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项目五 对流免疫电泳试验(Counter immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下能相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。 【试剂和器材】1AFP阳性血清、待检血清、抗AFP诊断血清。 2pH8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液。 巴比妥钠10.3 g 巴比妥 1.84 g先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入200ml蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠， 最后加蒸馏水至1000ml。3琼脂凝胶按需要量称取琼脂粉，加入pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L，沸水浴中溶解至澄清。4电泳仪、电泳槽、万用电表。5载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。 【步骤和方法】1制备琼脂凝胶板取溶化的琼脂34ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。 2打孔用绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm，孔距45mm，挑去孔中凝胶。 3加样用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP阳性血清、待检血清，以加满孔为宜，注意不要溢出。 4电泳将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端，两端分别以23层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控制在46V/cm长，或电流34mA/cm宽，电泳3060min。【结果判定】 电泳完毕后关闭电源，待1530min后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保存。阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。1 阳性对照孔 24 待检血清孔 图1-6 对流免疫电泳【注意事项】 1当标本为脂血症、陈旧血标本或由于2-巨球蛋白可引起假阳性，它靠近阳极呈弧状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别，即阳性对照孔与待检孔间距为0.2cm，在两孔中间相距0.4cm处打抗血清孔，加样后电泳，两沉淀线吻合为阳性，相交为阴性，其它试验条件与以上试验相同。 2电泳缓冲液的pH值、离子强度、电压和电泳时间对检测结果均有影响，应注意控制。 3电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为1cm时，电泳时间为1.52h；孔间距为0.6cm时，电泳时间为1h。 4抗原与抗体浓度比例应适当，可通过稀释抗原适当调整，以免出现假阴性。 【方法评价】1简便、快速，敏感度比双相免疫扩散法高816倍。 2必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体，否则结果难以解释。 3必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质。 【临床意义】 对流免疫电泳在临床常用于定性检测某些抗原，以对某些疾病或传染病作快速诊断。也可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线位置、形状作抗原和抗体相对浓度的分析。由于该方法分辨率差，当有多种抗原抗体反应系统存在时，形成的沉淀线常重叠，而难以分辨，所以不用该方法作某种抗原或抗体组分的免疫化学分析。 【思考题】 1对流免疫电泳试验原理如何?为何选用高电渗作用琼脂作为凝胶介质？ 2为何对流免疫电泳比双相免疫扩散试验敏感性高？ 项目六 火箭免疫电泳试验(Rocket immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 抗原在含一定浓度抗体的琼脂板一端，在电场作用下，向另一端泳动时抗原抗体复合物形成的沉淀呈圆锥形，状似火箭而得名。它实质上是在电场作用下的凝胶内单相免疫沉淀试验。当抗体含量不变时，沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。因此用已知不同浓度标准抗原制成标准曲线，即可求出标本中抗原含量，所以又称单相定量免疫电泳。 【试剂和器材】1pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液。 230g/L缓冲琼脂称取3.0g琼脂粉置250ml三角烧瓶中，加蒸馏水50ml，沸水浴中溶解，然后加入上述巴比妥缓冲液50ml混匀后，置4冰箱保存备用。3AFP诊断血清。4待检样品(脐带血清或肝癌病人AFP阳性血清)。5参考血清(已知AFP标准抗原)。6电泳仪、电泳槽、3765水浴箱、万用电表。7载玻片、打孔器、微量加样器等。 【步骤和方法】1取30g/L缓冲琼脂，置水浴煮沸溶化，放52水浴平衡。2释释血清根据抗体的效价，用0.025mol/L巴比妥缓冲液将抗体作适当稀释(一般作1:201:50稀释)，置52水浴保温。3浇板将稀释抗血清与30g/L缓冲琼脂等量混合，注意保温，防止产生气泡(在水浴中操作，动作要轻缓)，用吸管吸取混匀琼脂迅速滴加于载玻片上，每片琼脂量3.5ml。 载玻片要放在水平台上，使浇注的琼脂板厚度均匀。4打孔取冷凝后的琼脂板，在距一端1.5cm处用打孔器等距离打3个孔，挑去孔内琼脂(图1-7)。操作中防止孔四周出现裂纹或破损，否则将影响沉淀峰形状，结果不准确。图1-7火箭免疫电泳图5加样用微量注射器分别于孔内准确地加入待检样品以及不同浓度的标准抗原各10ml。6电泳电泳槽内盛0.05mol/L巴比妥缓冲液。将加好样品的琼脂板置于其上，抗原孔侧放阴极端，用缓冲液浸湿的双层滤纸两端搭桥进行电泳。开始电压为25V/cm，维持1520min，然后增加到2530V/cm(需冷却装置)，电泳13h至完全成峰；或510V/cm过夜。7电泳结束后取下琼脂板，如沉淀峰清晰即可直接判读测量结果，否则可将琼脂板浸泡于10g/L鞣酸生理盐水中会使沉淀峰更明显。如欲永久保留标本，可将琼脂板进行干燥、染色处理(见双相免疫扩散试验)。 【结果判定】1沉淀峰呈尖角火箭形则表示无游离抗原，泳动已到终点；如呈钝圆形或没有峰顶，前端云雾状则表示还未到终点。2从抗原孔中心至火箭顶为沉淀峰高度。以已知标准抗原含量作横坐标，沉淀峰的高度作纵坐标，绘制成标准曲线。根据待检样品沉淀峰的高度查标准曲线即可计算出待检样品中AFP的含量。 【注意事项】 1应选用低电渗作用的琼脂糖作凝胶介质，可避免电渗作用所引起的某些标本的火箭峰倒退。2抗原过浓会使沉淀峰无峰顶，看不到终点；抗体过浓则沉淀峰太低，降低试验敏感度，甚至沉淀峰无法测量；抗体和抗原浓度应适宜。3为防样品向四周扩散，加入样品后应尽快电泳，或在电压为23V/cm通过凝胶介质的情况下加入样品，使结果判定更为准确。标本与标准抗原必须在相同的电泳条件下进行电泳。 4高压电泳所需时间短，但需冷却装置。低压电泳方便，峰形清晰，但需时较长。 5其它注意事项请参考单相免疫扩散试验。 【方法评价】 火箭免疫电泳是在单相免疫扩散基础上发展起来的技术，操作简单，能定量，重复性较好。灵敏度同单相扩散，可测得mg/ml以上的抗原含量，需时短是其优点。为提高灵敏度，可用少量125I标记的标准抗原和被检抗原共同电泳，在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片显影，可出现同位素显影的火箭峰，这就是目前采用较多的放射自显影技术。根据放射自显影示踪的峰高即可计算出待检抗原的含量，可测出ng/m