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质粒分子生物学与质粒技术 第1讲 质粒分子生物学概论 u什么是质粒 u质粒的复制分配和不相容性 u质粒的接合转移 u细菌质粒控制的表型 抗性质粒 毒力质粒 降解质粒 共生质粒 1 什么是质粒 1.1 定义和命名 质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子 ，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的 ，符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子 都可以称为质粒。狭义的质粒一般是指细菌染 色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小 写字母 p 加 2-3 个大写字母和数字，如 pJP4， pDTG1。 1.2 细菌质粒 细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状 DNADNA分子分子 ( (cccDNAcccDNA) )，其大小在其大小在1-1700 1-1700 kbkb之之 间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒 分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生 质粒等类型。质粒等类型。 1.3 真核生物的DNA质粒 u 环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线 立体中的环状DNA质粒，人和动物的核 DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽 质粒。 u 线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀 线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育 有关的线状DNA质粒。 1.4 真核生物的RNA质粒 u有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包 裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于 它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒 和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型 代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与 RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性 u无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊 中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体 中与雄性不育有关的dsRNA质粒。 2 质粒的复制、分配和不相容性 2.1 复制 (Replication) 质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列 控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小 区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是 复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码 蛋白质或RNA)。 2.3 不相容性 (Incompatibility) 两种质粒不能在同个寄主细胞中共 存的现象，叫质粒的不相容性。质粒之间的不 相容性，是由于它们存在种或几种与质粒复 制或分配有关的相同因子，如基本复制子中的 反向转录区(ColE1质粒的RNA)，ori区中的 重复子(Iteron)，与分配蛋白结合的分配位点。 不相容性是质粒分类的理想标准。肠道细菌质 粒分别属于30多个不相容组，用Inc表示。 3 3 质粒的接合转移质粒的接合转移 通过细胞与细胞之间的接触，使通过细胞与细胞之间的接触，使DNADNA从一从一 个细胞转移到另外一个细胞的现象叫接合个细胞转移到另外一个细胞的现象叫接合 (Conjugation)(Conjugation)。这一过程由接合性质粒的转移这一过程由接合性质粒的转移 ( (tratra) ) 基因区编码。被转移的基因区编码。被转移的DNADNA可以是接合质可以是接合质 粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性 质粒。得到供体质粒。得到供体DNADNA的受体细胞称为接合体或的受体细胞称为接合体或 接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为 接合频率。接合频率。 3.1 F质粒的接合转移机制 F质粒的分子大小为100 kb，编码接合 转移功能的tra基因区位于遗传和物理图谱的 66.6100 kb 位置，编码37个蛋白质和1个反 义RNA，这些分子分别负责性菌毛的合成和 装配，杂交对的稳定，表面排斥，DNA转移 ，以及tra区基因表达的调节。 图图1-10 F1-10 F质粒接合转移区的结构（质粒接合转移区的结构（66.6-100 kb66.6-100 kb区）区） traAtraA：性菌毛亚基；性菌毛亚基；traNtraN和和traGtraG：杂交对稳定；杂交对稳定； traStraS和和traTtraT：表面排斥；表面排斥；traMtraM：转移信号；转移信号； traYtraY：缺口酶；缺口酶；traItraI：DNADNA解旋酶；解旋酶； traDtraD：驱动单链驱动单链DNADNA转移；转移；traJtraJ、finOfinO、finPfinP：调节基因调节基因 3.2 细菌染色体的诱动 细菌的染色体与质粒的转移原点oriT 序列共价连接，染色体作为质粒DNA的延伸 部分被转移。可以利用这一功能定位染色体 基因，以及获得含有染色体片段的质粒。 3.3 非接合质粒的诱动 许多天然质粒虽然是非接合性的， 但仍然含有一个oriT位点和转移基因，当与 它共存的接合质粒提供一个接合系统时， 也能进行有效的转移，称之为诱动 (Mobilization)。 4 细菌质粒控制的表型 4.1 抗性质粒 包括抗菌素抗性（R）质粒和金属 抗性质粒。R质粒的进化、转移和扩散给抗 菌素治疗带来很大麻烦，是医学所面临的 重大问题之一。R质粒与转座子（ Transposon）和整合子（Integron）的相互 作用，使细菌耐药性问题更加严重。 4.2 毒力质粒 许多细菌的致病力和毒性与质粒有 关，如大肠杆菌肠毒素和定居抗原，破伤 风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽 孢杆菌的杀虫晶体蛋白，植物冠瘿病（Ti 质粒）和发根病（Ri质粒）。 pTi-SAKURA的分子结结构（206479 bp，195 ORF） 毒力基因（22）：virA, virB1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11, virC1C2, virD1D2D3D4, virE1E2, virG, virH T-DNA基因（16）：tms1, tms2, tmr, nos, acs(2), e, 5, 6a, 6b, 21-h, rolB-h, 5-h, IS ORF(2), tiorf174 复制基因（3）：repA, reB, repC 接合基因（20）：traCDG, traAFB, traM, traR, traI, trbBCDEJKLFGHI 其它基因（50）；未鉴定的ORF（84） 引自：K. Suzuki et al. / Gene 242 (2000) 331-336 4.3 降解质粒 许多环境污染物的降解途径由质粒基因 编码，降解基因组成几个操纵子，操纵子的表 达受调节基因控制。目前，已经测定全序列并 注释基因的降解质粒有10余种，分别是尼龙寡 聚体降解质粒pOAD2，芳香烃降解质粒pNL1 ，除草剂阿特拉津降解质粒pADP-1，甲苯降 解质粒pWWO，烟碱降解质粒pAO1，咔唑降 解质粒pCAR1, 异丙基苯降解质粒pBD2，卤乙 酸降解质粒pUO1，2,4-D降解质粒pJP4，萘降 解质粒pND6-1和pDTG1。 The catabolic plasmids that complete sequence has been determined Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic References genes pOAD2 Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585 pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol. m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585 pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB J. Bacteriol. atzC,atzDEF 2001,183:5684 pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi Microbiol. 2002,4:856 pAO1 Nicotine Arthrobacter 165137 ndh, 6hlno J. Bacteriol. nicotinovorans kdh, dhph 2003,185:1976 pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mol. Biol. antABC 2003,326:21 pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269 pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741 pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB EnviMicrobiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tfdCDEF 2004,6:655 pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231 pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:753 4.4 共生质粒 在许多根瘤菌属细菌中存在与结瘤和 固氮有关的共生质粒，质粒的大小在1000 kb 以上，与细菌染色体基因一起行使固氮功能。 Sinorhizobium meliloti 的豆科共生复合基因组 由3部分组成：染色体为3654135 bp，pSymA 为1354226 bp（结瘤和固氮），pSymB为 1683333 bp。 中华苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021的基因组组成 性质 染色体 pSymA pSymB 基因 组 长度(bp) 3654135 1354226 1683333 6691694 蛋白基因 3341 1293 1570 6204 tRNA基因 51 2 1 54 rRNA操纵子 3 0 0 3 共生功能 菌毛合成 菌毛合成 表面多糖 结瘤，固氮 表面多糖 固 氮 第2讲 质粒技术 1. 质粒的分离和纯化 2. 质粒的拷贝数测定 3. 质粒DNA转化 4. 细菌杂交实验 5. 质粒的限制酶作图 6. 质粒基因定位 7. 质粒测序和基因注释 8. 质粒克隆载体 1 质粒的分离和纯化 分离：SDS温和裂解法；碱SDS室温 裂解法；碱SDS加热 (5065) 裂解法；煮 沸裂解法；碱SDS蛋白酶裂解法。 纯化: CsClEB密度梯度离心法 (角转 头：40000rpm, 40h；近垂直转头：78000rpm, 4.5h)；低熔点琼脂糖凝胶回收法；凝胶冻溶法 ；凝胶透析袋回收法；凝胶透析膜回收法；纯 化kit。 u细胞裂解物进行琼脂糖凝胶电泳，荧光扫描染色体 DNA带和质粒DNA带，根据峰面积计算质粒占总DNA 的百分数(RP)。 RP = (1.36质粒峰面积)(染色体峰面积 +1.36质粒峰面积) u测定一个细胞中总DNA的含量 (Mc = DNA的g数 细胞数)。 u计算一个质粒的质量： MP = 质粒 bp 数6601.6510-24 g u计算质粒拷贝数：CP = (MCRP)MP 2 2 质粒的拷贝数测定（质粒的拷贝数测定（凝胶带荧光光密度测定法）凝胶带荧光光密度测定法） 3 质粒DNA转化 质粒转化主要有3种方法：钙诱导的感受态转 化，原生质体转化，电穿孔转化。影响转化的因素 ：质粒的大小、纯度、浓度、构型、稳定性和是否 被修饰；受体细胞的菌龄、用量、限制-修饰系统和 重组功能，是否有不相容性质粒，与质粒原来寄主 的亲源关系；筛选药物的浓度。 转化频率（transformation frequency）：每个 活细胞产生的转化子数，测定时使用饱和DNA浓度 。 转化效率（transformation efficiency）：每 mg DNA产生的转化子数，测定时使用亚饱和DNA浓 度。 4 细菌杂交实验 u滤膜杂交：混合供体和受体菌培养物，用孔径为 0.45mm的滤膜过滤，带菌的滤膜在营养平板上培养 过夜，用无菌水洗下膜上的细菌，涂选择平板，筛 选接合体。 u平板杂交：在选择平板上涂布供体菌和受体菌的 混合物或分别划线受体菌和供体菌，培养过夜，长 出的菌落为接合体。 u液体杂交：静止培养供体菌和受体菌的混合物， 然后涂选择平板，筛选接合体。 例：PpG378 (Leu-Nah+) PpG376 (Leu+Nah- ) 5 质粒的限制酶作图 制作质粒限制图的方法主要有直接酶切法、 重叠片段克隆法和测序法。直接酶切法是通过限制 酶的完全消化和部分消化，确定各种限制酶切割位 点在质粒中的位置，适用于小质粒；重叠片段克隆 法是先进行限制片段的克隆，确定每个克隆片段的 限制酶位点，以及各克隆片段在质粒中的排列顺序 ，最后得到整个质粒的限制图，适合于较大的质粒 。最理想的方法是先测定质粒的核苷酸序列，然后 根据限制酶的识别序列用计算机作图，适合于所有 质粒，特别是巨型质粒。 pND1.860质粒的限制酶作 图 （重叠片段克隆法） 作图策略： uHind、EcoR和Xba单酶消化：测定 限制片段大小和切点数。 uHind完全消化片段克隆Hind + EcoR消化：确定Hind片段中的EcoR位 点 uHind部分消化片段克隆： Hind消化，确定Hind片段排列 顺序 EcoR消化，确定EcoR位点 EcoR+ Xba消化，确定Xba位点 6 质粒基因定位：转座子插入突 变法 把携带转座子的质粒引入含有待测质 粒的细胞中，筛选并收集含有插入突变的细胞 ，通过限制酶分析确定插入位点，然后测定含 有转座子插入的细胞其待测基因是否失