微生物培养基的配制和灭菌.ppt

Exercise six 微生物培养基的配制和 灭菌 制作者：黄海婵（） Telorl目的要求 l实验材料 l实验程序 实 验 内 容 目 的 要 求 l1.明确培养基的配制原理和方法，掌握其 配制的一般方法和步骤。 l2.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和 加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 l3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工 作及操作方法。 实 验 材 料 l药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可 溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O 等。 l仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫 外线杀菌灯。 l其它物品：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH 试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠 的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、 吸管、各种包装纸、牛皮纸、绳索、棉花、标签等。 实 验 程 序 l培养基的配制 l微生物常用器皿的准备 l培养基和玻璃器材的灭菌方法 实 验 程 序1 （培养基的配制） l培养基的种类 l培养基的配制方法和步骤 l培养基的配方及配制分组 实验程序11 （培养基的种类） l据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物 质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 l从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的 固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂 而成的半固体状培养基。 实验程序11 （培养基的种类） l常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。 实验程序12 （培养基的配制方法和步骤） l称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 l溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 l调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 l加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 l过滤 l分装：注意不要污染棉塞。 l包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 l灭菌 l摆斜面 l检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方 可使用。 按培养基 配方称量 加水加 热熔化 调节 pH值 过滤 分装 包装 灭菌 检查灭菌 彻底与否 实验程序12（培养基的配制方法和步骤） 摆斜面分装 实验程序12（培养基的配制方法和步骤） 包扎 实验程序12（培养基的配制方法和步骤） 灭菌 高压蒸汽灭菌法 干热灭菌法 紫外线杀菌法 祥看实验程序4 中的具体内容 培养基的配制和灭菌过程中的注意事项 l1.蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。 l3.在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸 腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧 焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免 离子进入培养基中，影响细菌生长。 l4.pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的 浓度。 5.分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以 免污染棉塞而引起污染。 l2.称药品时严防药品混杂，一把牛交匙用于一种药品 ，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品 。瓶盖也不要盖错。 l6.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排 除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的 膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下 ，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。 l不能灭菌的物质： l 1.爆炸性物质 l硝化丙烷 、硝化甘油、硝化纤维，含氮硅酯。 l三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮 复合物。 l过醋酸 、过氧化甲乙酮、过氧化苯甲酰和其它过氧化 有机物。 l 2.lgnitable 物质 l金属锂、钾、钠、黄磷、氧化硫，和红磷。 培养基的配制和灭菌过程中的注意事项 实验程序21（培养基的配方及配制分组） l牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一 种天然培养基）配方如下（书中P50和P214）： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 1520g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 121，20min （第一组、第二组、第三组第四组配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，每 组九瓶，牛皮纸上标注“牛”） （第五、六组配制牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基各40支/小试管） 实 验 程 序22（培养基的配方及配制分组） l马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离 和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下（书中 P215 ）： 去皮马铃薯200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 1520g pH 自然 灭菌： 121，20min l马铃薯须煮沸30min之后，要用纱布过滤。 （第七组配制，每组九瓶，标注“马” ） 实验程序23（培养基的配方及配制分组） l淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放 线菌，是一种合成培养基。配方（书中P54和P214）如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 121 20min 淀粉先用冷水调成糊状，倒入煮沸的水中。 （第八组配制，每组九瓶，标注“高” ） 实验程序24（培养基的配方及配制分组） l伊红美兰培养基（EMB培养基）。配方如下（ 书中P220）： 蛋白胨水琼脂培养基 （即蛋白胨水培养基（P217）+2%琼脂） 共九瓶 100ml 20%乳糖溶液 （一瓶） 50ml 2%伊红水溶液 （一瓶） 50ml 0.5%美蓝水溶液 （一瓶） 50ml （第九组配制，标注“伊” ） 121，灭菌 20min 115 灭菌 ，20min 实验程序25（培养基的配方及配制分组） l牛肉膏蛋白胨培养基+2%葡萄糖，配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 葡萄糖 2g 琼脂 1520g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 121，20min （第十组配制，每组九瓶，标注“肉葡” ） 实验程序26（培养基的配方及配制分组） l丙丁斜面培养基是一种合成培养基。配方如下： 葡萄糖 4% 进口胰蛋白胨 0.6% 醋酸铵 0.3% 酵母膏 0.2% 牛肉膏 0.2% 硫酸镁 0.02% 硫酸亚铁 0.001% 琼脂 2% 灭菌： 121，20min （第十一组配制，每组40支斜面/小试管） 实验程序27（培养基的配方及配制分组） l乳糖蛋白胨培养液（“水的细菌水检查”）。配方如下（书中 P220）： 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 乳糖 5.0g NaCl 5.0g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 水 1000ml 灭菌： 115 30min 在加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 之前，将其它物质混合溶解之后调pH至7.2 7.4。 每只试管中加入5ml培养液，试管中必须放置倒置管 （第十二、十三组配制，每组40支大试管） 实验程序28（培养基的配方及配制分组） l三倍乳糖蛋白胨培养液（“水的细菌水检查”）。配方如下（ 书中P220）： 蛋白胨 10.0g 3 牛肉膏 3.0g 3 乳糖 5.0g 3 NaCl 5.0g 3 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 水 1000ml 灭菌： 115 30min 在加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 之前，将其它物质混合溶解之后调pH至7.2 7.4。 每只试管中加入5ml培养液，试管中必须放置倒置管 （第十四、十五组配制，每组20支大试管） 实验程序29（培养基的配方及配制分组） l无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离 实验中所需要的材料。 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水 45.0mL，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞， 包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好 棉塞，并经干热灭菌。 实验程序3 （微生物常用器皿的准备和包扎） l清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培 养皿、吸管等。 l棉塞的制作 l包扎培养皿、涂棒和吸管等。 点击录像 实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法） l干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 l加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.加水：灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其 中。 2.通电：接通电源，进行加热。 3. 排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关 闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀 ，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.恒温灭菌：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内 的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、 氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.结束：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气 阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。 实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法） 实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法） l间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每 次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将 物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样 可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以 便下次蒸煮时杀灭。 l过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般 可用细菌过滤器进行除菌。（教师示范） 实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法） 实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法） 实验程序4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法） l紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h ，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒 剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱， 即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于 空气及表面杀菌。 l化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有