杀虫微生物学课件_2

蝽象上的蜡蚧轮枝孢（Verticillium lecanii）,七、虫霉目(Entomophthorales) 虫霉目杀虫真菌典型的特征是，分生孢子单个发育成熟后通常被强有力地弹出，其菌丝体由多核的菌丝组成，菌丝内很少有横隔膜，而半知菌等其它杀虫真菌的菌丝中有横隔膜。菌丝壁较厚，主要由无色的或者红色的几丁质组成。虫霉目真菌大约有160多种，其中有120种以上对昆虫寄生性强，能侵染直翅目、等翅目、鞘翅目、鳞翅目、双翅目和膜翅目的多种昆虫，并曾在世界各地引起过多例昆虫种群的流行病，被普遍认为是很有前途的微生物杀虫剂。虫霉目中科的分类争议很大，大多数人认为主要由六个科组成，即:虫霉科(Entomophthoraceae)、蛙粪霉科(Bas;diobolaceae)和新月霉科(Ancylistaceae)、蕨霉科（ Completoria)、顶裂霉科（Meristacraceae)、新接霉科（Nezygitaceae)。,(一)主要特征和分类 虫霉目的多数成员在昆虫种群中能引起广泛而又突然的流行病。有一些种类有广泛的宿主域，能侵染蛾类和蜈蚣，大多数种类的宿主域则限制在一种或十分相近的种类之中。虫霉目真菌的发育周期短、繁殖力强，且能形成休眠孢子。抗逆性强，分生孢子能弹射传播，孢子表面有粘性物质，易附着于昆虫体表，使之感染。但是虫霉目真菌对昆虫专一性较强，难于人工培养。 虫霉目杀虫真菌的分类仍然处于变化之中，本目中发现的昆虫病原真菌比较多，把160余种具有明显差异的杀虫真菌都包括在虫霉属中是不合理的，鉴定工作又不方便。60年代后，建立了一些分类系统把虫霉目分为6科21属。分科的标准是核的结构。分属的标准是分生孢子梗的形态、分生孢子核的数目、细胞壁的构造，种的分类则根据分生孢子的形态、大小以及生理病理等特征。,80年代后虫霉科属的分类也出现许多方案。比较集中的意见认为，虫霉科可分为:虫霉属(Entomophaga)、团孢霉属(Massospora)、新接霉属(Triplosporium)、斯魏霉属(Completoria)、逸孢霉属、疫霉属(Erynia)、拟虫疫霉属（Eryniopsis)、巴科霉属（Batkae)、虫疫霉属（Erynia)虫瘴霉属（Furia)、虫疠霉属（Pandora)、虫瘟霉属(Zoophthora)和噬虫霉属(Entomophaga)等. 而在蛙粪霉科中只有一个蛙粪霉属。当然还有一些存在疑问而被否决的属。 (二)生殖和生活史 1生殖方式。 虫霉科真菌约有性生殖是通过菌丝段或菌丝体的融合形成厚壁接合孢子，融合的菌丝细胞相当于配子囊(gametangium)形成配子(gamete)，配子结合，形成多核的合子。无性生殖的发生有多种形式：菌丝长出菌丝体或者出芽；初级的单核或多核分生孢子(初级分生孢子)单个地在分枝的或不分枝的分生孢子梗顶端形成；由萌发的初级孢子形成次生孢子；由次生孢子产生第三代孢子。 无性生殖中的拟接合孢子(azygospore)在形态上与接合孢子相似，可能是在环境条件恶劣时，从厚壁的菌丝体出芽而成的，具有较厚的外壁。接合孢子和拟结合孢子的抗逆性强，菌丝消亡后，它们仍然能存活。若遇适宜条件，可再萌发成菌丝。经过休眠期后才发芽的厚壁孢子，统称为休眠孢子(restingspore)。,1菌丝段；2伸长的菌丝段；3分生孢子梗；4初生分生孢子；5次生分生孢子；6分生孢子萌发穿透昆虫体壁；7原生质体；8原生质球；9菌丝段正在通过出芽形成假结合孢子；10前孢子；11休眠孢子；12休眠孢子萌芽；13休眠孢子的芽管上形成芽分生孢子；14芽分生孢子萌发穿透昆虫体壁,虫霉的生活史图,2生活史。 虫霉感染昆虫常由分生孢子开始，分生孢子表面为一层粘液覆盖。分生孢子一旦落到湿润的基质上(不一定是昆虫)，就能产生次级分生孢子，次级分生孢子又能产生次次级分生孢子，一直继续到原生质耗尽为止。有一种特殊类型的次级分生孢子是丝分生孢子(capill-conidium)(毛管孢子），它是由初级或次级分生孢子发育的细管产生，表面也有粘性物质，是虫霉重要的感染单位。分生孢子附着在宿主表皮上，不久伸出发芽管;侵入体腔内。在体腔内的菌丝最初呈多核性，其后形成隔膜，继可分成菌丝段(hyphalbody)。菌丝段通过分裂和发芽增殖，菌丝充满病虫的体腔，通常几天内所有组织就被真菌溶解和破坏，最后使感病昆虫死亡。虫体死亡后不久，因含有水分而保持原样的剌吸昆虫，依然将吻针插入植物体内，就像在吸汁一样。不久，增殖的菌丝从表皮薄弱的部分突出体外，形成分枝或不分枝的分生孢子梗，其先端形成分生孢子。此外，有些突出于体外的菌丝扩散成根状，称为假根(rhizoid)。假根分泌粘液，起固着虫体的作用。 分生孢子成熟后，由于分生孢子梗迅速吸收水分，细胞内压逐渐增高，终于在分生孢子附着部分破裂，分生孢子梗的压力使分生孢子射出lcml.5cm的距离，结果虫体周围落下的分生孢子形成一个圆轮。昆虫感染虫霉后，在临死亡前有爬向茎或草的上方的习惯，又有假根粘着，所以分生孢子在弹射出去后，有一定的扩散能力。 有性生殖由菌丝及菌丝段的先端融合而引起，其结果形成有三层厚膜的接合孢子。接合孢子球形，壁厚，外面多刺，这些刺紧密排列，使得内部结构不易看清。接合孢子直径约35m，壁厚3m4m。,虫霉目分生孢子弹射方式 A、乳突翻转；B孢梗炮；C、孢梗火箭（箭 头示膨胀压增加处）,虫霉还能产生不同类型的休眠结构以对付不良环境和越冬。抗性的休眠结构不是感染性的，但在条件合适时，它们能萌发产生有感染性的分生孢子。接合孢子也是一种休眠孢子，它的抗逆性也很强，这对虫霉在自然界的延续和传播有重要作用。 除此之外，也有许多虫霉能产生无性的厚垣孢子(chlamydospore)和拟接合孢子(azygospore)。厚垣孢子是厚壁的营养细胞在不利的时候(干燥)产生，在有利条件下能迅速萌发。拟接合孢子产生于多核的菌丝体或初级分生孢子；具有比厚垣孢子更厚的细胞壁，被认为是一种越冬的形式。有些虫霉的拟接合孢子在萌发前需要一个成熟时期。据认为这个成熟期是真菌的生活周期与其宿主的生活周期同步的行为。虫霉的菌丝体是分化为分生孢子梗产生分生孢子还是形成拟接合孢子和接合孢子，受一系列内部和外部因素的影响。宿主的生理状态是一个重要的内部因素。有人发现一种虫霉在黄豆银纹夜蛾(Pseudoplusia includens)的幼龄幼虫中主要产生分生孢子，而在老熟幼虫中则产生拟接合孢子和接合孢子。外部环境如周围的温度也可能决定是产生分生孢子还是接合孢子。 (三)入侵宿主 人们早已对虫霉的生活史进行了研究，但最近才详细探讨了它们侵染和发育的过程。许多虫霉的分生孢子与敏感宿主接触后，附着于宿主表皮并产生芽管，然后侵入宿主。分生孢子即使没有接触到宿主，也可以萌发并产生次级分生孢子，然后又扩散直至附着于敏感昆虫体表。通常初级和次级分生孢子的附着是非专一性的，可能附着在宿主表皮的任何地方，然后形成圆形的“粘着垫“(adhesive pad)，提高对宿主的附着能力。蝇霉(E.msucae)分生孢子接触宿主后，变得扁平，在分生孢子与宿主的外表皮之间形成一个粘着垫。同样，耳霉的分生孢子与宿主表皮接触后也变得扁平，外部有一层粘液含有糖蛋白。,金龟虫霉入侵的生活史 A环，分生孢子的形成和侵染；B环，休眠孢子的形成和侵染 1分生孢子萌发，2菌丝体，3分生孢子梗，4释放分生孢子，5次生分生孢子，6囊状体，7假根，8休眠孢子萌发，9虫菌体，10-13、配子囊的接合和接合孢子的形成，14、休眠孢子（接合孢子的传播。,分生孢子的萌发也受表皮成分的影响，蚜虫表皮水溶性和脂溶性提取物可以刺激芽管的萌发。然而非病原性的品系并不受这种提取物的影响，有人证明脂肪酸的存在影响着蚊虫霉分生孢子的萌发，并且这种反应受脂肪酸的浓度、链的长度和不饱和程度的影响。与壳糖结合的油酸(C18:1)，稀释的Emersons YPS培养基是酵母浸出液(0.1%，m/V)等，能诱导芽管的形成。而亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)是有毒的。链长为C12:0C22:0的完全饱和脂肪酸能诱导初级分生孢子产生次级分生孢子。小于C10:0的短链饱和脂肪酸对分生孢子是有毒的。 在大多数情况下，芽管直接朝宿主表皮入侵。然而，芽管难以入侵特别坚硬的区域。一般认为芽管入侵表皮由酶和机械作用共同完成。通常黑化区域是入侵的位点。根据对多种虫霉的观察，在入侵过程中存在有脂酶和蛋白酶。萌发的芽管直接入侵到外表皮后，会分枝或膨胀成足趾状突起，逐渐延伸到内表皮层，最后进入体腔。 入侵到体腔内的芽管，产生菌丝段或丝状菌丝，并迅速地在体腔中增殖，然后侵染脂肪体和神经组织。变形虫状的菌丝段实际上是一种渗透性灵敏的原生质体。对这种细胞的超微结构进行观察发现存在一层内陷的原生质膜。这层膜为层薄的纤维外膜覆盖而不形成细胞壁。有些虫霉在发育中产生原生质体的原因不难理解，因为原生质体通过胞饮作用吸取营养比有壁细胞有效得多。还有人证明了虫霉E.egressa原生质体能够避免宿主颗粒细胞的被囊作用。但是也有几种虫霉，如暗耳霉(Conidiobolus obscurus)和虫疫霉(Zoophthora radicans)在昆虫体内不产生原生质体，而产生有壁的菌丝体和丝状菌丝。 虫霉杀虫所需的时间依赖于其感染的宿主，据报道塔萨虫霉(Ethaxterana)杀豌豆蚜虫的时间是2d3d。而虫霉E.planchoniana在4d6d后才能杀死甜菜蚜虫。不少报道,说明虫客体外培养细胞能产生杀虫真菌毒素，如冠耳霉(C.coronata)冷冻干操的滤液能在2Oh内杀死白蚁。将这种滤液注射到大蜡螟和家蝇体内也有毒性。最近有人在虫霉E.egressa原生质体的废培养基中，找到了一种真菌毒素，这种毒素是一种天然蛋白，注射到扒色卷蛾幼虫体内能造成虫体麻痹。但是在病原体生长的活昆虫体内，这种毒素的真五作用还不清楚。在大多种情况下，虫霉科的真菌都是在宿主组织中大量增殖以后，才导致宿主死亡，因而说明毒素的作用是很小的。 (四)宿主范围和病理学 l宿主范围。 对虫霉敏感的宿主昆虫有半翅目、同翅目、双翅目、鞘翅目中的32科，120余种。有些虫霉有广泛的宿主范围，大多数虫霉的宿主范围很窄，则限制在一个种或十分相近的几个种之中。昆虫的幼虫、蛹、成虫均可被感染。但在许多昆虫中，成虫是最敏感的阶段。有十余种虫霉能感染蚜虫，这些虫霉分别属于逸孢霉属、虫霉属、疫霉属、新接合霉属(Neozygrtes)和虫疫霉属(Zoophthara)。 2病理学。 昆虫感染虫霉之后，初期并不表现出任何可见的病征和症状，只是感染在体内扩散后，病虫才变得呆滞或神志不安。在感染的后期，昆虫失去运动能力，栖息在枝条或叶片的下部，也可能爬到植株的顶部。如蚱蜢头部向上抱住枝条或基杆，鳞翅目昆虫身体前部下垂，尸体以腹足悬挂起来，这种爬到高处的行为称之为“树顶病“(summit disease)综合症。濒死或刚死时虫体变黄，但死后身体会变黑，其后虫尸被真菌的菌丝覆盖。,宿主体内分生孢子感染型和休眠孢子感染型在症状学上是不同的。体内如果产生休眠孢子，则其体表没有产生孢子的菌丝，身体颜色变暗为褐色或黑色，然后枯萎皱缩，内部液化。在体腔中虫霉能形成菌丝段、菌丝和菌丝体。菌丝段是最普通的形式，由萌发管形成，以出芽形式进行增殖，由于体积大而不能在体腔中自由流动，而是进入宿主组织。这些菌丝段多围绕脂肪体。组织病理观察表明，脂肪体细胞明显变形和被分解，而虫体表层的内表皮也遭破坏。肌肉束断面显著缩小。中肠的肠上皮细胞己有相当程度的溶解和破坏，在肠上皮与圃食膜之间出现了较大空隙，在围食膜里包围着食物。在感病死亡36h的幼虫切片上，可见到大量分生孢子梗突破虫体表皮，在分生孢子梗上生长出分生孢子。此时肠壁变得很薄，已观察不到细胞构造，围食膜已不存在。最后，体内任何器官不复存在，只见菌丝或菌丝体。 (五)流行传播 尽管虫霉能在宿主昆虫中引起广泛而又突然的流行病，但是它的流行传播是需要一定条件的。 1虫口密度。由于虫霉专一性较强，虫口是繁殖病原的基本条件。因此高的虫口密度是流行病的必要条件。 2病原体。病原体的数量是任何病原微生物引起流行病的重要条件，但对于虫霉来说还要求不同类型的孢子，能适应不同的环境条件，而完美统一地完成各自在流行传播中的作用。如休眠孢子要寿命长，不易萌发，借此安全度过不良环境，延续种族，而分生孢子则能不失时机利用传播条件，立即萌发，迅速穿透宿主体壁，扩大传播范围。,3温度。温度总被人们认为是影响寄生真菌活性的重要因素之一。据报道，圆孢虫霉(E.sphaerosperma)生长的最适温度是182l。在8时，尽管生长很慢，但还是能生长并产生分生孢子。在34时，生长慢，超过35则不能承受。但弗雷生三孢霉(Triplosporium fresennii)对温度的适应范围较广。温度对虫霉分生孢子的萌发也很重要，有人用五种温度做三种虫霉在琼脂表面萌发的试验，这五种温度是8、16、25、30、36，发现最好的温度是16，有91一95的孢子萌发。室内试验还表明高温也降低休眠孢子的萌发率，休眠孢子暴露于85、96h，则不能萌发。 4湿度。湿度是影响真菌流行传播的另一重要因素。分生孢子的萌发，要求空气湿度达到95一100。如果湿度低，孢子萌发率就大大降低，从而影响侵染宿主。例如，据调查我国昆明地区流行的一种金龟虫霉(E.brahmina)，其流行程度似乎与雨量成正比。 5光。光的密度、光照时间和波长对虫霉真菌的影响很大。通常太阳光不仅能提高温度，还可降低相对湿度。有人发现拟球囊虫霉(E.pseudococei)在成熟期间，光照决定有些类型生殖体(reproductive body)的形成。如菌丝段发芽之前若将其放在黑暗处几个小时，则形成拟结合孢子。进一步的研究还证明黑暗对休眠孢子的发育是必需的。,第三章 杀虫细菌 细菌种类多，数量大，在昆虫病原微生物区系中占绝大多数。在不同的环境条件下，对昆虫种群数量的调节能起着不同程度的作用。其中某些类群已发展为微生物杀虫剂，大面积用于害虫防治。 第一节 细菌的特征和分类 一、 一般特征 1、具有原核生物的一般特征，单细胞； 缺少完整的细胞核，无核膜，DNA在细胞中部近裸露，缺少单位膜所包包围的细胞器，核蛋白体为70S型，没有内质网。 2、细胞结构 细胞壁 保护性，当外壁受损会出现溶菌现象。外壁由两种单糖和三、四种氨基酸组成的大分子几丁质化合物。菌体抗原为O抗原，产生于外壁，外壁组成的质和量的差异决定于抗原的特异性。 细胞质和质膜 其核酸含量高，可达固形物的15-20%，细胞质内有酶系和贮备物，有膜状结构的中间体，是细胞呼吸液活动中电子传递系统的中心，质内还有载色体是光合作用的埸所。质膜由脂蛋白组成，具渗透性，可进行物质交换。,核质 是由单一的含纤细细丝的密集结构构成的区域，无核模，但含DNA，分裂时核质分为两份，核酸和遗传有关。 鞭毛 鞭毛是细菌的运动器官，细菌生长鞭毛的能力和培养基成分及培养条件有关。鞭毛具抗原的特异性，称H抗原。 荚膜 有些细菌在一定条件下，壁外被复一层粘性物质，它不是细菌的主要结构，而是细菌向外分泌的糖类衍生物，或与多肽聚集而成。致病性细菌在动物体内易产生荚膜。 细菌的荚膜多与其毒力和抗原性有关，具有荚膜的细菌一般是有毒力的，当这些菌类失去荚膜时，也失去致病性。 芽胞 某些细菌在生活在的一定阶段，在营养细胞内形成内生孢子，产生孢子的细胞叫孢子囊。芽胞是细菌生活中的一个休眠体，芽胞园形或椭园形，有厚的壁和强列的折光性，芽胞形成后母细胞断裂，释放出游离的芽胞，由于芽胞含水量少，结合水的含量比营养体高，因而对热和干燥的抵抗力强。,二、繁殖 主要用无性繁殖（二分法）传递后代。也有有性杂交现象，但在人工特定条件下进行。 三、群体生长规律 液体培养中，每个细菌获得同样的培养条件，定时取样可分为四个时期 调整期：不繁殖，数量不增长，但体积增长很快。调整期的长短和菌种、菌令、接种令、培养条件有关。 生长旺盛期：分裂快，生长正齐健康，以几何级数增加，所以也你对数增长期，此间的长短、繁殖速度与菌种、培养条件、培养基有关。 平衡期：增殖速度逐渐下降，死亡数上升，由于营养物的减少和有毒代谢产物的产生而达平衡期。 衰老期：死亡速度超过繁殖速度，有的出现自溶现象。产芽孢的细菌形成芽孢体。,第二节 昆虫细菌病的病症和病原细菌的种类 一、昆虫病原细菌的感病特征 当昆虫被细菌感染后表现如下：常见动力缺乏，食欲减退，以及口腔和肛门带有排泄物；大多病原细菌入侵体腔后，常引起感染而终成为败血症。病死后的虫体颜色加深，呈褐色或黑色，而且过分软化失去原形；内部组织溃烂，而呈粘着性，常带有臭味。病死昆虫体液涂片中常见到大量细菌。 二、昆虫病原细菌感染症状的类型 1、菌血症：细菌在昆虫体腔增殖，但不产生毒素，一般对昆虫没有其它有害影响。但会消耗昆虫大量营养物质，使其发生生理饥饿而死。 2、败血症：多发生于昆虫病原细菌，细菌侵入昆虫体腔后大量增殖并产生毒素而杀死昆虫。 3、毒血症：细菌在肠腔中产生毒素引起的一种症状，细菌不进入体腔。,三、昆虫病原细菌作用方式的三种类型 根据其寄主专一化程度和作用的特殊方式，分为以下三种类型： 1、专性病原体 专性寄生，只在特定的昆虫体内增殖，增殖需特殊的条件，用人工培养基很难培养。多经消化道传染。如日本金龟子芽孢杆菌，缓死芽孢杆菌等。 2、兼性病原体 既营腐生生活，也可寄生于昆虫体内的病原细菌。寄主范围较广。由于增殖不需特殊条件，所以可用人工培养基培养。这类病原不仅可在消化道内增殖，并可侵入体腔，有些种类产生毒素。如苏芸金杆菌、蜡状芽孢杆菌等。 3、潜在病原体 多为腐生菌。普遍存在于昆虫的消化道中。可以在自然界昆虫以外的场所增殖，缺乏侵入昆虫消化道的能力，很少造成昆虫疾病。当昆虫受到饥饿、咽下污染的食物，受到其它病原体侵害，同类残杀造成伤口时，它们便可进入体腔，大量增殖造成败血症。如绿浓杆菌、链球菌等。,第三节 苏芸金杆菌引起的疾病 苏芸金杆菌（Bacilius thuringiesis）是1911年德国Berliner从德国苏云金的一个面粉厂的地中海粉螟中分离出的。1915年定名。这一类型的细菌杀虫剂的研究已成为目前微生物防治害虫的主要手段之一。 一、生物学 营养体时期：棒状的杆菌，两端钝园，有坚实的外壁，1.2-1.83.0-5.0m，周身鞭毛，革兰氏染色阳性，在良好的通气条件下8-12小时。 孢子囊时期：营养体内形成卵园形的芽孢，0.8-0.92m，每一孢子囊内芽孢的另一端产生菱形或正方形的蛋白南晶体，革兰氏染色晶体呈阴性反应。，晶体长1m，宽0.5m。,芽孢,晶体,苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis) 左：营养体，箭头所指导为伴孢晶体； 中：营养体细部，S为芽孢，C为伴孢晶体； 右：伴孢晶体,生活史： 萌发 裂殖 成熟，胞质浓缩 晶体 内毒素 芽孢 营养体 营养体 孢子囊 芽孢 再侵染或体外培养 杀虫,苏菌芽孢形成过程,二、营养要求 苏芸金杆菌对营养条件要求不高，所需的主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种碳源、氮源和无机盐中正常发育。通常所需的碳源是：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖等。所需的氮源是牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、鱼粉、玉米浆等。所需的无机盐有磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙等。主要元素有：P、S、Mg、K、Na、Ca6种，微量元素有Mn、Zn、Si、Cu、Fe等。 苏芸金杆菌在10-40范围内都能生长，以28-32为最适。35-40生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。因此，在一定温度范围内提高温度会缩短生长期，但菌数量会降低，而温度低则生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。该菌适于微碱性条件，最适pH为7.5，当pH达8.5时，还形成芽孢，如pH降到5以下时则不能形成芽孢。苏芸金杆菌是好气性细菌，需要足够的空气才能生长发良好，尤其在芽孢形成时，若缺乏空气会延迟芽孢的形成或不形成。空气不足还影响到生长速率、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。紫外光、阳光对芽孢都有致死作用。芽孢暴露在紫外光下很快会失去活性。抗生素、化学物质如放线菌D、氯霉素等亦有影响，乳化剂如吐温100在100g/ml时全部抑制了芽孢萌发。,三 、苏芸金杆菌的分类 1、根据苏菌鞭毛抗原H-抗原的血清型鉴定：将细菌细胞培养（可先进行复壮，增强其运动性，然后制备H-抗原的悬浮液，再制备H-抗血清（对家兔进行免疫注射提取抗血清），并与已知的H类型的抗血清进行凝集试验，结合其它生化实验结果，以确定其血清型（如果一株苏菌的鞭毛抗血清只与自身抗原发生凝聚反应，而不与其它菌株的抗原发生反应，这个菌株就是一个新的血清型）。至已发表了分属70多个血清型的84个亚种。,2、苏菌ICP基因的分类： Bt的伴孢晶体蛋白、又称杀虫晶体蛋白(InsecticidalCrystalProteins，简称ICPs)和编码这些毒蛋白的cry或cyt基因。自从1981年克隆了第一个cry基因，到1989年共发现了42个基因，根据基因产物的杀虫谱和序列的相似性，将它们分为4类14个小组，到1992年共有cry基因29个小组。CryI类蛋白对大菜粉蝶和烟草天蛾都有活性。CryIA(a)、CryIA(b)和CryIA(c)主要来自Bt库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)，其作用对象是农业经济中最重要的一类害虫危害蔬菜、棉花、玉米、水稻、烟草以及森林等的鳞翅目昆虫； 防治鞘翅目叶甲类害虫；专杀双翅目蚊蚋幼虫等。约20多个品种。最近，日本等国家在开发专杀地下害虫的第4类BT杀虫剂第四类基因方面取得了重要进展。,苏云金芽孢杆菌致死 鳞翅目昆虫幼虫的过程示意图,四、苏芸金杆菌的毒素及致病机理 苏菌主要是通过消化道传染给昆虫的，它可由菌体本身的活动而导致害虫的死亡。但更重要的因素是菌体产生的毒素，毒素可使害虫在短期内中毒死亡，是生物杀虫剂中重要的杀虫因子。苏芸金杆菌在生长过程中所产生的毒素可分为两类，一类是内毒素，在细胞内形成，并存留于细胞内而不分泌到细胞外，只在细胞溶解时才释放出来。苏菌的内毒素即伴孢晶体。另一类是外毒素，在细胞内形成，但可分泌到细胞外的基质中去，这类毒素多是一些可溶性的化合物。据报道苏菌的毒素主要有以下（接表）： 1、晶体毒素：晶体毒素对敏感昆虫除了造成毒血症外，还可由消化道入侵至昆虫体腔，通过大量繁殖而引起败血症。 在感病初期，昆虫不安拒食，随着病情发展，不久即见病虫腹足或臀足抓住物体，虫体倒挂而死。一般害虫感病后，食欲减退，行动迟缓，反应失灵，兼有吐泻症状，偶见黑斑出现于体背或体侧，死后虫体伸长，中肠变黑，整个消化道变黑呈腐烂状，虫体内充满腐糜液状物，死后不久虫体呈棕褐色或黑色。,苏芸金杆菌的毒素,苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的3个功能域,晶体毒素对害虫有强列毒性，完整的晶体具有物理稳定性，当敏感昆虫摄食伴孢晶体后，在中肠肠液硷性条件下打开二硫键降解为毒性亚单位或称原毒素，进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗蛋白酶的毒性颗粒片段，与刷状缘结合位点特异性受体高亲合性的结合，快速而不可逆的插入细胞质膜，形成孔或病灶，破坏钾、钠离子梯度，使钾的运输和ATP合成中断，细胞线粒体失去功能，细胞膜传递受到干扰，膜引起非极性化，最后通过胶体渗裂解将细胞膨胀并裂解，肠腔内容物渗入血腔，微生物迅速繁殖，昆虫死亡。 由于高等动物和人体肠胃中缺乏能溶解晶体的条件，无毒。因而这种杀虫毒素具有很大的应用价值和理论意义。 伴孢晶体的杀虫活性表现有一定的特异性。因为：伴孢晶体的形态结构不同。在硷性条件下酶解或昆虫硷液消化后，其生物学特性、氨基酸组成的量、多肽型、抗 原型和活性均不相同。晶体是一种原毒素，需在各种条件下降解为有毒成分，在硷性条件下，双硫键断开，大多鳞翅目昆虫幼虫肠道呈硷性，尤其适合于菱形或方形伴孢晶体的消化而释放出有毒成分。而球形和园形晶体难于被外界条件破坏和消化。不同形态伴孢晶体的杀虫活性与寄主生理状况有关。,2、-外毒素-苏芸金素。也是一种重要的致病因子，其作用机制不十分清楚。它的作用仅在昆虫变态和蜕皮时可见到。使蜕此的幼虫死亡可畸形，或不能正常化蛹，或化蛹后不能羽化，或少数羽化的面虫残缺不全等。应用细菌、昆虫、脊椎动物试验表明，-外毒素可能损伤寄主ATP的代谢作用，并阻碍蛋白质、DNA和RNA的合成，是DNA依赖的RNA聚合酶的抑制剂。 3、其它毒素目前研究不多，对其作用方式了解甚少。-外毒素是一种卵磷脂水解酶，水溶性，热敏感，对昆虫具毒性，多数能在营养细胞期产生。该毒素对昆虫肠道有破坏作用，有助于细菌侵入血腔和繁殖。鼠因子是1971年Krieg发现的，它存在于发酵液上清液中，的一种热敏感外毒素。口服时对鼠和小菜蛾具毒性，定名为鼠因子。另一种毒素叫虱因子，系Gingrich(1971)由H3a3b粉剂中分离出的，发现对四种羽虱有毒杀活性，它所具有的杀虫活性是一种新的化合物，定名为虱因子毒素。其化学成分和作用方式有待进一步研究。 4、苏菌芽孢杆菌-内毒素蛋白基因在育种上的应用 随着植物基因工程技术的发展，已可将苏芸金杆菌-内毒素蛋白基因引入植物获得抗虫转基因植株。1987年Schnepf等首次将BT毒蛋白基因克隆、田颖川等（1988）将BTHD1和7404菌株的-内毒素蛋白基因克隆，并在大肠杆菌中得到表达。通过生物测定已证实，表达菌已增强了杀虫毒力。进一步的育种还在进行。,第四节 乳状菌引起的昆虫疾病 乳状菌是一群寄生于多种金龟子幼虫体内的病原菌。 感病的幼虫由于菌体在血淋巴中繁殖并形成芽孢，虫体 呈不透明的乳白色，流出的血淋巴为乳白色，故称为乳状菌。 一、形态 营养体粗杆状，两端近园形，多单个或双链存在。营养体0.5-0.81.3-7.0m，革兰氏染色阴性，芽孢中生，卵园形，0.9-1.31.8-2.4m，有的乳状菌在芽孢形成时，在孢子囊中，还形成伴孢晶体，大小为0.50.5m。 二、分类 根据伴孢晶体的有无，芽孢和伴孢晶体的大小、形状及着生位置， 分为4个组。 A1 芽孢大，伴孢晶体小，且与芽孢不分离。 A2 芽孢大，伴孢晶体大，且与芽孢分离。 B1 无伴孢晶体，芽孢大，中生。 B2 无伴孢晶体，孢子囊大，芽孢小。,A型乳状菌,B型乳状菌,三、侵染病理 1、途径：通过消化道入侵，也可注射和口感染，菌体增殖。 2、发育阶段： 芽孢萌发期：（1-2天），芽孢失去折光性，血淋巴中有极少营养体。 营养增殖期：（3-5天），营养细胞迅速增殖，菌体内形成伴孢体，并偶有芽孢， 血淋巴轻度混浊。 芽孢形成期：（5-10天），营养体继续增殖，芽孢和伴孢体形成。 芽孢成熟期：（14-21天），芽孢大量增殖期。 四、致病力 致病机理：细菌生长过程中从宿主血淋巴中利用了大量的营养物质和多种生长因素,寄主生理饥饿而死。寄主某种酶系统破坏。,金龟子乳状菌对多种金龟子幼虫有致病作用，专化性强，来自不同寄主的乳状菌对蛴螬的致病力不同，一般对原寄主致病力高，而对其它种低甚而不感染。感染与芽孢或营养体的数量有关。单个芽孢不能致病，每克土壤中含有4106个新鲜芽孢可造成96%的虫体死亡。所以田间发现的病虫体的乳状菌多处于营养体和芽孢形成期。由于营养体细胞在血淋巴和人工培养基之外不能存活或形成芽孢，而感染蛴螬则需大量芽孢，所以在田间造成乳状病流行是不易的。 五、防治 由于人工培养未解决，所以仍用活虫体培养来生产菌剂。用孢悬液1000000芽孢/ml注射3令金龟子幼虫，或拌土饲喂（感染率低），1-3周后，病虫体内充满芽孢，收集死虫，磨碎，加水稀释，加填充剂，经干燥制成菌剂。,乳状菌孢子的超薄切片,第五章 杀虫病毒 昆虫病毒对宿主昆虫有较高的致病性，对天敌安全，不污染环境，尤其是它能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口，同时不易产生抗药性等明显优于其它杀虫剂的特点，决定了它具有强大的生命力。迄今为至，尚未发现有昆虫对病毒杀虫剂产生抗药性，因此它是生物控制害虫的一种强有力手段。60年代以来，世界各国对昆虫病毒作了大量的工作，据不完全统计，国际上已有60多种昆虫被引入大田防治试验，其中有20多种被制成商品杀虫剂。其中最有成效的当数棉铃虫NPV和松毛虫的CPV，取得了满意的效果。,第一节 病毒的特征和分类 病毒是是无细胞的生物，是一类最原始的生命形态，是绝对的细胞寄生物。具有以下特征：遗传物质只有DNA或RNA一种；不能生长、分裂，只能复制；缺少能量产生系统，没有完正的酶系统，不能进行物质代谢。因此只有在活细胞内才能生长繁殖。 完正的病毒单位称为病毒粒子，不少昆虫病毒粒子包在由蛋白质晶体构成的包涵体中，具有包涵体的病毒对外界有较强的抵抗力。病毒粒子的基本构造如下：,囊膜（套膜、外膜）由蛋白质和脂类构成 病毒粒子 衣壳（内膜）蛋白质 核衣壳 芯子（DNA或RNA）,核型多角体病毒 病毒粒子的构造,E-囊膜；CL-填充层；Ca-衣壳 Co-髓核（核蛋白）；CA-中心轴 AA-吸着装置；P-突起；TP-底板,注：绿色为昆虫或无脊椎动物病毒，黄色为具有包涵体病毒,以上13个科中，其中4个科是专门为昆虫和无脊椎动物而设的，主要有：杆状病毒科，多DNA病毒科，包囊病毒科和四对称病毒科。另外在这些病毒中有三个科与众不同，即杆状病毒科，昆虫痘病毒亚科和呼肠孤病毒科，这些病毒在发育一定阶段形成包涵体，病毒子随机包涵在包涵体中，使病毒在外界环境中保持稳定和持久。,属有包膜的病毒，系冠状病毒科， 冠状病毒属Coronaviruses,禽流感病毒攻击人体健康细胞,主要昆虫病毒的分类检索表 1 形成包涵体 2 1 不形成包涵体 无包涵体病毒 （包括虹彩病毒，浓核症病毒，西格马病毒，松天蛾病毒， 野田村病毒，无包涵体杆状病毒等） 2 包涵有大量病毒或不包涵病毒 3 2 仅包涵一个，偶而包涵两个病毒，病毒粒子杆状，可在细胞核内形成，亦可在细 胞质内形成 颗粒体病毒（GV） 3 病毒粒子杆状，在细胞核内形成 核型多角体病毒（NPV） 3病毒粒子非杆状，在细胞质内形成 4 4 病毒粒子球形，在中肠细胞形成 质型多角体病毒（CPV） 4病毒粒子卵形或椭园形，在脂肪细胞和血细胞中形成 痘病毒（EPV）,第二节 寄主范围和侵染方式 一、寄主范围： 已发现的NPV中，约有90%发生在鳞翅目中，其中单粒包埋（SNPV）亦有在膜翅目（主要是叶蜂）、双翅目、直翅目、毛翅目、脉翅目中发现。多粒包埋（MNPV）仅在鳞翅目中发现，但有的具有广泛的寄主范围，已知苜蓄夜蛾NPV至少可感染10个科的35种害虫。总的来看NPV的专化性似乎在科间发生，在田间不可能有交叉感染。 GV（颗粒体病毒）主要见于鳞翅目，专化性较NPV强，某些情况下专化性发生于属或种的水平。 CPV（质型多角体病毒）主要见于鳞翅目，但专化性最弱，故安全性比NPV、GV差。 EPV（痘病毒）主要见于鳞翅目，鞘翅目等。 二、侵染方式： 昆虫病毒的侵染主要通过口传递，也可通过伤口和胚胎传播。 经口传播的病毒经肠道发生感染，包涵体在硷液中肠溶解，释放出病毒粒子，进入中肠开始复制。,三、病毒的基本特征： 1、病毒粒子： 具有囊膜和核衣壳，核衣壳和囊膜之间有一层不定形但很清晰的中间层，由类脂组成。杆状病毒的基础因大小为80kbp-200kbp，为环状超螺旋双链分子DNA。杆状病毒粒子大小为（40nm-60nm）（200nm-400nm），病毒粒子的成分复杂，至少有10-25种，分子量为10ku-160ku的多肽。病毒粒子对乙醚和热不稳定。 2、核衣壳 病毒核衣壳由DNA和蛋白质组成的一个柱状核心，衣壳园筒状，两端具帽，中间充满DNA，很长的带有DNA的衣壳前体断裂形成典型的核衣壳。衣壳的结构被认为是由许多亚基组成。环与环之间的距离为4.5nm，逐渐缩短的一系列亚基环形核衣壳的帽状结构。帽状结构的蛋白质不同于组成衣壳的环亚基的蛋白质。DNA包入衣壳之内看来与帽状结构有关。 核衣壳两端的帽状结构在形态上有所不同，一端为爪状和乳头状，而另一端为爪状。这种差异表明核衣壳在吸附、穿过核孔、反吞噬及侵入细胞膜等过程中存在极性。 衣壳由一种39ku的主要蛋白质组成，它的病毒定位在病毒基因组上。衣壳蛋白出现在DNA一碱性DNA-结合蛋白复合物与囊膜之间，人们认为衣壳中的DNA是螺旋形、超螺旋形成象T4噬菌体一样折叠的形状。然而从衣壳中出来的DNA为螺旋形。,第三节 主要的昆虫病毒 目前应用较多的昆虫病毒有NPV、CPV、GV等。 一、 核型多角体病毒： 核型多角体病毒（Nuclear polyhedrosis virus）简称为NPV病毒。在被感染昆虫的细胞核内，在显微镜下可见许多析光性强的颗粒-多角体。 1、病毒粒子：病毒粒子呈杆状。在多角体中有两种包埋方式。一种为单粒包埋（SNPV），加一种为多粒包埋（MNPV）。前者每个囊膜只一个核衣壳，后者每个囊膜有多个核衣壳。两者的差异不仅在核衣壳数目的不同，而且在生物学特性、生化、血清学、限制性内切酶分析等方面均有差异。 2、包涵体-多角体：为三角形、四角形、六角形等。多角体直径为0.4-15m。每个细胞中产生多角体的数目不定，感染的细胞核中充满了多角体，有些甚至占昆虫干重的10%，不同的病毒多角体形状不同。包涵体表面有一种膜状结构，是一种病毒来源的膜，这种蛋白被硫醇连接在包涵体周围的糖层上。 NPV感染700多种昆虫，敏感昆虫最多的是鳞翅目，其次是膜翅目、双翅目、鞘翅目、脉翅目，其次是毛翅目和缨翅目各一个种和蚤目。,NPV入侵和增殖,NPV的包涵体,感染的幼虫,3、病理学： 1）、宏观病理学：多数鳞翅目昆虫摄入病毒后2-5天内均不表现症状，后体色改变，表皮变得不透明，发白，光滑，血淋巴变成浊白，幼虫活动减退，在残废前仍能进食，不过食欲逐渐消失。幼虫通常5-12天死亡。有些被感染的幼虫虫期延长，死前不久，幼虫有的倒挂树梢。死后的虫体表皮易破，体内组织液化。内部含有大量的多角体。膜翅目昆虫感染后，由于中肠被破坏，体色改变，尤其是3-5腹节变成膜糊的黄色，幼虫食欲减退，肛门经常分泌黑褐色液体，或吐出乳白色液体。 2）、组织病理学：大多鳞翅目幼虫中，病毒能引起昆虫所有组织的感染，能在主要的组织和器官中增殖，尤其是脂肪体、真皮、气管和血细胞。 3）、细胞病理学：在中肠细胞中，首先发生具有囊膜的病毒粒子与微绒毛融合，裸露的核衣壳因而能进入微绒毛而到细胞质中。体腔中的病毒粒子通过吞饮作用和融合作用而侵入细胞。DNA进入核中后，染色体颗粒分散到细胞核周边区域，随后核增大，不久核仁消失，稠密的网状物质在核内出现。在病毒发生基质上核衣壳配起来并获得囊膜，最后由许多病毒粒子与多角体蛋白形成大量多角体充满细胞核。,云杉卷叶蛾幼虫表皮感染NPV病毒包涵体切片的电镜照片,4）、病毒复制：多角体被摄食后，进入中肠，后被溶解，并释放出有囊膜的病毒粒子，穿过围食膜，侵入柱状上皮细胞。吸附在柱状细胞的微绒毛上并与之融合。在细胞内核衣壳通常与微管相连，微管将病毒粒子导向细胞核。核酸进入细胞核，在病毒发生基质附近出现伸长的管状突起，然后出现部分和全部填充的核衣壳。细胞核中的核衣壳与一个颗粒状物相连，并附有纤维丝，在核衣壳周围卷曲，形成囊膜，囊膜包被着一个或多个病毒粒子，形成成熟的包涵体。主要过程是：一是核衣壳获得具膜粒的囊膜，形成胞外病毒粒子；二是核衣壳在细胞核中从新合成囊膜并包埋进包涵体中。当包涵体被 另一敏感昆虫摄食后，其中的病毒粒子即引起感染。,病毒粒子的多粒包埋,二、 颗粒体病毒 据报道：颗粒体病毒仅感染鳞翅目113种昆虫，但膜翅目卷叶锯叶蜂科中有一种昆虫也可被感染。GV与NPV不同点是：囊膜中核衣壳数目不同；包涵体的大小和形状不同；萌状体基质蛋白包埋有囊膜核衣壳的过程不同；包涵体中有囊膜核衣壳的数目不同；宿主的特异性强，是DNA病毒中专化性最强的一类。 1、病毒粒子：GV核衣壳和有囊膜病毒 粒子的大小和形状与NPV相同，核衣壳获得囊膜的方式与NPV同。有三种：从核中发生或从头合成。在细胞质中发生或从头合成。通过出芽穿出细胞膜。不同的是，每个囊膜中仅一个核衣壳（单粒包埋），很少有两个或多个。病毒DNA是双链，超螺旋，共价闭合环状的DNA。 2、包涵体-蒴状体：常为卵形、椭园形、 长卵形等，大小通常为（120-300nm） (300-500nm)，比NPV小，基质蛋白同多角体 一样也形成晶格结构，其亚单位分子量为25-30ku。 有包涵体，病毒粒子（偶有两粒），病毒粒子杆状。,3、 病理学 1）宏观病理学：与NPV相似。幼虫体色发生变化，尤其是腹部变成苍白色或乳黄色。当感染仅限于脂肪体时，幼虫体积增大，体色变白，不透明。体表有斑点，最后呈黄色。幼虫期加长，幼虫活力逐渐变弱，行动迟钝，身体变软。系统感染时，幼虫短期死亡，皮肤易破。 2）组织病理学：主要感染脂肪组织，脂肪体细胞增殖和增生导致了幼虫在感染晚期肿胀。 3）细胞病理学：核膜内层形成很小的核内小泡，随后小泡扩大形成核内突起，核仁增大，核膨大，大多染色体凝集，并移至核边缘区域，病毒发生基质形成。与此同时，细胞质粗面内质网和线粒体呈空泡状，感染细胞与周边细胞分离，细胞质中形成环状片层。感染3天出现包涵体，7天含量高。 4）病毒复制：包涵体在消化道被硷解后，释放出有囊膜的病毒粒子，吸附并融合在中肠柱细胞的微绒毛上，2-6小时后核衣壳移入并迁移至细胞膜，吸附在核上并在核上也脱壳。随着病毒发生基质的形成，病毒粒子在细胞核中产生，6-12小时衣壳在细胞核中出现，接着核膜分解，病毒的复制在细胞核和细胞质中继续进行。核衣壳获得囊膜和包埋入包涵体的过程也同时在细胞核和细胞质中继续进行，24小时后，有囊膜和还未获得囊膜的核衣壳成排出现在中肠细胞间隙和基底膜附近，晚期，有很多核衣壳包埋在基底膜附近或出芽穿过膜，获得具膜粒的囊膜。有的核衣壳单个或多个出现在囊泡中，朝基底膜运动。从中肠上皮至体腔的运动方式同NPV。,GV病毒在体内复制,颗粒体病毒,三、质型多角体病毒： 昆虫对RNA病毒很敏感，但因其致病力低且在害虫的控制中作用有限，所以重视不高。但CPV对养蚕业有重要意义，并对松毛虫防治有重要作用。被感染的昆虫皮肤不破裂，潜伏期较长，致病速度慢，但感染力强，传递效果好。 1、病毒粒子：二十面体，直径为50-80nm，核心为30-40nm ，具单层衣壳。病毒粒子二十面体上各有一条突起，突起中空，附在基板上，核心物质通过突起释放。 CPV的双链RNA有10个片段，分子量13103ku22103ku，每条片段均可单独被转录。大多每条片段为一种蛋白质。 CPV双链RNA只有被 CPV所携带的酶复合物作用后，合成mRNA和10个单链RNA，才有感染性。,多粒包埋的CPV,CPV病毒粒子模式图,被CPV感染的云杉卷叶蛾中肠细胞质的电镜照片，包涵体内的病毒粒子有聚合作用，但也有的分散在细胞质中，病毒粒子十二面体,2、包涵体：包涵体同NPV，很稳定，能保护病毒粒子抵抗不良环境，并作为病毒在宿主间传播的媒体。其大小为0.1-15m，形态不定但只在被感染细胞的细胞质内形成。所含核酸为RNA。有正方形、六角体和近球形。但多角体不具有多角体膜，易染色。大多在中肠上皮细胞的细胞质中形成。包涵体蛋白由一种主要的多肽组成，分子量为25-37ku，在高PH下溶解，病毒粒子占多角体重量的2-5%。 3、病理学： 宏观病理学：大多CPV病是慢性疾病，幼虫阶段不死亡并发育成带病的成虫。在双翅目中CPV的感染几乎无害。鳞翅目昆虫可发生致死感染，幼虫表现为发育延迟，虫体较小，体重减轻，蜕皮次数增多，幼令时更为敏感。蛹小，繁殖力降低。进食多角体后，一般4天后开始表现症状，迟钝、仃止进食、腹泻、呕吐、，中肠为不透明，呈黄色或白色，中肠壁较薄，破裂时流出白色液体。感染的幼虫一般7-15天死亡。 组织病理学：CPV的复制仅限于中肠上皮细胞，主要感染中肠柱状细胞，若注射则可引起中肠任何部位感染。 细胞病理学：被 感染的鳞翅目昆虫，中肠上皮细胞靠近肠腔的顶端膨大，微绒毛部分或完全消失。内质网断裂，数目减少，膜结合的细胞色素P-450的代谢活性显著下降，细胞最后破裂，释放出多角体至肠中。感染的中肠细胞被破坏，由再生细胞产生的细胞取代。 4、传播：主要是水平传播，垂直传播的频率很低。不能确定是由卵巢还是经卵表面传递。,CPV在体内的复制,第六章 其它昆虫病原引起的疾病 第一节 昆虫病原原生动物 一、原生动物的基本特点 是单细胞的真核生物，细胞内含有具有不同功能的结构（“类器官”、“细胞器”），归原生界。 1、原生动物：单细胞，构造较简单；机体活动象后生动物，进行着动物体的一切主要生命过程。 2、构造：细胞膜（无壁）、细胞质和一或数个细胞核、液泡（伸缩泡）。单细胞，没有真正的器官分化，细胞内含有由细胞本身分化的“细胞器”或“类器官”，通过它来履行一系列生命活动。 3、营养方式： 植物性营养：在体内合成食物，如少数鞭毛虫。 动物性营养：借胞饮作用将固体（细菌或藻类）或液体有机物质吸收到细胞内（细胞膜内陷，将这些物质围住，被细胞质的流动拖向细胞核）。在饮液泡内消化、吸收到原生质。 食腐动物性营养：靠渗透作用，从细胞表面吸收虫体内溶解的营养物质，这是昆虫病原原生动物中最重要的特征。,4、繁殖：无性繁殖二分裂法和多分裂法，以及芽殖法。 分裂法是由细胞核先分裂多次形成新细胞核，然后整个细胞进行分裂，每个上面带一部分原生质，形成许多新细胞个体。 有性繁殖：交配生殖。生殖时两个同形或异形的配子彼此完全融合，并发育