纤维素酶活力的测定.doc

生物化学实验报告题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）姓名： 学号： 班级： 时间： 一、 实验目的：掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。二、 实验原理：纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。三、 实验试剂：1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）四、 实验器材：1. 比色管10支。2. 722型分光光度计。3. 滴管。4. 水浴锅。5. 移液枪。6. 电炉。五、 实验步骤：1. 标准曲线的绘制：分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的葡萄糖于5支比色管中，均用蒸馏水稀释至1ml，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水21ml，摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线。2. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm测OD值。六、 实验结果：在上述条件下，1酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖微克数定为一个活力单位。纤维素酶活力单位N-酶液的稀释倍数30-糖化所用时间1-反应酶液ml数实验测得的数据记录如下：表1 各比色管550nm OD值比色管123456空白样品1样品2样品3标准葡糖液/ml00.20.40.60.81.0-葡萄糖/g020040060080010000未知未知未知550nm OD值00.1090.2280.3510.4870.59400.4330.4310.431样品550nm OD值平均值= = 0.432。作出标准曲线：图1 葡萄糖溶液550nm OD值标准曲线通过标准曲线可求得样品中葡萄糖量为732g，所以：纤维素酶活力单位=2.44103u/mg所以每克固体酶的活力=2.44103103=2.44106u七、 注意事项：1. 在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。从实验原理上看，这样做的目的是：无论是标准液还是样品液