毕业论文-银杏内生真菌分离培养及生物活性测定.doc

化学工程与食品科学学院化学工程与食品科学学院 毕毕 业业 论论 文（设文（设 计）计） 题题 目：目：银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 专专 业：业： 生物科学生物科学 班班 级：级：09110911 班班 学生姓名：学生姓名： 岳继萍岳继萍 学学 号：号： 20091241212009124121 指导老师：指导老师：阎阎 华华 二二一三一三 年年 五五 月月 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 i 摘摘 要要 内生真菌是一类生长于活体植物组织中的特殊的真菌，研究相对较少，生长于独 特环境中，具有药用价值树龄长或有地域特色的植物中一般都能分离出新的内生菌， 而新种或罕见菌种又能为寻找新型生物活性物质提供前景.银杏是我国特色珍稀植物， 具有。活化石。之美称。银杏在生长期间很少感染病虫害，寿命极长，因此具有很好 的挖掘新型内生真菌的潜力，本研究采集湖北省襄阳市湖北文理学院内银杏枝条和树 叶，采用组织分离法分离其中的内生真菌，筛选具有杭菌性和抗氧化活性的菌株并通 过形态特征进行初步鉴定；对其中三株株杭菌活性显著且稳定的不产孢菌进行形态学 研究和分子解析，对培养条件和培养基组成进行优化，进而分离其发酵产物中的抗菌 活性物质并进行结构鉴定，为进一步工业化生产应用提供工作基础和依据。 银杏， 又名白果， 是我国特有的世界珍稀名贵树种， 是冰川运动遗留的孑遗植物， 被称为活化石， 具有极高的研究开发价值。银杏各组织含有抑菌物质， 据报道， 银 杏根、茎、叶、果肉(外种皮)及果仁的提取物对水稻纹枯病菌、黄瓜炭疽病菌和番茄 青枯病菌等有明显的抑制生长作用 6 8 。本研究以银杏为材料， 从中分离筛选具 有抑菌作用的内生真菌， 旨为新型微生物源农药的研制和开发提供优良的出发菌株。 关键词：关键词： 内生真菌内生真菌 银杏银杏 抗菌性抗菌性 分离分离 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 ii Abstract Endophytic fungi is a kind of special fungus growth in living plant tissue,whitch research is relatively small,it grew up in special environment, with medicinal value and old long or have regional characteristics of plants in general can be new endogenous bacteria was isolated, while new species and rare species can provide prospects for search for new bioactive substances. Ginkgo is characteristics of rare plants in our country, has“ Living fossils” good name. Ginkgo rarely infection diseases and pests during growth, its life is very long, so it is good to dig up the potential new type of endophytic fungi, this study collected hubei province of hubei liberal arts college in ginkgo biloba leaves and branches of xiangyang city, using chromatography separation of endophytic fungi, bacteria screening with antimicrobial properties and antioxidant activity of strains and preliminary identification of morphological characteristics; Significant activity of three bacteria antimicrobial properties and stable does not produce robe, studied the morphological and molecular analysis, optimize the culture conditions and medium composition, antibacterial activity of the fermentation substances into miseparation and structural identification, for further industrialized production application work provide dhi and basis. Ginkgo, also known as ginkgo, is our country unique rare and precious tree species, and the movement of glacier is the legacy of precious plants, known as living fossils, the research and development has a very high value. each group of ginkgo contains antibacterial substances, according to reports, root, stem and leaf, ginkgo pulp (testa) and the nut extracts of rice sheath blight fungus, a cucumber anthrax and solanacearum, have obvious effect on inhibition of growth . This study material for ginkgo, separating filter has the bacteriostasis of endophytic fungi, purport for the development and the development of new microbial pesticides provide excellent strains. Key words： Endophytic fungi；Ginkgo；antimicrobial properties；separation 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 1 目录目录1 1 1前言前言2 1.11.1 内生真菌内生真菌.3 1.1.1 植物内生真菌简介3 1.1.2 内生真菌多样性3 1.1.3 内生真菌的生物学作用4 1.2 植物中银杏内生真菌的研究概况 .5 1.3. .本研究主要内容和意义.5 2.2.实验实验6 2.1 实验材料.6 2.1.1银杏样品来源和采集方法.6 2.1.2 抗菌实验指示菌.7 2.1.3 培养基187 2.1.4. 主要仪器设备.7 2.1.5. 主要试剂.8 2.2 实验方法 .9 2.2.1.内生真菌分离方法.9 2.2.2 内生真菌的液体培养及抗菌试验.9 2.2.3. 内生真菌 XY28 菌株 DNA 的提取.9 2.3 结果和分析 .10 2.3.1 银杏内生真菌的分离方法比较10 2.3.2 抗菌活性菌株的筛选12 3 3 讨论讨论.15 4.4. 小结小结17 致致 谢谢17 参考文献参考文献18 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 2 1 1前言前言 植物内生真菌是一类生长于健康活体植物组织中的特殊的真菌，它们是植物组织 内的正常菌群，主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状。尽 管近二十多年来人们对内生真菌的研究越来越关注，但相对于其它真菌类群来说，对 内生真菌的研究还比较肤浅。目前世界上许多人都在对内生真菌进行分离并研究其产 物。内生真菌与宿主长期共存，因此可能存在着能与植物宿主的遗传信息相互交换的 遗传系统，能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。与植物表面菌或土壤微生物 相比，内生菌与相应宿主有着更近的生物联系，因此可被利用生产大量的生物活性物 质。最近有研究表明：从内生真菌中分离到的生物活性物质，有 51%是以往不为人知 的，而相比之下，土壤菌群只有 38%。银杏是我国的一种珍稀植物，是现存种子植物 中最古老的“活化石” ，含有丰富的营养保健因子(如银杏内醋和银杏黄酮)，同时具有 很强的抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等作用，在生长过程中几乎不感染病虫害、寿命极 长，因此从银杏中分离到具有抗菌活性的内生真菌的可能性非常大。本研究从银杏枝 条和树叶中分离内生真菌，从中筛选具有抗菌活性的菌株，对其中一种活性稳定的非 产孢菌株进行形态学研究对其发酵条件和培养基组成进行优化，进而研究了发酵产物 中具有抗菌活性的化学组成，鉴定了其中一种物质的结构，另外，提取了该菌的 DNA 物质，为进一步研制开发优良的功能性食品添加剂打下了基础。 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 3 1.11.1 内生真菌内生真菌 1.1.11.1.1 植物内生真菌简介植物内生真菌简介 植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组 织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通 过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物 DNA 的方法来证明其内生1 。植物内生菌是植物组织内的正常菌群，它们不仅包括 了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物， 主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状2。内生菌包括内生 细菌和内生真菌，其中内生真菌的分离频率最高，自 1898 年 vogl 从黑麦草 Lolium temulentum L.种子内分离出第一株内生真菌至今，关于内生真菌的研究已有一百多年 的历史，但由于内生菌生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用 长期以来一直为人们所忽视。尽管近二十多年来人们对内生真菌的研究越来越关注， 但相对于其它真菌类群来说，对内生真菌的研究还比较肤浅。 1.1.21.1.2 内生真菌多样性内生真菌多样性 地球上有上百万种植物，几乎所有的植物中都有内生菌。全世界现已发现 69000 多种真菌，而且每年还以 1000 余种的新种递增，保守估计全世界真菌总数可达 150 万 余种3。从目前已经研究过的植物来看，还没有发现未分离到内生真菌的物种，因此可 以推断内生真菌在植物体内是普遍存在的4 。目前发现的内生真菌大部分是子囊菌类 (Ascomycetes )，包括盘菌纲(Discomycetes )核菌纲(Pyrenomycetes )、和腔菌纲 (Leculoascomycetes)，少数为结合菌类和担子菌类Basidiomycetes)。常见的属有：曲 霉属 CAspergillus)、毛霉属(Mwcott)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟莲点霉属 Phomopsis)、叶点霉属(Phyllos.ticta、 、嫌孢霉属 CFusarium)等5。植物内生菌是一个 十分丰富的微生物类群，其内生菌种类和分布因植物种类及环境的不同而异。内生菌 系统地分布于植物体的各部分组织、器官及细胞间隙中，其中叶、叶鞘和种子内的菌 丝含量最多6。植物的种类本身、所取样本的多少和样本地周围环境因子的不同，都 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 4 会影响分离到的内生菌的数量。同一植物的不同组织其内生菌的种类不相同，不同季 节同一植物内生菌的种类和数量也不相同7。 1.1.31.1.3 内生真菌的生物学作用内生真菌的生物学作用 内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，在演化过程中二 者形成了互惠共生关系，一方面内生真菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一 方面内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。而且，内生真菌分 布于植物组织内，可获得足够的碳源、氮源，受到植物组织的良好保护，因而比暴露 于恶劣环境的附生菌和腐生菌具有更稳定的生存环境，更易于发挥作用。研究表明， 感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比 未感染植株更具生存竞争力。在内生菌一植物宿主一食草动物生态系统中，植物内生 菌扮演着前所未知的重要生态学作用。发挥这些作用的物质基础是内生菌产生的丰富 多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业和(或)医药业中具有重要的应用 潜力。 （1）增强宿主的生长 许多内生菌可产生 IAA、叫噪乙睛以及细胞激动素等植物生长激素促进宿主生长， Lu 等从黄花篙中分离到的一株内生真菌在发酵液中也能积累 IAA8，因此感染内生真 菌的植物一般比未感染内生真菌的植物生长快。另一方面，内生菌可增进宿主植物对 氮、磷等营养元素的吸收。Lyons 等发现在低水平氮源的土壤中，内生真菌可增加宿主 对氮元素的吸收，在侵染内生真菌的高羊茅的叶子中，氮元素的含量明显高于没有感 染内生真菌的高羊茅9 。 （2）增强宿主对环境胁迫的抵抗能力 Clay 等发现侵染内生真菌的草遭受真菌病害影响的程度远低于没有感染内生真 菌的10，这是因为有的内生真菌在宿主内和纯培养中产生有毒物质，如麦角生物碱等， 这些内生真菌的代谢产物可对植物致病菌、线虫、昆虫及哺乳动物有抗性。另外，内 生真菌可增强宿主抗干旱的能力。 (3)产生重要药理活性物质 研究表明，内生真菌可产生丰富多样的次生代谢产物，有的物质与宿主来源的物 质类似，如抗菌素11-12、植物生长调节剂13、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等。 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 5 植物来源的活性物质含量一般很低，而且目前世界上的植物资源也日益减少，因此从 植物中分离这些物质的成本很高，如紫杉醇每克高达 6000 美元14。若能利用植物内生 真菌发酵产生活性物质，则成本、价格必然下降，对保护环境亦有重大贡献。 1.21.2 植物中银杏内生真菌的研究概况植物中银杏内生真菌的研究概况 银杏(Ginkgo biloba L.)是我国特有的多用途树种，起源于 2 亿 3 千万年前的石 炭纪，是最古老的中生代孑遗植物之一，基本保持了 1.5 亿年前的生态特征。因而成为 一科一属一种的特殊植物。银杏曾广泛分布于北半球，到了新生代的第三纪末和第四 纪初，北半球进入冰川期，世界上大部分地区的银杏完全绝种，惟独我国少数地区的 银杏幸免于难，成为现存种子植物中最古老的。活化石。银杏含有丰富的营养保健因 子(如银杏内酷和银杏黄酮)，同时具有很强的抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等作用，许多 植物生态学家和生理学家对银杏进行考察研究，认为其在逆境中几乎不感染任何病虫 害、寿命极长的奥秘关键在于银杏体内、叶中细胞组织中含有一种自卫免疫抗菌的特 殊化学物质，即杀菌素，如 a 一乙烯醛和多种有机酸等。目前通过利用银杏内生真菌 的方法来获得代谢产物的研究还不多。 蒋继宏等分离出一株产香银杏内生真菌彻 arium sp，采用 Gc 舰 s 对挥发油进行分 析，分离出 24 种组分，鉴定出 15 种成分，并发现该挥发油具有抗菌活性。申屠旭萍 等15从银杏茎中分离到一株内生真菌，在离体条件下发酵液对番茄早疫病菌、黄瓜枯 萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌均有较强的抑 制作用，对不同病原菌的抑制率分别为 66.7%、48.3%、64.6%、36.5%、57.1%、23.0%，抗菌活性成分在 80e 以下趋于稳定， pH 为 7 一 8 时抑菌效果最强，并研究了不同碳源、氮源、无机离子对内生真菌生物学 特性和生长的影响，结果发现玉米粉、黄豆饼粉比较适合其生长和抗菌代谢产物的合 成，Na+对抗菌代谢产物的合成有较明显的促进作用16。申屠旭萍和俞晓平从银杏的 根、茎、叶中分离到/株内生真菌，发现内生真菌数量与银杏树龄有关，树龄越高，其 含有的内生真菌数量越多，抗菌试验测定结果表明其中 29 株银杏内生真菌代谢产物对 农作物病原真菌具有一定的抑制作用。 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 6 1.3.1.3. . .本研究主要内容和意义本研究主要内容和意义 随着人们对食品安全的要求日益强烈，对天然抗氧化和抗菌剂的研究也日益增多。 食品的微生物腐败是一个全世界广泛关注的问题，为了延长食品原料及产品的货架期， 必须严格控制其中微生物的生长。但近年来由于抗生素和食品保藏剂的广泛使用，出 现了越来越多的耐药性菌株，因此有必要寻找各种来源的新型抗菌剂。微生物领域就 是一个极具吸引力的天然活性物质来源。除此之外，脂质氧化也是一个易引起食品败 坏的因素，并且与各种人类疾病息息相关，如炎症、衰老和癌症。为了解决这一问题， 合成的抗氧化剂在工业中得到了广泛的应用。但营养学和毒理学的研究结果表明这些 合成的抗氧化剂具有毒副作用，如常用的二丁基轻基甲苯(BHT)、对丁基轻基茵香醚 (BHA)对生物体有致癌作用，因而引起了社会的关注17。银杏内生真菌分离鉴定及其 抗菌抗氧化作用研究相对于化学添加剂来说，植物、微生物等产生的天然生物活性物 质具有安全、高效、低毒、不在人畜体内积累等特点，为新型添加剂的应用开拓了美 好的前景。在目前普遍采用的植物源物质方面，由于没有统一的规划，滥采乱采、重 复试验等现象时有发生。同时，植物资源本身比较稀少，生长速度相对缓慢，再生较 难，容易造成生态破坏等问题，制约了植物源产品的开发。而生活在植物体内这一特 殊进化环境中的内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物，目前 对这一领域的开发和研究相对较少，研究发现内生真菌产物中存在多种新型活性物质， 如抗病毒、抗菌、抗癌等物质。对这一领域的开发研究在很大程度上避免了传统的开 发土壤微生物所遇到的重复筛选的缺点。且真菌易于培养，可以通过育种手段和培养 条件优化来大幅度提高其有效成分的产量，以便应用于工业化生产，因而具有广阔的 前景。但目前对内生真菌抗氧化和抗菌的研究还很少。本研究从我国珍稀植物银杏出 发分离筛选得到多株内生真菌，并对其中一株为 YX.28 的菌株进行系统抗菌活性研究， 以期为应用于食品工业或医药提供工作基础。 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 7 2.2.实验实验 2.12.1 实验材料实验材料 2.1.12.1.1银杏样品来源和采集方法银杏样品来源和采集方法 采集湖北省襄阳市湖北文理学院内银杏树上直径为 2 一 3cm 左右的健康树枝及新 鲜树叶，经 70%酒精表面擦洗消毒后在火焰上灼烧 10s 左右使酒精挥发，标号，存放 于灭菌小袋中。4保存，待分离。 2.1.22.1.2 抗菌实验指示菌抗菌实验指示菌 大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.2420)、金黄色葡萄球菌(Staphylocous aureus AS 1.1865)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红酵母 (Rhodotorula sp.)、青霉(Penicillium sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)。以上供试菌种均由 本研究室保存。 2.1.32.1.3 培养基培养基18 18 银杏内生真菌分离培养基：水琼脂培养基(琼脂 20g，水 l000ml)；孟加拉红培养 基(分别在 PDA、CMA、SDA、YEA 培养基中加入孟加拉红使其终浓度达 40PPm)； PDA：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20g，水 1000ml，自然 pH，121、 20min 灭菌；液体 PD 不含琼脂； CMA：玉米粉 40g，蔗糖 10g，琼脂 20g，水 l000ml，自然 pH，121，C、20min 灭菌； SDA：蛋白陈 10g，麦芽糖或葡萄糖 40g，琼脂 15g，水 1000ml，调节 Ph5.0， 121、20min 灭菌； YEA：酵母膏 5g，葡萄糖 20g，硫酸钱 0.72g，磷酸二氢钱 0.26g，琼脂 12g，水 1000ml，调节 pH5.5，121、20min 灭菌； 查氏培养基：蔗 20g，硝酸钠 3g，氯化钾 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，磷酸氢二钾 1g，硫酸镁 0.5g，水 1000ml，琼脂 15g。121、15min 灭菌； 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 8 麦芽培养基：麦芽糖 12.75g，糊精 2.75g，甘油 2.75g，蛋白陈 0.28g，琼脂 15g， 水 1000ml，调节 pH 至 4.5。12l、15min 灭菌； 细菌培养基：肉汤培养基(牛肉膏 3g，蛋白陈 10g，氯化钠 5g，琼脂 12g，水 1000ml，PH7.0 一 7.2)； 2.1.4.2.1.4. 主要仪器设备主要仪器设备 全温摇瓶柜太仓实验设备厂 生化培养箱上海益恒实验设备有限公司 洁净工作台苏净集团安泰公司 数显恒温水浴锅国华电器有限公司 电泳仪北京六一仪器厂 分光光度计HITACHI 离心机上海安亭科学仪器厂 PCR 仪BIO.RAD 真空冷冻干燥仪德国 CHRIST 公司 电热手提式压力蒸汽消毒器上海医用核子仪器厂 生物显微镜尼康 H60OL 扫描式电子显微镜，HnACHI 2.1.5.2.1.5. 主要试剂主要试剂 （1）10%SDS(pH7.2)：90ml 水中加入 10g 电泳级十二烷基磺酸钠(SDS)，加热至 68 助溶，用 Na0H 调 PH7.2，加水定容至 100ml。 （2）氯化苄法抽提液(100mmol/LTris 一 HCI，pH9.0；40mmnol/LEDTA，pH8.0)先配 制母液： 500mmol/L Tris-HCI(pH9.0)：在 80ml 水中加入 6.055g 三轻甲基氨基甲烷(Tris)，溶解 后用稀盐酸调 pH9.0，定容至 100ml，灭菌备用。 500mmol/L EDTA（pH8.0) ： 在 80ml 水中加入 18.61g 乙二胺四乙酸二钠 ( Na2 EDTA2H2O)，用 NaOH(约 2g)调 pHS.0 加水定容至 100ml，灭菌备用。 抽提液配制：于 60ml 水中加入 20ml 500mmol/L Tris 一 HCI(pH9.0)和 8ml 500mmol/L 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 9 EDTA(pH8.0)加水定容至 100ml。 (3)3mol/LNaAC(PH5.2)：80ml 水中加入 24.609g 无水乙酸钠(NaAC)，调 pH5.2，加水 定容至 100ml，灭菌备用。 (4)苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V) (5)乳酸石炭酸：称取乳酸(比重 1.2)20g、石炭酸 20g、甘油(比重 1.25)40g、蒸馏水 20ml。配制时先将石炭酸加热溶解，倒入水中，再慢慢加入乳酸和甘油。 (6)戊二醛溶液：称取戊二醛溶解于 0.1M PBS(pH7.0)中，25放置 4h 配制成 30g/L 的溶液； (7)氯化苄、异丙醇、无水乙醇、二氯化汞(升汞)为分析纯试剂。 2.22.2 实验方法实验方法 2.2.1.2.2.1.内生真菌分离方法内生真菌分离方法 样品表面消毒处理为：0.2%升汞溶液浸泡 lmin无菌水冲净70%酒精浸泡 lmin 无菌水冲净酒精灯火焰灼烧 10s。 将树枝样品锯成 0.5 一 1cm 长的小段或完整的树叶样品切割成 0.5x0.5cm 大小的小 方片，按上述表面消毒处理后，置于分离平板上，25黑暗培养。对照平板为未经表 面消毒处理的样品直接置于平板上以及经表面处理的样品置于平板上 5min 后取出。至 少培养 7 天后样品表面或边缘出现菌丝生长，挑取与对照平板上不同的所有种类的菌 丝转接到新鲜 PDA 培养基上培养，待纯化后分别制成斜面 4保存。根据在 PDA 培养 基上是否产生孢子进行初步分类。 2.2.22.2.2 内生真菌的液体培养及抗菌试验内生真菌的液体培养及抗菌试验 挑取经活化的内生真菌菌丝或孢子接种于 PD 液体培养基中，25、120r/min 黑暗 培养，至有大量菌丝颗粒出现后作为种子液以 10%接种量接入新鲜 PDA 液体中，静置 培养。5000r/mln 离心 15min 去除菌丝体，收集上清液，冷冻干燥。用适量无菌水洗下 冷冻干燥的残留物，制成加倍的浓缩液，4保存待用。 采用改良的平板孔阱扩散法研究发酵浓缩液的抗菌活性。将活化好的 7 种抗菌试验 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 10 指示菌种用冷却的肉汤培养基(细菌)或 PDA 培养基(真菌)稀释至 106 cfu/ml(细菌)或 106 /ml 个细胞或孢子 (真菌)以上，倒平板。待培养基冷凝后，用直径为 7mm 的打孔 器于平板上均匀打出三个孔，吸取 10uL 融化的培养基封底以防止培养基与平皿底的出 现裂隙。分别吸取处理好的真菌发酵液 100uL 注入孔中，37(细菌)或 25(真菌)下分 别培养 24h、96h 后测量抑菌圈大小，计算平均值。 2.2.3.2.2.3. 内生真菌内生真菌 XYXY2828 菌株菌株 DNADNA 的提取的提取 采用改良的氯化苄法17 (l)取 0.1g 左右冻干菌丝加液氮研磨，转移至 7ml 灭菌离心管中，依次加入抽 提液 2mL、10%SDS0.4ml、氯化苄 1.2ml，振荡使成乳状，50水浴 l2h，其间每隔 l0min 振荡混匀一次。 (2)加入 l.2ml 3MNaAc，冰水浴 15min，6000rpm 离心 l5min。 (3)吸取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(24：l)轻轻颠倒混匀。9000rpm 离心 10min。 (4)吸取上清液至干净离心管，加入 0.81 倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰 箱冷冻层放置 40min2h，可见白色絮状沉淀。 (5)10000rpm 离心 10min，弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀。加入 0.lml 无菌重 蒸水溶解沉淀。 2.32.3 结果和分析结果和分析 2.3.12.3.1 银杏内生真菌的分离方法比较银杏内生真菌的分离方法比较 共分离纯化得到菌株 55 株，根据形态学特征进行初步鉴定，结果见表 2-1。通过 在培养基中加入孟加拉红抑制细菌和部分酵母的生长，同时采用 4 种不同的培养基进 行分离，获得了 29 株菌种，其中 65.52%在 PDA 培养基上为产孢真菌，且交链孢霉属、 曲霉属和青霉属等环境常见菌较普遍，不产孢真菌只有 31.03%。由于孟加拉红银杏内 生菌的分离与抗菌活性菌株的分类鉴定的使用也会影响某些真菌的生长，故实验又采 用了水琼脂平板，目的是建立与宿主植物内环境类似的生态模型，从而较为真实地反 映植物内生菌的生物学特征，所分离的菌株中 73.08%在 PDA 培养基上为不产孢真菌， 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 11 实验组平板上出现的菌落明显不同于对照组，且表面消毒的样品与平板接触后无菌生 长，说明表面消毒彻底，无表面菌的污染和干扰（2-1 所示)。已有的研究表明，植物 内生真菌长期与宿主共存，在人工培养条件下通常为无孢菌群l8，因此本研究中水琼 脂法与孟加拉红法相比更适合于内生真菌的分离 (2-2 所示)。 图 21 对照组水琼脂平板分离内生其菌 Fig.21Water agar plates as controls (A)样品未消毒;(B)样品消毒后接触 图 2 一 2 水琼脂平板分离内生真菌 Fig.22Water agar plate with endophytic fungi 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 12 表 2 一 1 55 株银杏内生真菌类群表 Table 2-2 Taxa of 55 endophytic fungi strains Ginkgo biloba 分离方法菌株编号分类群株数占总数的% MethodsStrains No.TaxaNumbersPercentage 孟加拉 2 红M 129交链孢霉属 11.82 曲霉属 青霉属 毛霉属 链孢霉属 不产孢真菌 酵母 6 10 1 1 9 1 10.91 18.18 1.82 1.82 16.36 1.82 水琼脂法YX 126小单头孢霉属 11.82 交链孢霉属 简梗孢霉属 不产孢真菌 3 3 19 5.45 5.45 34.54 2.3.22.3.2 抗菌活性菌株的筛选抗菌活性菌株的筛选 对 55 株内生真菌发酵液进行抗菌试验，共筛选得到 23 株至少对一种指示菌的生 长有抑制作用的菌株，结果见表 22。选用的 7 株指示菌中，金黄色葡萄球菌的敏感 性最强，共有 20 株内生菌发酵物对其生长有抑制作用，而其它指示菌相对不及金黄色 葡萄球菌敏感，活性菌株分别有 5 株对大肠杆菌、2 株对枯草芽孢杆菌、4 株对白酵母、 5 株对红酵母、3 株对青霉、4 株对黑曲霉有抑制作用。 具有抗菌活性的菌株占总分离菌株的 41.82%，其中 3 株为交链孢霉，5 株为青霉， 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 13 2 株为曲霉，1 株为简梗孢霉，1 株为小单头孢霉，其它 11 株为不产孢真菌，占活性 菌株的 47.83%。23 株活性菌株中有 20 株由树枝中分离所得，占活性菌株的 86.96%。 以孟加拉红分离所得的 29 株菌中，有 12 株具有抗菌活性，占该分离方法总菌株 数的 41.37%，其中不产孢真菌 4 株，分别占总菌株数和活性菌株的 13.7g%、33.3%。 相比之下，以水琼脂法分离所得的 26 株菌中有 11 株具有抗菌活性，占该分离方法总 菌株数的 42.31%，其中不产孢真菌 7 株，分别占总菌株数和活性菌株的 26.92%、63.64%，可见采用水琼脂法分离所得的抗菌活性菌株比例明显高于孟加拉红 法，进一步说明了水琼脂法用于内生真菌分离的优越性，采用该方法分离所得的活性 菌株值得进一步研究，分别采用形态学特征和 ITS 序列分析对 4 株产孢菌和 7 株不产 孢菌进行分类。根据分生孢子形态对其中 4 株产孢菌进行鉴定，YX 一 2 为简梗饱霉属 (Chromosporium sp.)、YX 一 9 为小单头孢霉属(Acremoniella sp.)、 YX 一 30 和 YX 一 45 均为交链孢霉(Alternaria spp.)。 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 14 表 2 一 2 银杏内生真菌发酵产物的抗菌活性 Table 2-3 Antimicrobial activity of cultures of endophytic fungi 菌株 编号分类群 分离 部位 大肠 杆菌 金黄色葡萄 球菌 枯草芽孢 杆菌 酿酒 酵母 红酵 母青霉曲霉 M-1 交链孢霉树枝 N19NNNNN M-6 青霉树枝 N17NNNNN M-7 青霉树枝 N17NNNNN M-8 青霉树枝 N17NNNNN M-11 青霉树枝 NNNN15NN M-13 青霉树枝 N27NNNNN M-14 曲霉树枝 N17N1513N13 M-17 曲霉树枝 N17N171120N M-20 不产孢真菌树枝 NNNNNN18 M-23 不产孢真菌树枝 24NNN15NN M-25 不产孢真菌树枝 N16NNNNN M-27 不产孢真菌树枝 N21NNNNN YX-2 简梗孢霉树枝 N20.6416NNNN YX-9 小单头孢霉树枝 193214NNNN YX-13 不产孢真菌树枝 N17NNN13N YX-16 不产孢真菌树枝 N14NNNNN YX-27 不产孢真菌树枝 N23NNNNN YX-28 不产孢真菌树枝 23.526N22.2N15.2816.68 YX-30 交链孢霉树枝 N22NNNNN YX-41 不产孢真菌树枝 2617N19.8NN17.26 YX-44 不产孢真菌树枝 N14.5NNNNN YX-45 交链孢霉树枝 1816NNNNN 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 15 YX-47 不产孢真菌树枝 N22NN16.32NN 由表 22 可看出，菌株 YX 一 28 的抗菌活性明显高于其它菌株，而且抑菌谱广， 除枯草芽孢杆菌外对另外 6 株指示病原菌均有抑制作用，ITS 序列分析显示与炭角菌 Xylaria 相似，已有的研究表明这个属的真菌具有广泛的生物学活性。 3 3 讨论讨论 由于内生真菌特殊的生长环境及其多样性，在分离过程中不可避免地会造成某些菌 种的丢失。主要原因有:(l)表面消毒过头，将部分内生真菌杀死;(2)表面消毒不充分，表 面菌污染，杂菌抑制内生真菌生长;(3)一些生长缓慢的真菌往往被生长快的真菌所覆盖; (4)所用培养基不能保证所有内生真菌都生长。目前国内多采用抗生素平板进行内生真 菌的分离，而国外一般均采用水琼脂法。传统方法一般是先进行表面消毒，然后用无 菌刀片削去外部组织，将内部心材切割进行分离，由于银杏树枝木质坚硬，样品分割 困难，极易造成污染，而有人研究报道树皮中也通常出现活性内生菌株，因此我们采 用先分割整段树枝再表面消毒的处理，通过水琼脂法对中国古银杏样品中的内生真菌 进行分离，建立与宿主植物内环境类似的生态模型，从而较为真实地反映植物内生菌 的生物学特征。分离过程中设置了对照组，用于分离纯化的菌落为不同于对照组平板 上的菌落，以区分内生真菌和表面杂菌，所分离的 26 株菌中大多为非产孢真菌(19 株)。 另外我也尝试过在培养基中加入孟加拉红抑制细菌和放线菌生长的方法，同时采用 4 种不同的培养基(马铃薯葡萄糖培养基、玉米粉培养基、察氏培养基、酵母提取物培养 基)进行分离，获得了 29 株菌种，其中大部分是产孢真菌，且交链孢霉属、曲霉属和 青霉属较普遍，而这些菌同时也是自然界中常见的病原菌或污染菌。因此，应用水琼 脂法对整体样品进行分离的方法适合于银杏内生真菌的分离。 内生真菌是新型生物活性物质的巨大资源。从抗菌实验结果可看出，银杏内生真菌 中具有抗菌活性的菌株普遍存在，活性菌株大多集中于无孢菌群中，这个结果与相关 研究一致l9。研究表明内生真菌在宿主体内产生特定的生物活性化合物，既可以有助 于它在植物体生境中形成优势地位，也可以保护植物免受病原菌侵袭，因此，素有。 活化石。之称的银杏几乎不感染任何病虫害的特性，不能排除是其内生真菌在发挥作 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 16 用。 目前,丝状真菌 DNA 的抽提方法主要为液氮、干冰、玻璃珠机械研磨20,21或超声、 微波22,.23等物理方法,氟化氢等化学试剂方法24,25,壳多糖酶、裂解酶、Novoz0ne 等酶 处理方法,以及上述方法的联合应用。但丝状真菌富含多糖的胞壁即使在液氮研磨后也 难于被普通的抽提试剂破坏,而其它机械研磨方法直接破壁时不可避免会损伤到菌体释 放的 DNA,导致降解剧增。而以各种酶消化胞壁,既费时又昂贵,并且不总是有效26。丝 状真菌的细胞壁主要以几丁质构成骨架结构,而几丁质是以 N 一乙酸基葡萄糖胺为单体 的聚合物,它的糖链上有大量的经基。氯化苄在弱碱性条件下可以与多糖上的轻基作用 生成醚,通过该反应破坏细胞壁糖链,在离子型表面活性剂 SDS 作用下,胞内 DNA 得以释 放。 许多内生真菌在 PDA 培养基或无菌的植物组织上不产生孢子。随着分子生物学技 术的发展和真菌基因组数据库的不断扩大,建立在 PCR 基础上的新型技术被用于内生真 菌的鉴定,特别是 ITS 序列具有较高的突变速率,己被各国研究者公认为是生物类群种间 水平的比较研究中较好的指标。本研究根据形态学特征对采用水琼脂平板法分离所得 的 4 株产孢活性菌株进行鉴定,选用 5.85rDNA 及其侧翼的 ITS 区域对另外 7 株不产孢 活性菌株进行分析,5.85 基因高度保守,适宜用于较高分类水平的系统发育分析,而 ITS 区 域则高度变异,可以在较低分类水平上进行序列分析。根据序列相似性分析结果,银杏内 生真菌菌株 YX 一 16、YX 一 44 与细交链孢霉 Alternarl.atenul.ssima 具有较高的同源 性,另外 YX 一 13 与砖红镰孢霉 Fusariu lateritium、YX 一 27、YX 一 28 和 YX 一 41 与炭角菌 Xylaria sp.、YX 一 47 与一株分离自 Picea glauca 的内生菌分别具有较高的相 似性,结果与形态特征比较的结果一致。 内生真菌通常为无孢菌群,有的菌株即使进行相当烦琐费时的产孢诱导处理在人工 培养基上也不产生有性或无性孢子,而且新的物种也在不断出现,因此内生真菌的鉴定通 常比较困难。Petrini 等报道从俄勒冈州西部常绿灌木中分离出的内生真菌中有 15%左 右不产生孢子27l。EsPinosa 一 Garcia 和 Langenheim 发现从沿海红杉中分离出的内生菌 大约有 26.9%属于无孢菌群28。一些特殊的方法可用于诱导真菌产孢。Guo 等对棕搁 (Livistona chinensis)内生真菌进行诱孢处理,将内生菌接种到含有麦芽膏培养基和无菌棕 搁叶柄的三角瓶中,在紫外灯和黑暗下 12h 交替培养,3 个月后形成了子实体29。Strobel 等将经丫射线照射过的康乃馨叶片放置于水琼脂表面,也得到了红杉内生菌的子实体结 构30。本研究中银杏内生真菌 YX 一 28 菌株在固体平板上形成黑色炭化菌落,在液体 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 17 或固态基质上均能形成黑色子座,通过目前已报道的各种诱导产孢手段,包括近紫外线照 射、菌体扫刷、寄主接种、温差培养等处理,都未产生孢子,内生真菌生活在特殊的植物 体内环境中,形成了独特的生理生化特性,在人工培养条件或即使人工接种宿主的情况下 都有可能不产生孢子。因此不能依靠形态学特征对内生真菌 YX 一 28 进行准确的种的 水平上的鉴定。 4.4. 小结小结 从银杏枝条、树叶样品中分离得到 55 株内生菌,其中 29 株为孟加拉红法分离所得, 在 PDA 培养基上大部分为产孢真菌,包括 1 株交链孢霉、6 株曲霉、10 株青霉、1 株毛 霉、1 株镰孢霉、9 株不产孢真菌和 1 株酵母;26 株为水琼脂法所得,包括 1 株小单头孢 霉属、3 株交链孢霉、3 株简梗孢霉和 19 株不产孢真菌。水琼脂法更适合银杏内生真 菌的分离。 通过平板孔阱实验筛选具有抗菌活性的内生真菌,共得到 23 株具有不同程度抗菌活 性的菌株,占总分离菌株的 41.82%。以水琼脂法分离所得菌株的活性明显高于孟加拉红 方法。 对用水琼脂法分离所得的 11 株活性菌株进行初步鉴定。根据分生孢子形态对其中 4 株产孢菌进行鉴定,YX 一 2 为简梗孢霉属(Chromosporium sp)、YX 一 9 为小单头孢霉 属(Acremoniella sp.)、YX 一 30 和 YX 一 45 均为交链孢霉 (Alternaria spp.)。通过对 ITS1 一 5.85 一 ITS2 片段进行序列分析,结果显示 YX 一 16、YX 一 44 与交链孢霉 Alternaria spp.、YX 一 13 与镰孢霉 Fusararium sp.、YX 一 27、YX 一 28 和 YX 一 41 与炭角菌 Xyria spp.、YX 一 47 与一株分离自 Picea glauc 的未鉴定的内生菌分别具 有较高的相似性,结果与形态特征比较的结果一致。 致致 谢谢 本文是在阎华老师悉心指导下完成的，从论文选题、实验设计到实验材料的采集、 实验的实施、论文的撰写，导师都倾注了大量的心血，老师学术上严谨的治学态度， 对实验操作的严格要求以及对科学真理的执着追求的精神，一直鞭策激励着我，这将 使我受益终身，在此向老师表示由衷的感谢！ 银杏内生真菌的分离培养与生物活性测定 18 在论文期间，湖北文理学院化学工程与食品科学学院的余海中、孙永林、张火云 等老师都给予我热情的指导，并帮我解决实验过程中遇到的困难；另外在实验过程中 还得到本实验室同学石银、许为、李雪梅、胡瑛莹的热情支持和帮助，在此一并向他 们表示衷心的感谢！ 感谢化学工程与食品科学学院各位领导、老师在大学四年里对我的谆谆教导、关心支 持！ 参考文献参考文献 1 Stone JK Bacon CW，White JF.An overview of endo Phytic microbes：endo Phytismdefined. 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