实验四DNA回收纯化及重组体的构建.ppt

实验四 DNA回收纯化及重组体的构建 实验目的和要求 学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法。 并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技 术。 本实验采用粘末端连接法将PCR扩增的DNA片段 插入到pBluescript KS质粒载体中，掌握DNA 重组方法。通过本实验了解DNA重组技术在分 子生物学研究中的重要意义。 DNA片段的纯化： DNA纯化的主要目的是 回收得到纯的目的DNA片段，去除影响 DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片 段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电 洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回 收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等 方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段 的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速 度。 相关基础知识 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指 将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作 用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有 与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进 行复制。通过此方法可以对单个基因的功能 进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病 诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素 、干扰素等。 DNA重组 因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我 复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复 制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点， 即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破 坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的 标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺 陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体 也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要 考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是 真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及 酶切位点等方面的问题。 载体的选择： 主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆 菌DNA连接酶。E. coli DNA 连接酶催化 DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶 基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+ 。T4噬茵体DNA连接酶催化DNA连接反应分 为三步。 DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶还有一种E. coli DNA连接酶没有的特性即将两个平末端的 双链DNA分子连接起来的功能。对于这种 连接反应的机理目前还不清楚，总的来说 这种连接的效率比粘性末端的连接效率要 低得多，可能是因为平末端DNA分子无法 形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的 结构。 1. Weiss单位（Weiss等,1968），是指在37oC下20 分钟内催化1nM 32P从焦磷酸根置换到,-32P ATP所需酶量； 2. （NEB公司，粘性末端）将1g由HindIII酶解的 DNA的12碱基对粘性末端在160C条件下、30分 钟、20l反应体系中连接50时所需酶量。 3. (Takara公司)在20l的反应体系中，6g的 DNA-HindIII的分解物在160C反应30分钟时， 有90以上的DNA片段进行连接的酶的活性为1U 。 相当于 ATP-Ppi交换反应中0.008 Weiss U 。 对于T4-噬菌体DNA连接酶的活性测定至少有 三种以上的方法： 连接反应的一项重要参数是温度。理论上 讲连接反应的最佳温度是37，此时连接 酶的活性最高。但37时粘性末端分子形 成的配对结构极不稳定，因此人们找到了 一个既可最大限度地发挥连接酶的活性， 又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即 1216。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法 ，这些主要根据外源片段的末端性质、质 粒性质以及两者的酶切位点来确定。 连接 粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末 端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端 包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切 酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘 末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限 制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段 从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产 生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留 接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来 酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来 。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。 另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性 末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正 确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现 象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶 (CIP)去掉载体5-磷酸来达到抑制DNA片段的自 身环化的目的。 综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入 片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性 末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体 的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能 产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互 补，所以能够得到较好的重组结果。 平端连接法： 待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由 酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般 由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中 ，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的 末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除 3突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接 两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的 ，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用 量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平 端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也 可以提高连接的效率 。 适当的插入片段与载体分子比率能 减少多拷贝插入片段的形成，一般 采用载体：插入片段摩尔数为1：2- 3的比例。 载体及插入片段的量 实验材料与仪器： PCR产物(0.8kb，带有BamHI、 HindIII酶切位点) pBluescript KS 质粒(3.0kb) NEB 1kb 标准分子量片段 BamHI、 HindIII限制酶及 10K buffer 琼脂糖 T4 DNA ligase 及其缓冲液(Takara) TBE缓冲液(10) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(3) 电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶 成像仪，一次性塑料手套等 实验方法和步骤 PCR产物的纯化-PCR产物以及空载体的 酶切-乙醇沉淀-电泳检测-连接- -160C过夜 A 从PCR产物中直接回收纯化DNA (Promega 公司) 1) 直接加100l纯化缓冲液于1.5ml离心管， 再加入30300l PCR反应物，Vortex混 合； 2) 加入1ml树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1 分钟； 3) 进入C步骤。 DNA回收纯化步骤： 回收PCR产物常采用两中方法，即直接回收 和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的 试剂盒。 B 从琼脂糖凝胶回收纯化DNA 1) 用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV 观察EB染色条带； 2) 用干净的刀片切出所需DNA条带，注 意要在长波长（300nm）UV灯下操 作，并快速操作，以免损伤DNA。应 尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操 作可切取多至300mg的条带； 3) 将300l (300mg) 琼脂糖条片转移至 1.5ml离心管。直接在70温育直至 凝胶全部溶化（一般可按公司提供 的说明书进行）； 4) 加1ml树脂，彻底混合20秒，但不 用Vortex； 5) 下接C步骤。 C 纯化步骤 1) 将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在 纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合 液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推 进纯化柱内； 2) 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射 器筒装上纯化柱，加2ml 80%的 Isopropanol, 然后装上拉杆，慢慢推 出液体以清洗柱子； 3) 再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml 离心管上，10000g离心2 min，以干燥树 脂； 4) 再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上 ，加50l水或TE缓冲液，1分钟后， 10000g离心20秒，溶出DNA片段； 5) 移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在- 20下保存备用。 D 说明 若向1ml树脂中加入500bp PCR产物50ng至 16g，其回收率可在95以上。同样500bp ，若从低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在 7090之间。 学生PCR实验结果(4l) PCR 产物纯化后(相当于0.8 l原PCR产物） pBluescript 酶切后 PCR 纯化并酶切后 (2l) DNA重组 本实验是将具有BamHI和HindIII粘性末端的基 因片段以及载体通过DNA连接酶连接起来。 方法1（酶切后乙醇沉淀，适于PCR产物的重 组）： 1) 在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备 pBluescript KS空载体0.2-1g(针对本实验 ，取4l约800ng)，2 l 10酶切缓冲液， BamHI & HindIII酶各1l（各5单位），用 无菌双蒸水加至20l 反应体系，于37保 温1-3h； 2) 在另一管中加入待插入的DNA片段（纯化 的PCR产物）0.2-1g(本实验约为4-10l)， 2l 10酶切缓冲液，HindIII 和 BamHI酶 各1l（各5单位），用无菌双蒸水加至20l 反应体系，于3 7保温 1-3 h ； 操作步骤 3) (根据实验情况而定，完毕后各取3l酶解液 做电泳分析，观察酶解是否完全）将酶解 液加入2倍体积的100乙醇以及1/10体积 的3M NaAC(pH=5.2)，置-20冰箱 30min 。4oC，12,000rmin离心 10 min，弃上清 ，加入100l 70乙醇(洗涤沉淀物)，离心 去上清，室温干燥DNA 沉淀15分钟左右， 加入 10 l 水或TE缓冲液溶解DNA； 4) 完毕后各取2l DNA做电泳分析，0.8%琼 脂糖凝胶，进行初步定量（同时还可以观 察载体的酶切结果）。 5) 将酶切后的 2个DNA片段（有时需要在 70oC加热15分钟使酶失活及酚氯仿抽提 ），然后按载体：待插入DNA片段1 ：2（摩尔）混合于一管中（载体可用 50-100ng，对于本实验约1 l载体，2 l DNA片段，根据电泳结果来判断 ） ，加 入T4 DNA连接酶缓冲液1l，最后加T4 噬菌体DNA连接酶1l(5单位)，一般掌