细胞培养准备工作.doc

试验准备一：细胞培养实验室的设备:1. 仪器:(1) 倒置相差显微镜(2) CO2培养箱(3) 电热干燥箱(4) 水纯化装置(5) 冰箱:普通冰箱(培养液,生理盐水,Hanks液,短期保存的组织标本)和-20冰箱(保持生物活性及较长时间存放的制剂如酶,血清等)(6) 液氮容器:储存细胞(7) 离心机(4000rpm,1000rpm即可及天平(8) 高压蒸气消毒气(9) 滤器:Zeiss滤器,玻璃滤器,微孔滤器等。(一次性滤器：12.0010)(10) 消毒培养液，(11) 血清(12) 消化用胰酶等。2培养用器皿：（1） 培养瓶：250ml,100ml（4.5020）,25ml（3.5010）（2） 培养皿：10cm,9cm（3.5010）,6cm（2.5010）,3.5cm（3） 多孔培养板：96孔（16.501），24孔（16.503），12孔，6孔，4孔（4） 玻璃瓶：1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml（5） 吸管：刻度吸管（吸取，转移液体：1ml,2ml,5ml,10ml）（3.0010）直头吸管（吸取，转移液体）弯头尖吸管（吹打，混匀，传代细胞）（6） 加样器：微量加样器用于吸取，移动液体，滴加样品（7） 其他用品：铝饭盒，橡皮吸头，胶塞，注射器，烧杯，量筒，漏斗3器械：（1） 手术刀（2） 手术剪，眼科剪（18.50）（3） 血管钳（4） 眼科镊（8.50），小弯头镊（5） 钟表镊二培养用品的清洗和消毒灭菌：1 各种类型毛刷,橡胶手套，消毒所用包装（牛皮纸，棉布，棉线等）2 洗衣粉，洗涤剂3 5稀盐酸浸泡中和碱性物质4 清洁液（次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml）需陶瓷或塑料器皿5 消毒剂：75酒精或0。1新洁尔灭消毒皮肤，无水乙醇（用于酒精灯）6 抗菌素：青霉素，链霉素三：培养用液：1 平衡盐溶液：D-HANKS液(g/l )PH试纸Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚红0.022 合成培养基：M199培养基或DMEM培养基（Gibico公司 一袋1000ml 65.00,Hepes 25g 120.00）DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水1000ml，青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml ph=7.27.43 FBS胎牛血清（原代培养20传代培养10）(100ml 200.00)四：组织块的分离方法：1 剪切分离法：组织块在0.5mm22mm2内，大小影响不大（可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁），关键在于组织块边缘整齐，光滑，要求取材迅速，动作轻柔，剥除外膜时用力适中避免机械损伤，将镊子夹过处剪去，血管纵向剖开后平铺于平皿上，手术刀片无菌，洁净，锋利，垂直下刀，力求一次切断，不要离开培养液操作，保持边缘湿润。2 消化分离法：（1） 胰蛋白酶法：(25g 210.00)（2） 胶原酶法：五：原代培养方法：1 贴块法：在培养皿内将组织块剪成1mm3左右的小块，剪时可滴加12培养液，以保持湿润。将剪切好的小块用吸管吸入培养瓶中，均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。轻轻翻转培养瓶，使组织块朝上，向瓶内注入少许培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37度培养箱内。6小时后轻轻翻转培养瓶，静置培养。若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清，胎汁。（10胎牛血清，10胎儿血清，0。03 L-谷氨酰氨。110mg/l丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素） 贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。2 酶解法：组织块剪成12mm3,转入新鲜配置的0。2型或型胶原酶消化液中，37恒温摇床（25r/min）消化，消化液混浊，尚存有较小组织块时，将消化液移入离心管内，收集细胞并用培养液轻轻吹打混匀。细胞计数（0。1台盼蓝），50ml培养瓶接种约8105活细胞。（沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37，0.51.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入3090mm培养皿中培养） 酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。3 贴块酶解法：对未消化完全的组织块采用贴块法接种瓶壁，先置培养箱2h使组织块干固，然后补加培养液，37静置培养，3d后换液。4 注意：种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%20%六：传代培养：原代培养35d，需换液一次，去除飘浮的组织块和残留的血细胞。然后隔天换液。当内皮细胞长成单层，平滑肌细胞出现峰谷样特点时可传代。消化法传代。加入0.125胰蛋白酶1ml，轻轻转动培养瓶，使胰酶充分接触细胞后去除大部分液体，镜下观察，35min后，细胞呈收缩状，弃尽消化液，DMEM培养液洗两遍，加10FCS DMEM培养液，用弯头吸管轻轻均匀吹打细胞，使细胞自瓶壁脱落，镜下观察细胞计数，按1：23比例传代。七：细胞系的维持：八：培养细胞的纯化：九：细胞冻存与复苏：十：培养细胞生长状况的观察：1 肉眼观察培养液：颜色，透明度2 相差显微镜下观察：0/wjf/2/course/c212.htm 相差显微镜与倒置显微镜的区别 光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需67天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。透射电子显微镜下观察：贴块法，细胞多为合成型，肌丝减少，胞体缩小，细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。消化法，细胞初期表现为收缩型，细胞内核位于中心，胞质内含丰富的肌丝及致密度体。亚细胞器少，且位于细胞边缘处，基底膜最初未见，后来逐渐形成。传代后，细胞逐渐转为合成型，胞体增大且变扁平，核增大，核小体数目增加，亚细胞器也增加，肌丝开始减少，占胞内35.4%11.5%,甚至更少。在生化性质方面，收缩型细胞比合成型细胞的-极密度脂蛋白（-VLDL）对其受体结合能力强，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂质容易在胞质沉着。此外，像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。合成型细胞内色素C氧化还原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈34倍增加，说明这两类细胞不仅在形态学上，在生化、生理反应方面也发生了较大改变。3 细胞生长状况的观察：细胞计数：计数板4 细胞活力的检测方法：四唑盐（MTT）比色试验（1）：0.125%胰蛋白酶消化（2）：加10FCS的DMEM培养基（3）：96孔板（4）：MTT溶液: http:/www.b