫还发现了SNARE蛋白家族中的其他成员（如SNAP-25），以及包括RIM蛋白和Munc蛋白在内的与协助囊泡释放神经递质相关的蛋白质。这些发现支持并丰富了由罗斯曼的提出的SNARE假说，从而让使得囊泡转运的分子机制变得更加清楚。1.3 研究目的本实验的研究目的是获得具有高表达量SNAP25-N的菌株进而获得大量目标蛋白。首先进行大肠杆菌菌种的活化，然后通过活化的菌株进行涂布培养，挑单克隆，随后进行诱导表达，通过调节培养的温度、培养的时间、转速、诱导剂的量等条件来选育出能够表达出目标蛋白SNAP25-N的高产菌株。用SDS-PAGE凝胶电泳来判断所诱导得到的菌株是否含有目标蛋白。获得菌株后，对高表达菌株进行扩大培养，通过菌体破碎，柱层析的方法提取所需要的蛋白。同样，通过SDS-PAGE凝胶电泳查看过滤得到的蛋白溶液是否为目标蛋白以及其纯度。最后通过绘制标准曲线，根据得到的吸光度值来计算所得到的SNAP25-N蛋白溶液的浓度。通过菌种活化，使在-80保存的原菌重新获得生长分裂的活性，能够更好地进行培养。将菌液平板涂布获得菌株，从中选取单独的生长良好的菌株挑取进行培养，一般将菌株培养4小时左右即可得到对数生长期的菌液，对对数生长期的菌株进行诱导更便于培养筛选出目标蛋白的高产菌株。对挑出的菌株进行诱导，记录好诱导的时间、诱导的温度、诱导剂的量、摇床的转速等条件，随后可通过SDS-PAGE凝胶电泳来判断是否成功诱导出目标菌株，若诱导成功，则使用相应的条件来进行后期的扩大培养；若未培养成功，则需要调节诱导条件，例如延长诱导时间，增加诱导剂的量，提高培养温度，增大诱导时的转速等条件，通过调节诱导的条件，进而摸索获得最佳诱导条件，获得SNAP25-N蛋白高表达菌株，同时保存好菌种。注意记录各个变量。在随后的扩大培养中，利用摸索出的诱导条件使用保存好的菌种进行培养，获得大量SNAP25-N蛋白高表达菌株，通过离心收集SNAP25-N菌株，随后将收集菌株进行超声破碎，使高表达菌株内的目标蛋白释放出来，便于进行收集SNAP25-N。将破碎的菌株进行离心，取上清液，目标蛋白及各种杂蛋白存在于上清液中，将沉淀的菌株碎片及杂质分离出来。将收集的上清液进行过柱，通过柱层析法来分离目标蛋白与杂蛋白，继而分离出目标蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定所收集目标蛋白的正确性及纯度。对于所收集的目标蛋白的浓度的测定则可以通过构建浓度和吸光度标准曲线计算得出。同时，在实验过程中，通过掌握实验方法，摸索实验条件，熟练各种仪器的使用及相应的操作规范，提高自身的实验思维和实验能力。第二章 实验方法第二章 实验方法2.1 仪器和试剂2.1.1 实验仪器仪器名称型号仪器来源电子天平JY 2002上海舜宇恒平科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KBS上海申安医疗器械厂磁力搅拌器98-1上海精科实业有限公司离心机TG16A-WS上海卢湘仪有限公司制冰机涡旋混合器QL-866东业机电工贸有限公司东亚牌液氮容器5933乐山市东业机电工贸有限公司旋转蒸发器RE 52-99上海亚龙生化仪器厂数控超声波清洗器KQ-200KDB昆山四超声仪器有限公司超声波细胞破碎机JY-96N宁波新芝生物科技股份有限公司凝胶成像仪Protein simple电热鼓风干燥箱GZX-9030MBE上海博迅实业有限公司电热恒温水浴锅HH-6国华电器仪器公司超纯水机UPR-11-5T成都超纯科技有限公司PH计UB-7赛多利斯电泳仪DYY-6C北京六一仪器厂基因扩增仪2720基因有限公司双人净化工作台SW-CJ-1D上海苏净实业有限公司冰箱海尔BCD-228BFA青岛海尔集团超低温冰箱Thermo恒温培养箱HZQ-F160A上海一恒科技有限公司超纯水机UPR-11-5T成都超纯科技有限公司酶标仪Thermo电磁炉九阳有限公司另外，还需要的仪器有培养皿，锥形瓶，试管，量筒，烧杯，玻璃棒，酒精灯，涂布棒，牙签，移液枪，枪头，滤菌膜，EP管，封口膜，橡皮筋，记号笔等。在使用仪器时要认真阅读各种仪器的使用方法及注意事项，做好实验前准备，使用完仪器后做好使用记录，处理好实验的痕迹，清理好实验仪器，便于下一次的使用。2.1.2 实验试剂药品名称纯度/规格药品来源无水乙醇99%烟台双双化工有限公司氯化钠BR天津市永天化学试剂有限公司冰乙酸99%天津市富宇精细化工有限公司盐酸BR烟台双双化工有限公司胰蛋白胨AR北京奥博星生物技术有限责任公司酵母浸粉AR北京奥博星生物技术有限责任公司丙烯酰胺AR济南朋远生物技术有限公司甲叉双丙烯酰胺AR济南朋远生物技术有限公司十二烷基硫磺钠AR济南朋远生物技术有限公司三羟甲基甲烷AR济南朋远生物技术有限公司过硫酸铵AR莱阳化工实验厂溴酚蓝BR天津市福晨化学试剂厂-巯基乙醇BR北京普博欣生物科技有限责任公司磷酸氢二钠BR天津市凯通化学试剂有限公司琼脂糖BR广州正一科技有限公司卡纳青霉素AR扬州制药厂IPTGAR天津市福晨化学试剂厂N-(2-羟乙基)-N-（2-乙硫酸）BR源叶生物有限公司ImidazoleARSolarbio-MereaptoethanolAR烟台双双化工有限公司2.2主要试剂配方2.2.1 LB液体培养基Ttyptone10gYease Extract5gNacl10g配置LB液体培养基时，以1L为例，按照比例称取Ttyptone 、 Yease Extract 、Nacl ，加入蒸馏水只提及为1L，放入转子，用磁力搅拌器混匀至溶液变得澄清，加入200L 5mol/L的NaOH溶液调节至PH值为7.0，补充失去的水分，定容至1L。 2.2.2 LB固体培养基Ttyptone10gYease Extract5gNacl10gAgar15g配制1升的LB固体培养基，称取胰蛋白粉10g，酵母粉5g，NaCl 10g，在磁力搅拌器上将溶质完全溶解，加入200L 5mol/L的NaOH溶液调节至PH值为7.0，加入蒸馏水定容至总体积为1L。配制LB固体培养基时在液体培养基的基础上中加入1.5-2的琼脂，并且煮沸融化，完全溶解后补足失去的水份。2.2.3 IPTGIPTG为异丙基硫代-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中加入2g IPTG摇匀使其完全溶解，加入蒸馏水定容至10ml，再用0.22m的滤器过进行滤除菌，将过滤后的IPTG分装到1ml的EP管中，贮存于-20。2.2.4 10XSDS-PAGE上样缓冲液（Loading Buffer）各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml0.125M Tris15.1g1.25M glycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】 称取15.1gTris，94.0g甘氨酸，5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水充分搅拌将其混匀溶解，再加入蒸馏水定容至1000ml，在室温下保存。使用前稀释10倍，可得10XSDS-PAGE上样缓冲液。【注意事项】 配制好的电泳液放置在室温下，使用时间不要超过两周。 使用过的电泳缓冲液可以回收，回收后的电泳液可再使用1-2次，根据电泳液的清澈程度酌情回收，若实验要求较高，最好重新配置。2.2.5 SDS-PAGE胶体相关溶液配方2.2.5.1 10%过硫酸铵的配制（1ml）：1.称取0.1g过硫酸铵； 2.加入1ml的蒸馏水，将固体粉末摇匀彻底溶解；3.贮存于4。注意：10%的过硫酸铵要现配现用，配好过硫酸铵的溶液放置于4冰箱中保存，可使用2周左右，超过时间催化效果下降需要重新配置。2.2.5.2 30%聚丙烯酰胺溶液-30%（w/v）Acrylamide各组分及浓度 各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)30%Acr-Bis(29:1)1000ml100ml 29%Acrylamide(丙烯酰胺)290g29g 1%BIS(N,N-亚甲丙烯酰胺)10g1g【配制方法】 以100ml为例 称取29g丙烯酰胺和1gN,N-亚甲丙烯酰胺溶于37左右的蒸馏水中，总体积为60ml，用玻璃棒充分搅拌溶解，加入蒸馏水定容至体积为100ml。用0.45m微孔滤膜过滤杂质、除菌，配置好后储存于棕色玻璃瓶中，放入4冰箱中，避光保存，Acrylamide于光照或碱性条件下可以发生脱氨基反应。用PH计测试PH值不超过7.0，隔几个月须重新配制。使用时若存在沉淀要进行过滤。 【保存条件】 4冰箱中保存，避光。 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，通过皮肤吸收，具有累积性作用。称取丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应配戴手套、面具。聚丙烯酰胺无毒，应小心操作，配置好的溶液中可能含有少量未聚合的物质。2.2.5.3 分离胶配方15%Gel 各种组分名称5ml10ml5ml20ml25ml30ml40ml50ml 尿素1.12.33,44.65.76.99.211.530%Acrylamide2.55.07.510.012.515.020.025.01.5M Tris-HCl1.32.53.85.06.37.510.012.510%过硫酸铵(AP)0.050.10.150.20.250.30.40.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 2.2.5.4 浓缩胶配方 各种组分名称1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10ml 双蒸水0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acrylamide0.170.380.50.670.831.01.31.71.0M Tris-HCl0.130.250.380.50.630.751.01.2510%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.110% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.011、配胶 配胶需要根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。本实验选取15%的Gel。 2、凝胶板的配制 分离胶的制备： 按表配制20mL10%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用5ml移液枪加入凝胶液，凝胶液加入长、短玻璃板之间的缝隙中，加到距离短板上段1.5-2cm处，用1mL移液枪吸取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入到分离胶上层，约加到短板顶端即可，进行水封。大概30min后当水层与分离胶层间出现明显界线，则分离胶完全凝固。倒掉水层，用滤纸条吸去多余的水分。 浓缩胶的制备： 按表配制10mL3%的PAA，混匀，用5ml移液枪将浓缩胶加到已凝固的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约0.5cm处，随后轻轻将模板插入到浓缩胶中，约30min后浓缩胶凝固，再放置2030min，用手扶住模板两端将梳子慢慢拔出，要用力均匀，随后将胶板放入电泳槽，导入电泳缓冲液，电泳槽内缓冲液应没过短玻璃板，电泳槽外缓冲液要没过电极丝，随后可准备加入样品。2.2.6 脱色液乙酸100ml乙醇50ml蒸馏水850ml将胶体用考马斯亮蓝染色大概两小时取出，回收考马斯亮蓝染液，将胶体放入配置好的脱色液中，脱色液要没过胶体，放置在摇床上，根据加入脱色液的量适当调整转速，约脱色到胶体上的底色脱掉，可以清晰地看到条带，若脱色不明显可以适当加热。使用后的脱色液不可回收。2.2.7 裂解缓冲液HEPES50mMNaCl40mM10%glycerol100ml -ME2mM首先加入50mM HEPES、400Mm NaCl、10%glycerol，定容至1L,加入转子，用磁力搅拌器混匀，使用PH仪测溶液的PH，加入NaOH调节PH至7.6 。随后用真空抽滤机对溶液进行抽滤，2mM-ME在使用时加入。将溶液与-4保存。2.2.8洗涤缓冲液HEPES50mMNaCl40mM10%glycerol100ml -ME2mM imidazole20mM先按照配置裂解缓冲液的方法配置出溶液，再加入20mMimidazole,搅拌均匀。于-4保存。2.2.9洗脱缓冲液HEPES50mMNaCl40mM10%glycerol100ml -ME2mMimidazole400mM首先取配置好的裂解缓冲液1L，再加入400mMimidazole，混匀，于-4保存。2.3 实验过程2.3.1 SNAP25-N蛋白高表达株筛选1. 实验准备：准备100mL锥形瓶、500mL锥形瓶、培养皿、小烧杯、牙签、枪头、EP管若干，80%甘油、无菌水各一瓶，按照LB固体培养基配方，LB液体培养基配方分别配置适量。将LB液体培养基分装50ml到100ml锥形瓶中，准备一瓶；准备5瓶含有LB液体培养基20ml的锥形瓶5瓶，并准备5个空锥形瓶，用封口膜封好。将包装好的实验器材、试剂、培养基等放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌备用。2. 菌种活化：从80冰箱中取出SNAP25-N蛋白原始菌株，于20冰箱取出100mg/ml抗生素kanamycin，于室温下融化，取灭好菌的含有50ml的LB液体培养基锥形瓶。实验要在超净工作台中进行操作，处于无菌条件下。用移液枪取20ulSNAP25-N蛋白原始菌液，25ulkanamycin接种到50mlLB液体培养基中，混匀。将处理好的锥形瓶放入恒温摇床中，调节温度为37，转速为200rpm，震荡培养过夜。3. 涂布平板：取灭好菌的LB固体培养基，放入微波炉中融化，待降到一定温度后，同样于超净工作台中操作，在LB固体培养基中加入抗生素，混匀，每100ml加入50ulkanamycin，在培养皿中倒入适量培养基。随后取活化的菌液100ul于EP管中，加入900ulLB液体培养基，混匀后从该EP管中再取出100ul于另一个EP管中，再加入900ulLB液体培养基，混匀，再如此反复操作2次，将菌液稀释104倍，于最后一EP管中取50ul涂平板，涂好后用封口膜封好，标上日期，菌种名称等信息，放入37恒温培养箱中培养过夜。4. 挑单克隆：于超净工作台在操作，取出5瓶含有20ml的LB液体培养基的锥形瓶，分别加入10ulkanamycin并混匀。从平板上用灭菌的牙签挑取生长良好的单个菌株，将牙签放入含有20mlLB液体培养基的锥形瓶中，分别将锥形瓶和挑取菌株的的地方对应好标上序号1、2、3、4、5，将锥形瓶放入恒温摇床中，调节温度为37，调节转速为220rmp,培养78小时。5. 菌株诱导：分别从1、2、3、4、5号锥形瓶中取出200ul菌液与96孔板中，按顺序加好，再加入200ul蒸馏水作为对照，将96孔板放入酶标仪中，测得OD600时的吸光度值，待细菌生长到OD600=0.6-0.8时，从每个锥形瓶中取出0.8ml菌液加入到EP管中，再加入0.2ml80%甘油，混匀，在EP管上标记号序号、名称1、2、3、4、5，放入80冰箱中保存。分别从锥形瓶中取出10ml菌液于灭好菌的空锥形瓶中，标号序号、，再加入5ul诱导剂IPTG进行诱导培养，1、2、3、4、5号锥形瓶作为对照。将锥形瓶放入摇床中培养，设置温度为30，转速为150rpm,恒温培养过夜，大概需要培养15小时。6. SDS-PAGE凝胶电泳：分别从1、2、3、4、5、锥形瓶中取出1ml菌液于1ml的EP管中，并标号序号。放入离心机中12000rpm离心10min，弃掉上清液，随后分别加入50ul蒸馏水、50ulloagingbuffer，使用涡旋混合器混匀，放入沸水中煮10min，将EP管上水分擦干，放入离心机12000rpm离心10min，取10ul上清液上样跑SDS-PAGE凝胶电泳。观察蛋白的表达情况，根据电泳图像找到高表达菌株。2.3.2 菌种扩大培养1. 实验准备：准备500ml大锥形瓶、100ml小锥形瓶若干；按照配方配置LB液体培养基4L,将4L培养基进行分装加入500ml锥形瓶中，为充分混合每个锥形瓶中加入200ml培养基。将分装好的锥形瓶放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌备用。2. 高表达菌种活化：从80冰箱中取出之前保存的高表达菌株，放在室温下融化，同样在无菌环境中操作,于含有50mlLB液体培养基的锥形瓶中加入25ulkanamycin以及20ul高表达菌株的菌液。将锥形瓶放入恒温摇床中培养过夜，对菌种进行活化，设置温度为37，转速为200rpm。3. 菌种扩大培养：将分装好的含200mlLB液体培养基的锥形瓶放入超净工作台，每个锥形瓶中分别加入5ml活化好的高表达菌株的菌液，再加入100ulkanamycin，放入摇床中培养，培养条件以高表达菌株筛选时所需条件为准。将摇床温度设置为37，转速设置为220rpm，恒温培养大概7-8小时。4. 诱导表达：取出锥形瓶，在无菌条件下进行操作，在每个锥形瓶中加入100ulIPTG进行诱导，随后放入恒温摇床中，调节温度为30，150rpm，诱导过夜。5. 菌体提取：将诱导后菌液转入离心瓶中，放入低温超速离心机中，使用前对离心机进行预冷，5000rpm，离心15分钟，弃上清，将沉淀在瓶子底部的菌体用适量缓冲液冲起，转入小离心管中，放入离心机中7000rpm，离心5min，弃上清。将得到的菌体沉淀标好名称放入-80冰箱中保存备用。2.3.3 目标蛋白的提取1. 悬浮菌体：于-80冰箱中取出收集的菌体，加入适量裂解缓冲液，置于冰盒中，静置15min，整个过程的操作需要在4条件下进行，避免蛋白变性。静置后用移液枪或涡旋震荡，使菌体重新溶解，溶解过程中避免起泡。2. 裂解菌体：将溶解的菌体转入大小适当的小烧杯中，加入0.5ml（1mM）PMSF即蛋白酶抑制剂、0.1g溶菌酶（称取0.1g溶菌酶用HEPES溶于1mlEP管中），用移液枪进行吹打混匀。于冰上静置15min使溶菌酶充分发挥作用，使用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎，破碎1h，破碎期间防止起泡可加入适量PMSF。3. 裂解液离心：将破碎完成的菌液移入离心管中，配平到小数点后3位，于超速离心机中，4，15000rpm，离心1h30min。先用5ml移液枪吸取上清，再用1ml移液枪吸取底部沉淀，避免吸取沉淀。4. 蛋白与柱材结合：首先进行柱材平衡，将Ni-NAT柱材先用5倍体积蒸馏水冲洗两次，再用5倍体积的裂解缓冲液平衡两次。将平衡好的柱材用移液枪移入装有上清液的离心管中，在4条件下旋转混合1h，使蛋白与柱材充分有效结合。5. 洗脱杂蛋白：将充分混合后的蛋白与柱材混合液过柱，随后用洗涤缓冲液冲洗柱材，用考马斯亮蓝染液检测滴下的洗脱液，直到考马斯亮蓝染液不变色完成洗涤杂蛋白，大概需要400ml洗涤缓冲液。6. 洗脱目标蛋白：杂蛋白洗涤完成后，用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，每次在层析柱中加入1ml洗脱缓冲液，并用EP管收集滴下的蛋白溶液，逐次洗脱。期间用考马斯亮蓝检测滴下的蛋白，当考马斯亮蓝染液变色不明显时停止洗脱。将收集的EP管按收集顺序标好序号、蛋白名称，蛋白先用液氮进行速冻，随后放入-80冰箱中保存。7. SDS-PAGE检测：从收集的EP管中每管中分别取出5ul蛋白溶液，再加入5ulloadingbuffer，混匀，按顺序上样跑电泳。通过电泳条带检测所收集目标蛋白是否正确及蛋白的的纯度，同时分辨出含较高浓度目标蛋白的EP管。2.3.4 目标蛋白浓度检测1. 标准曲线绘制：取出适量5mg/ml的BSA，用缓冲液稀释为0.5mg/ml，再将0.5mg/ml的BSA分别稀释为0.45 mg/ml、0.40 mg/ml 、0.35mg/ml、0.3 mg/ml、 0.25mg/ml、0.20mg/ml、0.15 mg/ml、0.10mg/ml，每个浓度各取20ul，再分别加入200ulG250染液，混匀，于室温下放置3-5min。将混匀后的溶液移入96孔板中，随后用酶标仪测试在A595时的吸光度值 。将获得的吸光度值与浓度为横纵坐标，蛋白吸光度值为纵坐标，BSA浓度为横坐标，绘制标准曲线。2. 蛋白浓度测量：于-80取出含目标蛋白浓度高的EP管，构建浓度梯度，分为不稀释、稀释10倍、稀释102倍、稀释103倍。各取20ul，再加入200ulG250染液，于室温静置3-5分钟，加入96孔板测试A595时的吸光度值。通过获得的吸光度值与标准曲线对比，从而根据公式计算得目标蛋白的浓度。12第三章 实验结果第三章 实验结果3.1 单克隆培养图3-1单克隆培养将原菌进行稀释培养平板涂布，于平板上选取独立生长良好的菌株，用牙签挑取放入锥形瓶中培养。3.2诱导表达序号OD值0.6100.6360.6430.6780.310表3-2 OD值经过7-8小时诱导后，用酶标仪测试每个锥形瓶中菌液在OD600时的吸光度值，实验需要将处于对数生长期的菌体进行诱导，才可以达到较好的效果，对数期即在A600是吸光度值达到0.6-0.8，由表2.3.1-1可知，、号锥形瓶中菌液达到标准，号锥形瓶数值过小，故而舍弃号锥形瓶。3.3 SNAP25-N表达测试图3-3 SDS-PAGE凝胶电泳将诱导后的菌液经过loadingbuffer处理，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分为对照组1、2、3、4和实验组、，对照组不加诱导剂IPTG，实验组加IPTG，目标蛋白位于kDa15处，由图可知，实验组于目标蛋白处出现明显条带，可筛选出高表达菌株。3.4 SNAP25-N蛋白检测SNAP25-N图3-4 SNAP25-N SDS-PAGE电泳通过柱层析法洗脱下的目标蛋白用loadingbuffer处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳。验证是否得到目标蛋白以及目标蛋白的含量，通过电泳图可知，1、2、3、4、5、6号管中均含有目标蛋白SNAP25-N，其中2号管中含量最高。3.5 标准曲线构建图3-5 蛋白浓度标准曲线 即当提取的蛋白稀释100倍时，浓度为0.419mg/ml,所以蛋白提取液的浓度为41.9mg/ml。15第四章 实验结论与讨论第四章 实验结论与讨论4.1 实验结论1.实验通过对目标蛋白SNAP25-N进行菌种活化，涂布培养，挑取单克隆进行培养，随后加入IPTG进行诱导表达，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测所获得的菌株是否具有较高的SNAP25-N蛋白表达量，并且可以通过电泳图得知表达量的高低，根据电泳图所获得的结果，对诱导条件进行调整，提高了诱导时的温度，从20调整到30，延长了诱导的时间，由4小时延长为15小时，培养时的转速不变，为150rpm，诱导剂浓度不变，仍为1ug/ul通过电泳结果得知，目标蛋白SNAP25-N表达效果较好，因此得知诱导时的最佳条件为IPTG浓度为1ug/ul温度30，转速150rpm,诱导时间15小时。2.将经过扩大培养后收集的菌体进行离心破碎等步骤，获得蛋白提取液，通过亲和层析提取出目标蛋白SNAP25-N，并用SDS-PAGE凝胶电泳检测所获得的目标蛋白，根据图3-4可得知，提取的目标蛋白中在分子量为55左右的位置有少量杂蛋白；所获得的蛋白中第2管收集的SNAP25-N蛋白的含量明显高于其他EP管收集的蛋白含量。3.通过稀释BSA构建浓度梯度，获得蛋白标准曲线，根据3-4的电泳图可知第二管SNAP25-N蛋白含量较高，测试第二管的SNAP25-N蛋白浓度，根据获得的标准曲线公式，将蛋白稀释100倍后获得的吸光度值1.000代入公式，计算得出稀释100倍时SNAP25-N的浓度为0.419mg/ml,所以第二管SNAP25-N蛋白提取液的浓度为41.9mg/ml。4.2 实验讨论针对本次实验过程中出现的问题进行讨论及分析。1.在进行平板涂布时，对活化的菌液进行稀释，开始时稀释1000倍取100ul进行涂布，培养后菌株生长过密，无法挑取单克隆，随后继续稀释，稀释10000倍，取50ul进行涂布，生长出的菌株浓度适中，可以进行单克隆的挑取，可以进一步减少涂布使用菌液的量，采用20ul，稀释10000倍时涂布效果较好。2.在对挑取单克隆进行培养时，开始时用牙签挑取菌株后放入试管中进行培养，一般菌株在4小时左右可以达到对数生长期，菌液较为混浊，可以进行下一步的诱导表达培养，然而用试管进行培养4小时后菌液依然澄清，未达到较好的效果，延长培养时间也无法达到对数生长期，无法进行下一步实验，对实验现象进行分析，试管较小，不能充分将菌液摇起来，菌株无法正常生长，故而将试管换成小锥形瓶进行培养，放入摇床后可以充分将菌液摇起，在时间范围内可达到对数生长期。3.进行诱导表达时，根据参考数据加入诱导剂，设置条件为37，150rpm，诱导表达4小时，将诱导表达后的菌液各取1ml进行破碎加热处理，通过SDS-PAGE凝胶电泳进行判断，未出现目标蛋白的高表达菌株，进一步调节诱导条件，延长诱导时间，由于时间限制，将菌株诱导过夜，时间过长，故而适当降低温度，30，150rpm，诱导过夜，大概诱导14小时左右，取菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳后，于目标处出现明显条带，成功诱导，获得菌株的诱导条件，同时获得高表达菌株。4.进行SDS-PAGE凝胶电泳时，注意分离胶和浓缩胶的配置，配置分离胶时使用尿素，而浓缩胶则使用双蒸水，可以达到较好的效果。胶体的配置过程中注意所需要配置的比例，在浓缩胶中插入模具后，由于浓缩胶未完全凝固就将模具拔出，加样后样品为在分离胶与浓缩胶分界出形成一条直线，导致失败。在接下来的实验中注意胶体完全凝固后再拔出模具。在安装胶板是要放平卡紧，防止漏胶，注入分离胶时在短板下大概1.5cm处，由于目标蛋白的条带位置较靠下，分离胶过短无法出现目标条带。电泳最后要让样品直线跑到离胶板底部，防止无法出现目标条带。5.扩大培养时注意时间的分配，所需要的菌液总量较大，需要分批培养。6.将收集到的目标菌株进行离心，于-80取出后进行处理，在整个提取蛋白的过程中需要在4的条件下进行，防止蛋白变性，故而整个过程在冰上操作，将收集的菌体重新溶解过程中，需要用移液枪反复吹打，要注意避免出现气泡影响实验结果。在使用超声波破碎菌体过程中若出现气泡，则加入适量PMSF防止起泡。7.将提取出的蛋白提取液进行过柱时，要将蛋白溶液与柱材充分混合进行过柱，使用洗涤缓冲液将杂蛋白洗脱下来，注意检测洗脱下的洗脱液，当无法使考马斯亮蓝染液变色时洗涤完成，一定要把杂蛋白洗净，或影响后面的标准曲线的构建。参考文献:1 刘昊，史晶，蔡昆，高翔，侯晓军，王慧.SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定.中图分类号:R996.1.文章编号:1000-5501(2009)03-0228-032Pevsner J, Hsu SC, Braun JE, Calakos N, Ting AE, Bennett MK, Scheller RH (1994). 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