毕业论文-急性猪瘟感染过程中IL-2mRNA转录水平的研究.doc

毕 业 论 文（设 计）论文（设计）题目：急性猪瘟感染过程中IL-2 mRNA转录水平的研究姓 名 学 号 院 系 生命科学技术学院 专 业 生物技术 年 级 2011级 指导教师 2015年 5月 15日目 录摘 要1ABSTRACT2第1章 前言31.1 研究背景31.2 研究目的41.3 研究意义4第2章 材料及方法62.1 材料6 2.1.1 病毒6 2.1.2 引物6 2.1.3 实验动物及分组6 2.1.4 主要试剂6 2.1.5 主要溶液配制6 2.1.6 主要仪器72.2 方法7 2.2.1 人工感染CSFV7 2.2.2 猪PBMCs分离 7 2.2.3 PBMCs中总RNA抽提8 2.2.4 反转录合成cDNA8 2.2.5 反应体系9 2.2.6 QPCR结果分析9 第3章 结果与结论11 3.1 QRT-PCR检测IL-2 mRNA转录水平的结果11第4章 讨论12 4.1 QRT-PCR技术检测细胞因子方法的优势12 4.2 CSFV感染PBMC对IL-2 mRNA转录水平的影响13参考文献14致 谢16新乡学院本科毕业论文（设计）摘 要 猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种猪的高发传染病，它具有高发病率和高接触性等特点，细胞白介素-2（Interleukin-2, IL-2)为调控免疫应答的重要因子，在免疫调节中发挥着免疫正调节的作用。本实验意在通过CSFV感染试验猪，根据Trizol法提取猪外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）RNA并反转录为cDNA，应用实时荧光定量PCR（Quantitative Real Time PCR, QRT-PCR）技术研究CSFV感染机体后IL-2 mRNA转录水平的变化。结果显示：IL-2 mRNA在CSFV感染后第3d转录水平正常，第7d转录水平最低，第14d转录水平最高，第21d又恢复正常。表明了第7d机体免疫损失最为严重，第14d IL-2诱导机体细胞产生抗病毒感染应答现象最为明显。关键词：猪瘟病毒；外周血单核细胞；细胞白介素-2；实时荧光定量PCRABSTRACT Classical swine fever (CSF) is a high incidence of infectious diseases by swine fever virus (CSFV) caused, it has a high incidence and high contact resistance and other characteristics, cell interleukin -2 (IL-2) is an important factor in the regulation of immune responses in immune regulation plays a role in immune enhancement. This experiment is intended by CSFV infection in pigs, according to Trizol extraction porcine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) RNA and reverse transcription to cDNA, quantitative real-time PCR (QRT-PCR) Research CSFV IL-2 mRNA transcription levels change after infection. The results showed: IL-2 mRNA in the first three days after CSFV infection transcript levels were normal, the lowest level of the first seven days of transcription, transcription levels highest first 14 days, 21 days and return to normal. It shows the first seven days of the most serious immune damage, on the 14th day IL-2 induce cells to produce anti-virus response phenomenon is most obvious.Key words: Classical swine fever virus; Peripheral blood mononuclear cell; Interleukin-2; Quantitative real-time PCR18第1章 前言 细胞因子是一类小分子蛋白，具有广泛生物活性，它是由机体免疫细胞和某些非免疫细胞刺激刺激合成和分泌1。它产生具有多向性、多源性，其生物学活性主要体现在调节刺激造血功能并参与组织修复、参与免疫细胞的分化发育、调节免疫应答、介导炎症反应等2。细胞因子具有很强的生物学活性，细胞因子在病毒感染后转录和表达的差异近年来备受关注3,4。细胞因子在机体的免疫应答中发挥着重要作用，白细胞介素是众多免疫细胞因子中的一种，目前至少已发现了38个白细胞介素5，白细胞介素是由淋巴细胞、单核吞噬细胞等细胞分泌产生,主要作用介导白细胞间相互作用、调节细胞的生长分化、参与免疫应答和介导炎症反应，白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）是众多白细胞介素中一种，IL-2是由活化的T淋巴细胞产生的Th1细胞的特征性因子,具有促进T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖、分化以及增强Tc细胞、NK细胞和LAK细胞的杀伤活性的功能，IL-2对干扰素（Interferon，IFN)、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)等细胞因子的分泌具有促进作用，它可以增强机体自身体液免疫和细胞免疫的能力和解除机体自身免疫抑制6，IL-2还可以增加抗原递呈细胞表面MHC类分子和MHC类的数量，促进抗体的分泌和增强抗原递呈细胞作用7。 在动物感染性疾病防治中，IL-2是机体免疫调节核心物质，猪IL-2具有多种生物学活性，IL-2具有较强免疫调节功能，在抗毒素、抗肿瘤、免疫调节等方面都具有重要作用8。近几年来国内外在免疫调节方面的研究成果颇多，许多研究表明IL-2能够促进抗体的分泌和降低病原体的入侵率9。通过对猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)感染后IL-2的研究，可为CSFV的致病机理以及研究宿主与病毒的关系提供理论依据，为研究CSFV感染后其它细胞因子的变化奠定坚实的理论基础。1.1 研究背景 猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是猪的一种重要的传染病，在世界范围内广泛流行。在我国，CSF被列为I类动物疫病,世界动物卫生组织（OIE)将其列为A类传染病之一，CSFV引起的猪高度接触性致死性传染病，给世界养猪业造成巨大威胁和经济损失10。发展至今已流行70多年。我国在50年代已研制出CSFV兔化弱毒疫苗，在防控CSFV方面，已取得显著成效，然而60年过去了，我国还未能真正消灭CSF。从细胞因子层次研究CSF感染的致病机理，对CSF的消灭和预防有着重要的意义。 近年来，国内外众多学者从细胞因子层次出发，研究CSFV感染与细胞因子的关系，已经发现CSF可引起众多细胞因子变化，表明了细胞因子的变化将直接影响其抗原递呈与免疫功能的发挥。但是，关于CSFV感染PBMC后细胞因子转录水平的研究却较少，病毒感染的作用机理尚未弄清。CSFV在我国已流行许久，原有的免疫手段尚不能完全消灭CSF，近年来虽有众多学者研究CSFV，但从细胞因子层次探究CSFV感染机制较少，研究CSFV感染机体后IL-2变化情况的文章更是少之更少11。猪的细胞因子种类较多，主要分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子，其中IL-2在预防和治疗疾病方面备受关注，近年来许多研究已经表明IL-2在抗病毒和抗感染及免疫调节中发挥着重大作用，展现出IL-2广阔的研究前景12。1.2 研究目的急性CSFV感染常以发病急和外周血白细胞数目减少为主要特征，细胞因子在CSFV感染过程中起着至关重要的作用13。近年来，研究人员对急性CSFV感染后细胞因子的变化情况研究颇多，但对IL-2在病毒感染后的免疫调节中发挥的作用研究较少。本文主要以IL-2为研究对象，通过对IL-2 mRNA转录水平的研究，从IL-2 mRNA转录水平的变化解释CSFV感染后IL-2含量的变化，寻找CSFV感染机体与机体中IL-2 mRNA转录水平的关系，证明CSFV感染机体后IL-2对机体的免疫应答起增强作用。1.3 研究意义 白细胞介素与CSFV感染关系密切，在抗病毒免疫中发挥着重要的调控作用。白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，IL-2是众多白细胞介素中一种，IL-2又称T细胞生长因子（TCGF),其主要由T细胞产生，具有促进B细胞增殖和激活巨噬细胞的功能14。因此，通过对CSFV感染后IL-2的研究，可为CSFV的致病机理以及研究宿主与病毒的关系提供理论依据。本实验意在通过CSFV石门毒株体外侵染试验猪，根据Trizol法提取猪外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)RNA，使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real Time PCR，QRT-PCR）技术研究CSFV持续感染后IL-2 mRNA转录水平的变化，证明CSFV石门毒株感染PMBC后对猪白细胞介素含量产生影响，为研究CSFV感染后其它细胞因子的变化奠定坚实的理论基础，为论述CSFV感染后免疫系统变化机制提供理论依据。第2章 材料及方法2.1 材料2.1.1 病毒 CSFV石门毒株由新乡学院生物技术研究中心保存。2.1.2 引物 根据Genbank上公布的CSFV石门毒株的全基因序列，并参考国内外相关文献，利用Primer 5.0引物分析软件进行同批次引物设计,引物由大连TaKaRa公司合成，以-actin作为参照，引物信息见表1。表1 引物序列信息基因名称序列（5-3）基因序列号产物长度（bp）-actinF: GGACTTCGAGCAGGAGATGGDQ452569.1121R: AGGAAGGAGGGCTGGAAGAGIL-2F: CATTGCACTAACCCTTGCACTCR: GGCTCCAGTTGTTTCTTTGTGTTJN851821812.1.3 实验动物及分组 30日龄、CSFV抗体阴性二元杂交猪，购自河南省种猪育种中心，体重约15kg，身体健康，无其它疾病，状况良好，并进行一周的观察。实验组10头，对照组5头，实验组与对照组实验条件控制在同等状态下。2.1.4 主要试剂 淋巴细胞分离液（Ficoll 1.077g/mL），天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；反转录试剂盒PrimeScript RT-PCR Kit、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time)、反转录酶和Taq酶，大连TaKaRa公司产品； SYBR Green 试剂盒，美国Applied Biosystems公司产品；TRIzol，美国Invitrogen公司产品。 2.1.5 主要溶液配制10%柠檬酸钠（抗凝剂）：称取10 g柠檬酸钠溶于100 mL蒸馏水中，过滤除菌，4 保存备用。 10红细胞裂解液：称取NH4Cl 8.277 g，NaHCO3 0.84 g，EDTA 0.037 g，溶于100 mL蒸馏水中，搅拌溶解，过滤除菌，4 保存备用。 磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8 g， KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO412H2O 3.63 g，加蒸馏水定溶至1000 mL，高压灭菌，4 保存备用。DEPC水：无菌蒸馏水中加入0.1%（v/v）DEPC，磁力搅拌器室温搅拌4 h，121 高压灭菌30 min，冷却备用。2.1.6 主要仪器实时荧光定量PCR仪7500型美国Applied Biosystems公司台式冷冻高速离心机ST-40R型美国Thermo公司核酸蛋白分析仪美国GE公司倒置显微镜Primo Vert型德国SEISS公司水浴锅上海精宏实验设备有限公司电子天平METTLER TOLEDO 国际股份有限公司微量移液器德国Eppendorf公司超净台苏州净化设备有限公司微型振荡器北京吴诺斯生物技术有限公司2.2 方法2.2.1 人工感染CSFV30日龄二元杂交猪随机分成2组，试验组10头，对照组5头，隔离饲养，饲养57d，观察猪只有无异常情况，试验组和对照组分别颈部肌肉注射105TCID50的CSFV和0.5 mL PBS，攻毒后每天观察临床变化。攻毒后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d和21 d，分别采集抗凝血5 mL，用于分离PBMCs。2.2.2 猪PBMCs分离 （1）颈静脉采集正常猪抗凝血5 mL（10%柠檬酸钠，全血与抗凝剂比例为10:1），抗凝血与等量PBS轻轻混匀； （2）取4 mL淋巴细胞分离液于15 mL玻璃离心管中，将上述混匀血10 mL沿管壁慢慢加入离心管中（注：动作要轻，不能混匀），水平离心，2000 r/min，室温离心20 min； （3）用毛细管吸取血浆层与分离液之间的白色细胞薄层，移入新的15 mL玻璃离心管中，加入25倍体积PBS，轻轻悬浮细胞，1000 r/min，室温离心10 min，弃上清，加入10 mL PBS，轻轻悬浮细胞，重复离心一次，弃上清； （4）观察白细胞中红细胞量，适当加入12 mL红细胞裂解液，冰上裂解红细胞5 min，加入10 mL PBS，1000 r/min，室温离心10 min，弃上清，加入0.5 mL PBS，悬浮细胞，即为PBMC细胞悬液。2.2.3 PBMCs中总RNA抽提 （1）取1 mL Trizol于1.5 mL EP管中（无RNase），加入250 L PBMCs细胞悬液混匀，室温放置10 min； （2）加入200 L氯仿混匀，室温放置10 min，12000 r/min，4 离心15 min； （3）转上层水相于新1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10 min，12000 r/min，4 离心10 min，弃上清； （4）加入1 mL 75%酒精，悬浮沉淀，7500 r/min，4 离心5 min，弃上清，重复离心一次，弃上清； （5）放置510 min，待酒精蒸发完毕，离心管底部透明状胶体样物质即为RNA，加入20 L DEPC水悬浮RNA，核酸蛋白分析仪测定RNA浓度，立即进行反转录。2.2.4 反转录合成cDNA反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time)合成cDNA，具体步骤如下：RNA 1 L5gDNA Eraser Buffer2 LgDNA Eraser 1 LRNase Free dH2O补加至10 L总体积10 L以上体系混匀后，42水浴2 min，取出立即放置冰上，待加入以下成分：上述混合液10 L5Primescript buffer 24 LPrimeScript RT Enzyme Mix I1 LRT Primer Mix1 LRNase Free dH2O4 L总体积20 L以上体系混匀后，37孵育15 min，85水浴5 sec，4冷却5 min，即为合成cDNA，-20保持备用。2.2.5 反应体系如下： 本实验室已建立QPCR检测猪IL-2的方法，反应体系和程序如下：SYBR Green Mix10 L上游引物0.4 L下游引物0.4 LcDNA2 L双蒸水7.2 L总体积20 L以上体系混匀后，反应程序为：95 预变性30 sec；进行40个循环：95 变性5 sec，60 反应34 sec；溶解曲线：95 30 sec，60 1 min，95 15 sec。检测标准品10倍倍比稀释的6个浓度梯度，每个浓度做3个重复，根据R2值和溶解曲线判断QPCR的稳定性和特异性。2.2.6 QPCR结果分析参考Pfaffl的方法15，以-actin为内参，将QPCR结果的CT值带入下列公式，用Pfaffl法计算目的基因mRNA相对于-actin的表达量，公式如下：Ratio EtargetCPtarget（control-sample）ErefCPref（control-sample）Ratio：目的基因相对于内参基因的表达量；Etarget：目的基因的表达效率，E= 10 -1/斜率；Eref：内参基因的表达效率；CPtarget：对照组（control）和样品组（sample）目的基因Ct值之差；CPref：对照组（control）和样品组（sample）内参基因Ct值之差。第3章 结果与结论3.1 QRT-PCR检测IL-2 mRNA转录水平的结果 本实验检测的细胞因子为IL-2，利用QRT-PCR技术分别对CSFV感染PBMC后第0d、第3d、第7d、第10d、第14d、第21d进行IL-2 mRNA转录水平检测，观察CSFV感染对IL-2 mRNA转录水平的影响。结果见图1：图1 IL-2转录分析结果 结果显示：CSFV感染后07d，IL-2 mRNA转录水平显著下降，而在第1014d，IL-2 mRNA转录水平显著升高，第21d IL-2 mRNA转录水平又恢复到正常水平。综上所述，提示CSFV石门毒株感染后第7d IL-2 mRNA转录水平最低，表明机体免疫能力和抗病毒能力最低，而感染后第14d IL-2 mRNA转录水平最高，表明机体免疫细胞产生免疫应答现象最为明显。 第4章 讨论 本研究运用QRT-PCR技术分析了CSFV感染猪PBMC后IL-2 mRNA转录水平的情况，从定量的角度分析IL-2 mRNA转录水平载量的动态变化规律，为临床诊断提供了基础实验数据。临床与结果表现出一致性，伴随着血液中CSFV核酸载量的增加，感染猪临床表观症状越发严重。4.1 QRT-PCR技术检测细胞因子方法的优势 QRT-PCR技术是由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新型定量PCR技术，目前，在国内外应用较为广泛。QRT-PCR实现了PCR从定性到定量的转变,提高实验的重复性，避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、线性关系好等优点，常用于基因定量检测、定量疾病相关基因的表达，现在已广泛用于人类和禽类疾病的定量分析、快速检测、基因分型、早期诊断等方面16。QRT-PCR可以采用相对定量和绝对定量2种方式实现定量检测，但都有各自的优缺点，需根据具体的试验选择合适的定量方式，从而得到更准确的试验结果。提高QRT-PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手，主要指特异性探针及引物的设计，选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等，该技术己被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片；siRNA干扰的实验结果。它涉及到DNA或RNA样品制备，反转录及PCR反应等一系列重要的分子生物学过程17。 目前QRT-PCR技术主要有SYBRGreen和TaqMan探针两种方法。SYBRGreen是一种荧光染料，它能够与双链DNA非特异结合，这种荧光染料适用于所有引物的扩增，成本较低，方法简便，但荧光染料也能够与其它双链DNA结合，因此需要对其进行溶解曲线分析，达到对其它非特异性扩增产物或者引物二聚体加以辨别去除的目的。而TaqMan探针法则是探针与靶序列配对，探针上有两个基因（3淬灭基因和5报告基因）。完整的探针没有荧光产生，而报告基因与淬灭基因分离时，发射荧光。此法对引物及探针的设计要求更高，但同时检测的特异性更高，结果更为可靠18。本实验采用的是SYBRGreen法，此法的优点是使用方便，成本低，通用性好，设计引物时仅需设计两个引物，而且荧光染料对DNA模板没有选择性。但缺点是SYBRGreen能与所有双链DNA结合，所以反应结束时，必须对产物做溶解曲线分析。4.2 CSFV感染PBMC对IL-2 mRNA转录水平的影响 CSFV石门毒株感染猪PBMC后机体产生免疫应答，PBMC分泌的白介素类发挥着重要的调控作用，白介素类细胞因子若在异常情况下可能会导致免疫病理反应。其中IL-2为调控免疫应答的重要因子，它是动物机体中最重要的免疫调节细胞因子之一，是由活化的T淋巴细胞产生并作用于T淋巴细胞，具有激活T淋巴细胞、促进B淋巴细胞分化和诱导产生干扰素的功能19。研究CSFV感染PBMC对IL-2 mRNA转录水平的影响，对了解CSFV感染过程中免疫应答的激发和调控具有重大的意义。 CSFV感染PMBC后结果显示：在CSFV感染后07d，IL-2 mRNA转录水平显著下降，而在第1014d，IL-2 mRNA转录水平显著升高，第21d IL-2 mRNA转录水平又恢复到正常水平。通过对实验结果进行分析，得出如下结论：CSFV感染后07d，CSF在机体内大量增殖，对机体的免疫细胞及免疫因子造成了一定的损伤，造成了机体内IL-2 mRNA转录水平的降低，以至于导致机体内IL-2含量的下降和机体对抗CSFV产生免疫应答能力的下降，即在IL-2 mRNA转录水平上显示为降低；CSFV感染后714d，随着机体体液免疫和细胞免疫的不断进行，T淋巴细胞和B淋巴细胞相继分化各种免疫相关因子，各种免疫细胞因子之间的相互协调使机体免疫应答能力不断提高，机体抗病毒能力进一步增强，与此同时IL-2 mRNA转录水平提高，机体内IL-2的含量呈递增趋势，即在IL-2 mRNA转录水平上显示为增加，其中CSFV感染后第14d IL-2 mRNA转录水平最高，表明了在第14d IL-2诱导机体细胞产生抗病毒感染应答现象最为明显；CSFV感染后1421d，IL-2 mRNA转录水平又恢复到正常水平，表明机体内CSFV已经被消灭，机体内不再需要过多IL-2，因此IL-2 mRNA转录水平为正常水平。参考文献1葛明东, 胡德建, 王艺超. 细胞因子类药物的临床应用J. 中国当代医药, 2009, 16(6): 4445.2Kouwenhoven M, Ozenci V, Teleshova N, et al. 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The caravan, consisting of more than 100 camels, three horse-drawn carriages and four support vehicles, started the trip from Jingyang county in Shaanxi on Sept 19, 2014. It will pass through Gansu province and Xinjiang Uygur autonomous region, and finally arrive in Almaty, formerly known as Alma-Ata, the largest city in Kazakhstan, and Dungan in Zhambyl province. The trip will cover about 15,000 kilometers and take the caravan more than one year to complete. The caravan is expected to return to Jingyang in March 2016. Then they will come back, carrying specialty products from Kazakhstan A small art troupe founded six decades ago has grown into a household name in the Inner Mongolia autonomous region. In the 1950s, Ulan Muqir Art Troupe was created by nine young musicians, who toured remote villages on horses and performed traditional Mongolian music and dances for nomadic families. The 54-year-old was born in Tongliao, in eastern Inner Mongolia and joined the troupe in 1975.He says there are 74 branch troupes across Inner Mongolia and actors give around 100 shows every year to local nomadic people. I can still recall the days when I toured with the troupe in the early 80s. We sat on the back of pickup trucks for hours. The sky was blue, and we couldnt help but sing the folk songs, Nasun says. The vastness of Inner Mongolia and the lack of entertainment options for people living there, made their lives lonely. The nomadic people were very excited about our visits, Nasun recalls. We didnt have a formal stage. The audience just sat on the grass. Usually, the performances became a big party with local people joining in. For him, the rewarding part about touring isnt just about sharing art with nomadic families but also about gaining inspiration for the music and dance. Ulan Muqir literally translates as red burgeon, and todays performers of the troupe still tour the regions villages and entertain nomadic families, but their fame has spread around the world. On May 16 and 17, nearly 100 singers and dancers from the troupe performed at Beijings Poly Theater. Their show, titled Ulan Muqir on the Grassland, depicted the history and development of the art troupe. Being from the region allowed me to embrace the culture of Inner Mongolia and being a member of the troupe showed me where I belonged, Nasun, the art troupes president, who is also a renowned tenor, tells China Daily. During a tour in 1985, he went to a village and met an elderly local man, who told him a story about his friendship with a solider from Shenyang, capital of Northeast Chinas Liaoning province, decades ago. The solider gave the old man a handmade saddle when they bid farewell. The story inspired Nasun to write Carved Saddle, a song that later became one of his most popular numbers. Now, every year, Nasun recruits young singers and dancers for the troupe. The troupe has also designed a new repertoire, which is mostly based on the daily lives of Mongolian people, especially the lives of nomadic families, and has combined contemporary musical elements with folk songs of the region. Haimu, a 25-year-old khoomei (a local variant of overtone singing) singer, joined the troupe three years ago. Along with a six-member band, he performs fast songs and soft ones that he writesall while playing the horse-head fiddle.Although I learned the piano since childhood and grew up listening to various kinds of music, to me, the folk music of Inner Mongolia is the root, he says. Performing in remote villages is pleasant. I feel at home on the boundless grasslands, and the warm people there make me feel fulfilled. The first round of spring auction season in Beijing ended last week, but it failed to create much spring in the art market. Although two pieces of Chinese painting fetched more than 100 million yuan, the decline in trading volume and sale rate showed a downturn this year. In the “Grand View: Chinese Painting Highlight” session at China Guardian 2015 spring auctions, Pan Tianshous representative work Eagle, Rock and Flora hit a record auction price of 279 million yuan, while Li Kerans masterwork Jinggang Mountain fetched 126.5 million yuan, an unexpected high in recent years. However, the trading volume fells to 1.87 billion yuan from 2.22 billion yuan in the same period the year before. The Huangchen 2015 Spring Auctions, which recorded 42.5 million yuan in total sales, experienced the same. The section number went down to 5 from 12 compared to last year. According to expert Shao Jianwu, the art market did not attract much excitement this year due to the booming stock market and the persistent problems of forgery and fake deals. The two pieces of Chinese painting notched up high price this