家蚕保幼激素环氧蛋白水解酶的分子克隆.doc

家蚕保幼激素环氧水解酶的分子克隆及初步表达纯化探索生科院生物科学系10级1班 王亚雯 10092130130摘要 保幼激素是一种重要的昆虫激素，在昆虫的幼虫生长、蛹期变态、成虫生殖等生长和发育过程中发挥了非常重要的作用。保幼激素环氧水解酶是家蚕保幼激素代谢中的一个重要酶，它将保幼激素代谢为保幼激素二醇。目前已有对棉铃虫、小菜蛾等昆虫保幼激素环氧水解酶基因的克隆及其原核表达的研究，还有对家蚕保幼激素环氧水解酶的初步晶体学的研究等，对多种动物都进行了研究，并得到了很大的发展。本文采用RACE技术克隆了保幼激素环氧水解酶基因，应用PCR技术、核酸电泳、双酶切、琼脂糖凝胶电泳等使其初步表达纯化。研究结果表明，大小约为12000bp的目的基因经转化诱导得到的产物约为50bp左右，用100mM 咪唑洗脱得到的蛋白表达最佳。关键字 家蚕，保幼激素环氧水解酶，分子克隆，表达纯化保幼激素是一种具有3个异戊二烯单位的萜烯类化合物，由咽侧体所分泌，是最重要的一类昆虫激素1。它的主要作用是调控昆虫的生长、发育、变态和生殖等2,3,4。因为保幼激素的这种特性使其可作为杀虫剂来有效地防治害虫, 所以它是一类具有良好应用前景的新型生物农药。保幼激素环氧水解酶是参与保幼激素代谢的重要酶之一，存在于某些组织细胞质中，它把保幼激素降解成保幼激素二醇并把保幼激素酸降解为保幼激素酸二醇。Klaffke等6研究了昆虫体内的JHEH, 发现它们对昆虫的生长、发育和繁殖起到了非常重要的调节作用。目前已有对棉铃虫、小菜蛾等昆虫保幼激素环氧水解酶基因的克隆及其原核表达的研究，还有对家蚕保幼激素环氧水解酶的初步晶体学的研究等。家蚕是重要的经济昆虫，同时也是鳞翅目模式昆虫之一，而JHEH是家蚕保幼激素代谢中的一个重要酶。我们克隆了保幼激素环氧水解酶基因，对阳性克隆进行PCR技术、琼脂糖凝胶电泳、双酶切、诱导表达、目的蛋白纯化等，对家蚕JHEH进行初步的探究。材料与方法实验材料、器材及试剂实验材料 家蚕保幼激素环氧水解酶实验器材 恒温摇床，超净工作台，可见分光光度计，冰箱，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，PRC仪，高压蒸汽灭菌锅，铁架台，移液器及枪头，锥形瓶，1.5mlEP管，培养皿，15ml、50ml离心管，吸附柱，比色皿实验试剂 LB培养基，平衡液BL，溶液P2，溶液P3，漂洗液PW，10X multicore buffer，10X BSA，Not I，Nco I，10X 扩增缓冲液 (+MgCl2），2.5mM 4种 dNTP 混合液 (pH8.0)，10mol/L 正向引物，10mol/L 反向引物，蒸馏水，5U/l Taq DNA 聚合酶，缓冲液EB，kana抗生素，IPTG，30%Acr/Bis，pH8.8Tris缓冲液，10%SDS，10%AP，10%TEMED，不同浓度的咪唑溶液实验步骤教师准备：1、目的基因PCR扩增及回收，提取载体质粒，载体和目的基因双酶切2、双酶切产物纯化回收，连接，转化学生操作：1、 筛选阳性克隆（超净台操作）在1.5ml EP管中加入1ml液体培养基，挑取6个阳性克隆 ，用20ul型号吸头（白色枪头）挑取克隆。克隆应为饱满略透明，菌落边缘光滑，单独生长。特别注意：挑中一个克隆，把枪头伸到培养基中，来回吹打， 之后将枪头丢弃。不要碰到别的菌落，否则应弃掉该枪头，重新挑选克隆。2、 摇菌将EP管放在小架子上，拿到摇床中200rpm,37,2h。注意应该保持EP管是倾斜的（45度），这样在摇菌过程中不会沉到管子的底部而导致无法生长。2小时后，在超净台做菌落PCR的加样工作。在加完样后，这些EP管应该继续在摇床中摇菌，直至PCR结果出来再挑选。3、 菌落PCR，每组做6个样品（超净台操作） PCR体系50l总体系8个反应的mix10X 扩增缓冲液 (+MgCl2）5402.5mM 4 种 dNTP 混合液 (pH8.0) 1810mol/L 正向引物1810mol/L 反向引物18H2O39.53165U/l Taq DNA 聚合酶0.54菌液2注意：可以做成Mix溶液，即把6-8倍体积的混合液（除菌落外的）配好，分装在PCR管中，再到超净台去分别加上菌液。这些操作必须在冰上完成！注意：标记一定要清楚，不建议写在管盖上，最好写在管身侧面，并注意记录，不要混淆了样品！PCR反应条件： 4、 电泳1) 制备1%琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖+80ml 0.5TAE（或TBE）缓冲液，加热溶解，待凝胶冷却到50左右时，加入花青素染料（每80ml琼脂糖凝胶中加8ul染料），轻轻倒入电泳槽水平板上（查看是否插好点样梳），除掉气泡。2) 凝胶的厚度在大约 0.60.7 厘米，不少于0.5 厘米。3) 待凝胶冷却至凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面，然后取出点样梳，保持点样孔的完好。将胶板放入电泳槽内，点样孔靠近负极。4) 配制预染液：染料和6loading buffer按1:9混合（如1ul染料和9ul的6loading buffer混合）。预染液可常温或4避光保存三天。（以上教师准备）5) 样品和marker的预染：检测样品和预染液按5:1混合（8ul样品+2ul预染液），预染3分钟。对marker也同样预染。6) 预染后的样品和marker小心地进行点样。每孔加样10ul。7) 打开电泳仪和电泳槽电源，电压70V，即可观察DNA样品的泳动，20min40min。5、 保种过夜（超净台操作）挑选菌落PCR结果为阳性的克隆菌液（3个），三个同学每人一只装有15ml离心管（该离心管中加有3ml含抗生素的培养基），向该离心管中加入菌液100ul。随后，放入摇床200rpm，37，过夜摇菌。6、 灭菌试剂及器皿准备1) 每小组（3人/组）共配制 50ml*3 LB液体培养基，装在3个150ml锥型瓶中；高压灭菌（121/20min) LB液体培养基配方（按1L计算）教师准备1.5L 10个组的量 Tryptone 10g (1%) Yeast Extract 5g (0.5%) NaCl 10g (1%) 加蒸馏水溶解，用NaOH调pH值至7.0，定容到1000ml。2）15ml离心管10只，50ml 离心管 15只 3) 大（蓝色）、中（黄色）、小（白色）枪头各2盒4) 1.5ml Eppendorf管一烧杯 7、重组质粒抽提1) 柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l的平衡液BL，12,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）2) 取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm 离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。向留有菌体沉淀的离心管中加入250 l溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3) 向离心管中加入250 l溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。4) 向离心管中加入350 l溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10 min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。5) 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。6) 向吸附柱CP3中加入600 l漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7) 重复操作步骤7。8) 将吸附柱CP3放入收集管中, 12,000 rpm离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9) 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 l洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。8、双酶切双酶切体系20l total 质粒 1 l 10X multicore buffer 2 l 10X BSA 2 l Not I 1 l Nco I 1 l ddH2O 14 l Gentle 混匀(不能振荡)，稍离心，37 C 水浴过夜。进行核酸电泳。9、大肠杆菌感受态细胞的转化1) 感受态细胞的选择与制备。（教师准备）2) 感受态细胞若保存于-70冰箱，取出后先在冰上复苏5-10min。3) 加入适量的DNA样品(感受态细胞加入到连接产物中，混匀），冰浴30min，中间轻摇防止菌体沉淀。4) 42水浴静置热激90秒，立即放入冰上冷却23min。5) 加入适量（400ul) LB培养基，37,200rpm,振荡培养1hour。6) 将菌液全部加入装有5 ml含抗生素（kana 50ug/ml）的LB培养基中，37，200rpm，振荡培养过夜。10、诱导表达（超净台操作）1) 在前一天转化表达的菌液中补充带有抗性的新培养基至20ml，并将之分装为两管。2) 注意：此时应该用灭菌离心管吸取1ml菌液，保存至4度冰箱做为对照组。3) 测OD=600时的菌液OD值，在OD到达0.6-0.8之间即可诱导表达：用200mM的IPTG按照1：1000加入菌液，使IPTG终浓度为0.2mM。具体步骤：取两个比色皿，一个装3ml蒸馏水，一个装1.5ml 蒸馏水+1.5ml 菌液。去测试室用分光光度计检测OD值。4) 37度，200rpm，诱导4h11、收菌：1) 首先要保证两个离心管及菌液的总重一样2) 4000rpm，4度，10min3) 倒掉上清液，用缓冲液5ml将菌液重悬12、 冻融：将以上菌液放入液氮中反复冻融3次（冻，化，冻，化，冻，化）a) 蛋白胶的制备(一).配胶：(1).分离胶(T=15%) 浓缩胶(T=5%)H2O 5.3mL H2O 2.1mL30%Acr/Bis 2.0mL 30%Acr/Bis 0.5mLpH8.8Tris缓冲液 2.5mL pH6.8Tris缓冲液 0.38mL10%SDS 0.1mL 10%SDS 30uL10%AP 0.1mL 10%AP 30uL10%TEMED 80uL 10%TEMED 30uL总体积 10mL 总体积 3.0mL 注意: 轻缓混合上述液体, 小心溶液出现泡泡( 混合动作激烈会使丙烯酰胺氧化)13、亲和层析法纯化目的蛋白破碎细胞：1、通常为液氮冻融+超声破碎，也可以采用压力破碎。2、液氮冻融：小体积（不超过5mL，保证此步骤在短时间内完成）3、超声破碎：30s，2times。（超声破碎时间不易过长。破碎后可观察菌液清澈度以及粘稠度）4、对于检测表达的蛋白，不需要破碎很长时间。镍柱洗脱：1) 细胞破碎液离心后的上清液加入镍柱中 2) 收集流穿液3) 缓冲液冲洗 20ml，收集4) 10mM 咪唑洗脱10ml，收集5) 20mM 咪唑洗脱10ml，收集6) 50mM 咪唑洗脱5ml，收集7) 100mM 咪唑洗脱5ml，收集8) 200mM 咪唑洗脱5ml，收集9) 500mM 咪唑洗脱5ml，收集10) 1M 咪唑洗脱5ml，收集注意事项：1) 挂柱时流速不可过快，防止效率不高。2) 初次做时严格用镍柱洗脱检测,目的是要得到更纯的蛋白质。3) 最后一步洗脱目标蛋白用5mL体积。4) 洗脱目标蛋白时咪唑浓度不宜过高。（不应超过500mM）14、聚丙烯酰胺电泳检测表达蛋白样品制备：设计好对照组和实验组在本实验中，样品应该包括所有镍柱洗脱中的液体，分别是：上清，流穿，用缓冲液冲洗收集的样品，以及所有咪唑梯度洗脱出的样品。另外， 还需要保留没有诱导前的1ml菌液，作为对照样品。样品：5*Loading buffer 的比例为 8ul 样品加入2ul 5*Loading buffer。一般一个样品做40ul，上样20ul。样品做完后在95度水浴条件下煮10分钟，注意不要让盖子被蒸汽掀翻。电泳条件：200V，大约1h。一开始可以用120V跑胶，当样品通过浓缩胶层之后再换成200V。注意：负极向正极运动。内槽电泳缓冲液应没过胶板的上样孔，外槽电泳缓冲液至少应加到玻板一半的高度。结果与分析1、选定阳性克隆，经PCR后进行核酸电泳。电泳结果如图：本组有六个样品，依次为最左端的16号孔。由图可看出，2、4、5、6号样品出现明显的亮色条带，而1、3号样品的条带很暗，几乎看不到。出现明显亮色条带的样品说明阳性克隆选取的较为成功，具有所需的DNA片段。而条带很暗的样品则有可能是在挑选阳性克隆时，操作不成功，并没有挑取出完整的阳性克隆。故此次选取4、5、6号样品进行后续实验。2、重组质粒进行核酸电泳，结果如下：这是在完成重组质粒后进行电泳，为了检测质粒重组是否成功。本组的样品为紧靠marker左侧的3个孔。由图可看出，3个孔道均出现了两条亮色条带。靠近样孔即10002000bp处的条带颜色较暗，距样孔较远即6200bp左右的条带较亮。这是因为在重组质粒中，载体较大为6200bp左右，使大部分染料聚集在载体上，导致其电泳出的条带较亮；而目的基因片段较小为1200bp左右，附有少量的染料，导致其电泳出的条带较暗。由此可得，三个样品均重组成功。3、重组质粒经双切酶后进行核酸电泳。电泳结果如下：这是在重组质粒经双酶切后，为检测其产物是否正常进行的核酸电泳。本组样品为紧靠marker右侧的3个样孔，由图可看出只有1号样品出现一条微弱的条带，而2号、3号样品几乎看不见条带。经与其他同学讨论，在正常情况下，每个孔道应该出现2条亮带，一条颜色较暗大小为1200bp左右，一条颜色较亮大小5000bp左右。故3个样品电泳结果都不理想，有可能是双酶切过程不够充分；还有可能是我们的样品量太少了，我们的样品量为10微升，而正常的量应为20微升，最终导致电泳结果不明显。4、经诱导后产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如下：从右往左第三个孔道为marker。此次点样加上对照组共四个样品，从最左边开始的四个孔道。由图可看出，只有3号样品出现一条明显的亮带，位于45.066.2bp间，大小为50bp左右。诱导产物并不理想，有可能是buffer没有很好的附着在产物上；由于我们在诱导前测得OD值是符合实验要求的，有可能是诱导不够充分。5、初步纯化目的蛋白后，进行聚丙烯酰胺电泳，电泳结果如下：从右往左第五个孔道为marker，除此之外，从右到左依次为上清，流穿，用缓冲液冲洗收集的样品，以及所有咪唑梯度洗脱出的样品。由图可看出，流穿液比上清液的杂体蛋白多，这与实际并不符，有可能是细胞破碎液流过镍柱时，速度过快，使杂体蛋白被洗脱了，并没有附着在镍柱上，这也可以解释除marker外所有的孔道中条带颜色都很淡。我们的胶制作的不好，使得点样时，样品会流出样孔，这也是颜色很淡的原因之一。即便如此，还是可以看出100mM 咪唑洗脱得到的样品电泳出的条带最为明显，大小50bp左右。故100mM 咪唑洗脱的效果最好。讨论在鳞翅目昆虫的幼虫期，保幼激素维持着幼虫的性状，阻止蜕皮激素起始变态。保幼激素环氧水解酶是参与保幼激素代谢的重要酶之一，在保幼激素的降解代谢中发挥着关键作用7,8,9,10。比如，在烟草天蛾的幼虫阶段, JHEH 的降解是保幼激素代谢的主要途径。11本实验以家蚕为实验材料，对其保幼激素环氧水解酶的分子克隆及初步表达纯化进行探究，以便应用在防虫方面，提高其经济效益。本实验运用了PCR技术、核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳、双酶切等方法，进行了阳性克隆、重组质粒、双酶切产物的核酸电泳，及诱导产物、目的蛋白的琼脂糖凝胶电泳。通过对实验结果的分析，得出大小为1200bp左右的目的基因，其诱导产物为50bp左右，用100mM 咪唑纯化的效果最好。这为以后对家蚕保幼激素环氧水解酶进行其他的研究奠定了基础。下一步可探索该酶的结构与功能的关系以及表达翻译调控机制等, 为进一步解释保幼激素的代谢途径及其应用前景提供基础。致谢这是我们初次进行生物大实验，步骤繁多，耗时较大。十分感谢老师的耐心指导，帮助我们准备各种实验材料，在进行转化的实验中，由于质粒溶液不足，是老师向我们提供了重组的质粒溶液。由于我们的诱导产物不理想，老师向我们提供了目的蛋白，是我们顺利进行了目的蛋白的纯化。在进行目的蛋白的表达时，染色并不理想，老师让我们再次进行了染色，并在第二天帮助我们进行了脱色，及结果分析。谢谢老师从始至终对我们的指导帮助。其次我还要感谢我的搭档尹仙同学，因为她的参与协助，才有了我们的合理分工，才能使实验按照老师的要求顺利进行。这里还要感谢和我们一起做实验的其他同学，因为有了大家的相互合作、体谅、讨论，使我们的实验思路更加清晰、实验进程更加的顺利。参考文献1郭郛, 1979.昆虫的激素. 北京: 科学出版社2欧阳迎春, 李胜, 2003. 保幼激素及其代谢产物的H PLC 分离方法的改进和应用. 昆虫学报, 46 ( 3 ) : 282 2873Kha lilSM, Anspaugh DD, Roe RM, 2006. 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