课件：大肠杆菌基因工程(1).ppt

基因工程 Genetic Engineering,主讲教师：李黄金 /jpkc/2012/jygc/ Email: 任课教师：张文峰、陈伟 生命科学与生物制药学院 13,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,动物基因工程,植物基因工程,基因工程进展,回顾：基因工程的基本目的是什么？,1、获取、整理遗传信息资源： 破解生命之谜、利用基因资源 2、生产功能蛋白或化学原料 研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗体 医药用途：蛋白/多肽药物、抗原（疫苗）、抗体（治疗/诊 断）、免疫毒素等。 工业用途：工业用酶、工业原料 3、改良生物性状：分子育种（改良/创造）、基因治疗/免疫,问题：如何利用基因资源？,克隆目的基因,转入特定宿主,表达目的基因,生产蛋白/多肽：强调高效 分子育种/基因治疗/免疫：强调可控,全基因：基因文库/PCR 编码序列：cDNA文库/RT-PCR/合成,选择宿主（特点、优缺点？） 构建表达载体（关键元件、调控原理？） 转基因（转化系统、导入方法？）,基因工程主要宿主系统,原核细胞(Prokaryotic),真菌（Fungus ),昆虫(Baculovirus ),高等真核细胞（Eukaryotic),人（基因治疗）,动、植物（基因农场）,主要的蛋白质生产宿主系统,I 原核：大肠杆菌Escherichia coli * 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis *,II 低等真核： 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 毕赤酵母Pichia pastoris * 汉森酵母Hansenula polymopha * 黑曲霉菌Aspergillus niger *,III 高等真核： 中国仓鼠细胞（CHO） * 昆虫细胞杆状病毒*,重点：各自优缺点是什么？,表达载体的基本条件（关键元件）,1、高效的、可调控的表达元件 1）转录与转录后水平：DNA mRNA 原核：启动子、终止子 真核：启动子、终止子、增强子、PolyA位点、内含子 2） 翻译水平 原核：核糖体结合位点（如SD序列） 真核：5-端非翻译区（5-UTR） 3) 翻译后水平: 信号肽,重点：各宿主系统表达载体 的关键元件、调控原理与 优化策略？,表达载体的基本条件（关键元件）,3、便于筛选 大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建） 最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选） 4、便于目的基因亚克隆：多克隆位点,2、高拷贝数与遗传稳定,自主复制（高拷贝、不稳定） 整合（低拷贝、稳定）,典型的原核表达载体,典型的原核表达载体,典型的真核表达载体,第三章 大肠杆菌基因工程,Escherichia coli （SEM，14000）,四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化,三、工程菌构建策略,二、大肠杆菌表达系统高效表达原理,一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点,五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例,第三章 大肠杆菌基因工程,一、 大肠杆菌表达系统的优缺点,原核细胞与真核细胞的差别,生长速度惊人的大肠杆菌,遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作,表达水平高，遗传较稳定,优良的工业性能： 繁殖迅速、培养简单、操作方便、,被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统,大肠杆菌表达系统的优点,胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善,缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,大肠杆菌表达系统的缺点,初次尝试扫盲 乱棍打枣入门 系统优化中级 自成一体高手,成功的实验都是一样的， 失败的实验各有各的不幸,二、大肠杆菌系统高效表达原理,启动子（转录）,终止子（转录）,核糖体结合位点（翻译）,密码子（翻译）,质粒拷贝数（转录）,大肠杆菌系统表达载体的基本元件,A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因 B、转录元件：启动子、终止子 C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点 D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因 E、翻译后元件（非必须） ：信号肽、融合肽,大肠杆菌系统表达载体的物理图谱,1、启动子与外源基因表达,*是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始RNA合成的 序列。 *是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能转录）。 *启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效） *有组成型和诱导型二大类,启动子 (Promoter),组成型与诱导型启动子,*无需诱导 *整个生长过程一直不停地表达目的蛋白 *一般采用基础代谢关键酶基因的启动子 *不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物 *表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长,组成型表达系统,组成型与诱导型启动子,*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物 *使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养 和对菌体的毒害 *可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解 *特别适合解决有毒蛋白的表达 *启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是 诱导表达的，也属于诱导表达系统。,诱导型表达系统,原核基因启动子,原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成： （1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游510bp，一般由68个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或10区。 （2）35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称35区，一般由10个碱基组成。,启动子保守序列,-35 区序列,-10 区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,启动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,终止子,采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段,克隆到启动子探针质粒pKO1上,宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质,粒上报告基因galk的表达产物联合作用，,可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,常用原核基因启动子,lac (乳糖启动子) trp (色氨酸启动子) tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子 PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子) T7启动子,启动子,P,乳糖启动子（Plac） 负调控（lacI）：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,lacI 负调控,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,高水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,Plac,CAP正调控,O,Plac,O,高效转录,葡萄糖代谢,野生型的Plac上游附近拥有,代谢激活蛋白（CAP）结合,区，cAMP激活CAP，CAP,基底水平转录,结合启动子控制区，进而促,进Plac介导的转录。葡萄糖,代谢使cAMP减少，也能阻,遏Plac介导的转录。因此，,可采用突变手段构建抗葡萄糖代谢阻遏的,突变型，,即Plac UV5,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,Plac UV5,O,高效转录,突变型乳糖启动子Plac UV5,问题2 乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂 对策 采用“安慰诱导剂”IPTG（不被降解和代谢）,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,IPTG：异丙基 D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-D- thio galactoside),问题3： 宿主lacI 阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求， 导致较高的本底表达（即无诱导表达） 对策 A、采用能过量表达 lacI 阻遏蛋白的 lacI q 突变菌株 B、在 载体上引入 lacI q 基因,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,启动子,Ptrp,色氨酸启动子（Ptrp）,Otrp,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平转录,或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目,基因的表达,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效转录,Otrp,Ptrp,受 lacI 阻遏蛋白调控,杂合型启动子Ptac,Ptac = Ptrp 的-35区 + Plac的-10区,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,（T T G A C A）,（T A T A A T）,受什么诱导？,l噬菌体启动子PL / PR,受CI阻遏蛋白阻遏 CI为组成型表达 常采用温度敏感型突变cI857,cI857阻遏蛋在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达,实践中，28-37培养， 42诱导。30 /37 ？,发酵罐中大规模升温困难 如何解决？,常使Ptrp控制的CI 用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。,Ptrp,A,B,cI857,PL,目的基因,阻遏作用,Ptrp,A,B,PL,表达,色氨酸,T7启动子 来自T7噬菌体的异源启动子,T7启动子最成功的启动子,*只有T7 RNA 聚合酶才能识别 T7 启动子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合 酶的快 5 倍 *由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 *通过调控T7 RNA 聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达 *以 Novagen 公司的 pET 系统为杰出代表。,T7启动子调控模式,IPTG诱导T7RNA聚合酶表达 噬菌体 DE3 （ lambda 噬菌体的衍生株）含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 启动子下的 T7 RNA 聚合酶基因。 DE3 溶源化的菌株如 BL21(DE3) 就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和 lac 一样都是 IPTG 诱导。,T7启动子调控模式,2.热诱导T7RNA聚合酶 用不含 T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用 CE6 噬菌体侵染宿主细胞 CE6 是 lambda 噬菌体含温度敏感突变 (cI857ts) 和 pL/pR 启动子控制 T7 RNA 聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活 T7 RNA 聚合酶的合成。,T7启动子调控模式,3. 溶氧诱导T7RNA聚合酶 通过共转化质粒提供 T7 RNA 聚合酶。用受溶氧浓度控制的启动子调控 T7 RNA 聚合酶合成，以适合工业化发酵的条件控制。,T7启动子调控模式,4. 抑制本底表达方法 1）培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。 2)向宿主细胞引入T7 融菌酶质粒（pLysS ），结合并抑制 T7 RNA 聚合酶的基因。,2、终止子,外源基因本身的转录效率下降； 干扰质粒的复制及抗性，导致重组质粒 的不稳定性； 产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编 码产物的翻译效率。,转录过头现象： RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。,防止转录过头策略,大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 T7噬菌体DNA上的Tf,A、采用强终止子,B、二聚体终止子串联的特殊结构,终止子,强终止子的选择与使用,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选,pCP1,Apr,ori,Tcr,筛选Apr、Tcs的转化子,3、核糖体结合位点,核糖体结合位点（RBS）: mRNA 5 端非翻译序列,包括SD、起始密码子、SD与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。,商品化大肠杆菌表达质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的,核糖体结合位点,SD序列（Shine-Dalgarno）： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列（5 UAAGGAGG 3），它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。,核糖体结合位点,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,核糖体结合位点,SD序列与起始密码子之间的序列的影响：,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍,核糖体结合位点,翻译起始密码子及其下游序列 大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。,起始效率差异：GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。 从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,4、质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的克隆用质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 策略：较低拷贝质粒（几个至数十个） 调控重组质粒的扩增,质粒拷贝数,质粒扩增时序的控制,pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子,pCP3,PL,MCS,Ori 28 42,Apr,在28时，每个细胞的质粒拷贝数为60,在42时，拷贝数迅速增至300 - 600,在此温度下，受体细胞染色体上的CI基,因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活,因此，用一种手段同时控制质粒拷,贝数和基因的表达,5、密码子,宿主对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码,子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。,外源基因全合成,同步表达相关tRNA编码基因,满足宿主对密码子偏爱性的策略,密码子,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，