褐藻多糖对糖尿病小鼠血糖影响的研究.doc

褐藻多糖对糖尿病小鼠血糖影响的研究前 言随着生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus)的发病率持续上升，已成为继心脑血管疾病、癌症之后危害人类身体健康的第三大致残和致死性疾病。糖尿病是由血糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱引起的慢性病。一般认为糖尿病与遗传、环境、病毒感染、肥胖、种族、营养物质代谢失衡以及内分泌失调等因素有关。可分为型，IDDM-胰岛素依赖性糖尿病和型，NIDDM-非胰岛素依赖性糖尿病、其它特殊类型和妊娠期糖尿病四类。型糖尿病患者体内胰岛细胞破坏，导致胰岛素分泌绝对不足，为儿童及青少年最常见的内分泌疾病。型糖尿病则是源于细胞功能低下，胰岛素相对缺乏与胰岛素抵抗(IR)。糖尿病临床表现为血糖水平升高，引起糖代谢紊乱，继发蛋白和脂肪代谢紊乱，同时导致心脑血管疾病、肾功能衰退及视网膜病变。目前，临床上糖尿病的主要治疗手段是注射胰岛素和口服降血糖药，然而长期注射胰岛素、使用口服降血糖药可以引起胰岛素依赖性和苏木杰效应。研究表明，中药在糖尿病及其并发症的治疗方面取得了较大进展，因此，在中药中寻找合适的降血糖药物已经成为降糖药物研究的新的方向。多糖作为中药降糖的主要活性成分，其在治疗糖尿病及其并发症方面的作用得到了广泛的研究，研究表明，多糖主要通过以下几个方面调节血糖：通过其受体调节糖代谢激素水平和酶的活性、通过抗氧化作用和提高机体免疫力等途径，增加糖利用，抑制糖异生，达到改善糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的作用。多糖已越来越受到人们的关注，有学者预言21世纪前几十年将是“多糖时代”，有研究表明褐藻多糖具有很好的清除氧自由基的作用，反映了其具有抗氧化作用1。本文研究了褐藻多糖对正常小鼠和以STZ诱导的糖尿病小鼠模型的影响，检测其血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)等指标，观察褐藻多糖降血糖作用及其对糖尿病小鼠血脂代谢的影响，为其进一步开发利用提供理论依据。材料与方法一、动物来源：昆明种小鼠，雌雄各半，1822g，由北京军事医学科学院动物实验中心提供，合格证编号：0029535二、主要的试剂与仪器设备1.主要试剂：褐藻多糖：由中国科学院金属研究所提供；盐酸二甲双胍：天津太平洋制药有限公司产品；链脲佐菌素：为Sigma公司产品；葡萄糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)试剂盒：均为长春汇力生物技术有限公司产品。2主要试剂的配制:四氧嘧啶的配制：将ALX用生理盐水溶解稀释为10%的浓度用直径22um的滤菌器过滤。链脲佐菌素的配制：先配制A液：0.1mol/L柠檬酸水溶液：柠檬酸晶体（C6H8O7*H2O） 2.10g 加蒸馏水至100ml。再配制B液：0.1mol/L柠檬酸三钠水溶液：柠檬酸三钠晶体（C6H5O7Na3*2H2O） 2.94g 加蒸馏水至100ml。按A液28.0ml、B液22.0ml的比例扩大倍数混合后，即可得到所需0.1mol/L、pH 4.4的柠檬酸缓冲液液体总量，必要时高温高压消毒，4冰箱保存备用。 3.主要的仪器和设备TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；BS-124S电子天平，德国塞多利斯股份公司；TGL-16G-A离心机，上海安亭科学仪器厂；HPX-9052MBE电热恒温箱，上海博迅实业有限公司；F6/10超细匀浆机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；4.实验方法：褐藻多糖对正常小鼠的影响：取小鼠20只，随机分为正常对照组和褐藻多糖组。褐藻多糖组每天分别给予500mg/kg的褐藻多糖，正常组每天给予同体积蒸馏水，第14天眼眶后静脉丛取血，分离血清，测定血糖，取血前一晚禁食不禁水。褐藻多糖对STZ致实验性糖尿病小鼠的作用：造模方法：取小鼠30只，分为正常组、STZ组和ALX组，适应性喂养一天后禁食12 h，ALX组一次性腹腔注射ALX200 mg/kg，STZ组一次性腹腔注射STZ50mg/kg，正常组给予生理盐水。1周后，眼眶后静脉丛取血，分离血清，测小鼠空腹血糖。比较两种方法，择优选择STZ组，取血糖值11.1mmol/L的作为糖尿病模型。实验方法：取成模小鼠30只，按血糖值的高低随机分组，分为模型组、褐藻多糖组和阳性药物对照组，另取正常小鼠10只，作为空白组。各组小鼠每天早九点灌胃治疗，褐藻多糖组灌胃剂量为500 mg/kg，二甲双胍灌胃剂量为160 mg/kg,模型组和空白组给予相应体积的蒸馏水。连续灌胃治疗32天，于第8、21、32天小鼠禁食不禁水12h，眼眶取血，分离血清检测小鼠空腹血糖、血清TG、TC值。统计学处理：统计学方法采用SPSS统计软件，各组数据均用xs表示,组间比较用方差分析。 实验结果1.褐藻多糖对正常小鼠血糖的影响：连续灌胃给药7天，褐藻多糖对正常小鼠的空腹血糖值有降低趋势，但与对照组比较无显著差异(P0.05)，（表1）。提示褐藻多糖对正常小鼠血糖无显著影响。表1，褐藻多糖对小鼠空腹血糖的影响结果(xs,n=10)组别 空腹血糖（mmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L）对照组 4.561.17 2.690.28 1.300.27实验组 4.271.68 2.380.57* 1.160.54*与对照组比较,P0.052.褐藻多糖对STZ致实验性糖尿病小鼠的影响：褐藻多糖对糖尿病小鼠血糖的影响：与模型组比较，褐藻多糖灌胃给药治疗32天后，褐藻多糖组（在成模鼠饲养过程中有两只小鼠死亡）及二甲双胍组血糖显著降低(P0.05,P0.01)。（表2）表2，褐藻多糖对糖尿病小鼠空腹血糖的影响(xs)组别 剂量(mg/kg) 数量 FBG （mmol/L）天数 第0天 第8天 第21天 第32天照组 . 10 7.61.09 8.532.31 9.692.51 8.92.60模型组 . 10 23.638.31 24.818.20 23.687.99 19.28.19褐藻多糖组 500 8 19.978.11* 26.664.57* 17.97.74* 16.567.16* 二甲双胍组 160 10 22.5810.78* 22.4810.69* 15.810.57* 9.69.28*与对照组比较，*P0.05）。（表3）表3，褐藻多糖对血脂未升高的糖尿病小鼠的血脂的影响(xs)组别 剂量(mg/kg) n（数量） TC（mmol/L） TG（mmol/L）对照组 10 2.720.40 1.470.32褐藻多糖组 500 8 2.590.56* 1.350.48* *与对照组比较，P0.05 讨论目前糖尿病的病因和发病机制尚不完全清楚，胰岛素分泌绝对或相对不足而导致的机体代谢紊乱被作为其重要的发病机制。在实验中建立糖尿病模型是研究降血糖药物作用及其机制的关键。糖尿病的动物模型主要分为自发性糖尿病动物模型和采用胰腺切除、病毒诱导、基因敲除、化学药物注射等方法获得的动物模型5。注射化学物质造成糖尿病动物模型，是研究降糖药物的常见方法6。致糖尿病的化学物质很多，目前较为常用的是酰脲酸衍生物四氧嘧啶和链脲佐菌素。为了探讨褐藻多糖的降血糖效应及其可能的作用机制，本研究对比两种造模方法分别进行了实验研究，最终本实验选择通过一次性大剂量腹腔注射STZ诱导了糖尿病小鼠模型。临床上常用的口服降血糖药物主要有磺酰脲和双胍两类化合物。双胍类药物不刺激胰岛素分泌，主要作用于胰腺外组织，促进周围组织对葡萄糖摄取和利用（无氧酵解），抑制肝糖异生及糖元分解，减少肝糖输出，使血糖下降，不增加体重，因此本研究选择二甲双胍作为阳性药。多糖(polysaccharides, PS)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，又称多聚糖，是由单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分支连接而成的链状聚合物。多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有的生物中，是构成生命的基本物质之一，在生物体内不仅作为能源物质，而且参与了生命现象中细胞的各种活动。自20世纪50年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，多糖的研究受到越来越广泛的重视。近20年来，有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其生物活性包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫调节等7。由于多糖在自然界分布广泛，资源丰富，具有多种生物活性，毒副作用小，己成为天然药物开发的热点之一。多糖种类：1.真菌类多糖：宗灿华等研究发现，黑木耳多糖能够显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，能减弱四氧嘧啶对胰岛细胞的损伤或改善受损伤的细胞的功能，增加胰岛素的分泌而使血糖降低8。2. 海洋生物多糖：海洋生物中存在大量的具有生物活性的多糖类物质，随着人们对海洋生物多糖研究的深入，发现许多海洋生物体内存在具有降血糖活性的多糖类物质。3. 植物多糖：国内外近年来对植物多糖的降血糖作用及其机理进行了广泛的研究，取得了一定进展。人参多糖可引起血糖肝糖元降低，肾上腺的切除对其无影响，对胰岛素释放有促进作用9,10。丹皮多糖能够显著降低糖尿病模型小鼠的高血糖，促进血糖转化为糖元，显著提高小鼠肝糖元的含量，改善小鼠胰岛素抵抗11,12。黄芪多糖对血糖及肝糖元有双向调节作用，：吴勇等研究表明APS能降低四氧嘧啶大鼠的血糖和血清MDA水平，升高血清NO和胰岛素水平，并能保护血管内皮细胞，改善糖尿病大鼠微血管病变13,14。赖雁妮等研究发现黄芪多糖能改善STZ诱导糖尿病大鼠的糖、脂代谢。张汝学等报道，地黄低聚糖对正常大鼠血糖均明显影响，对四氧嘧啶糖尿病大鼠可明显降低血糖值，增加肝糖元含量，降低肝葡萄糖-6-磷酸酶活性 15,16。徐子辉等研究发现薏苡仁多糖能够显著降低正常小鼠，肾上腺素和四氧嘧啶之高血糖小鼠的血糖，能够改善型糖尿病大树的胰岛素抵抗。多糖是植物的主要活性成分之一，许多植物多糖均具有降血糖活性，包括茶多糖、南瓜多糖、百合多糖、麦冬多糖等17-22。本实验通过STZ造模小鼠后，灌胃治疗糖尿病小鼠经过32天的动态观察，发现褐藻多糖组与对照组比较小鼠空腹血糖值虽然有一定的波动，但是最终检测血糖值还是明显降低。褐藻是一种较高级的藻类，褐藻多糖来自于海带巨藻、泡叶藻、墨角藻等，主要包括褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉。褐藻多糖有很好的抗氧化作用，属于自由基清除剂范畴，自由基清除剂是现在比较热门的研究领域，是指凡能够干扰自由基连锁反应的引发及扩散过程，并抑制自由基反应的过程任何一种物质称为自由基清除剂，大致分为4类23:1.内源性清除物质：内源性清除物质可分为抗氧化酶及抗氧化剂, 抗氧化酶：SOD（超氧化物歧化酶）；CAT（过氧化氢酶）；GSH- PX（谷胱甘肽过氧化氢酶）：。抗氧化剂：维生素E(生育酚) 、维生素C、胡罗卜素、谷胱甘肽以及尿酸、血浆铜蓝蛋白等2.外源性清除自由基物质：作用于自由基损害机体组织的不同环节,或作用于自由基产生前的环节,以阻止或减少其生成,或作用于细胞膜,以保护细胞膜免遭自由基的攻击,如多酚类自由基清除剂等。3.具有抗氧化作用的中草药与食物：传统中医提倡药补与食补,近年来各国学者颇重视中草药及食物中有效成分对清除自由基的直接和间接作用如灵芝、党参、褐藻等。4.微生物来源的自由基清除剂：是包括传统的抗生素在内的,所有具有某种药理活性的微生物次级代谢产物自由基清除剂和自由基是相互拮抗，自由基是机体内有机物分子的共价键通过均裂方式产生的,是具有不配对电子的原子团、分子或离子。自由基极不稳定,具有高度化学性,通过脂质过氧化作用等方式对机体造成严重损伤,能破坏DNA ,改变酶活性,破坏细胞膜结构,影响膜功能,参与病变的启动和促进阶段24。链脲佐菌素是自由基激活剂可直接损伤胰岛细胞，使胰岛素分泌减少，引起糖代谢紊乱，导致血糖升高，出现糖尿病症状。本实验中，在给小鼠一次性腹腔注射200mg/kgSTZ生理盐水溶液，引起高血糖，小鼠表现出与临床“三多一少”相类似的症状，说明本模型制备成功。褐藻多糖给药治疗后，本实验观察到，褐藻多糖能够明显降低STZ所致糖尿病小鼠的血糖值，改善糖尿病小鼠多饮、多尿、多食症状。肝脏是糖代谢过程中的关键部位，食物糖类经过消化吸收，主要以肝糖元的形式储存于细胞内，这对维持血糖恒定是很重要的。胰岛素可以激活肝中的糖元合成酶，促进糖元的合成，也可以通过诱导葡萄糖激酶合成和加强磷酸果糖激酶的作用促进葡萄糖分解，从而降低血糖。STZ能够选择性的破坏胰岛细胞，使胰岛素分泌不足，从而抑制糖元的合成，又可使己糖激酶缺乏使葡萄糖不能磷酸化，葡萄糖穿过细胞膜逸出，造成高血糖及糖尿病。结合本研究结果说明,褐藻多糖能够显著降低STZ诱导的糖尿病小鼠的高血糖。褐藻多糖可能通过促进糖元合成，抑制糖元分解，使作为机体血糖来源于去路的肝糖元代谢紊乱趋于好转，还是通过其它可能的机制，还需进一步的探讨。胰岛素是由胰岛细胞分泌的一种激素，它是一种蛋白质，是体内唯一能降低血糖的激素。胰岛素参与机体代谢，它的降低血糖的机制是通过促进肝脏对糖的摄取，用来合成肝糖元，使血糖下降；促进肌肉组织对糖的利用，合成肌糖元使血糖下降；促进脂肪组织摄取葡萄糖合成脂肪，减少血糖水平；同时胰岛素还通过抑制肝糖元分解，抑制脂肪、蛋白质生成葡萄糖即抑制糖异生，从而作用于糖代谢过程。胰岛素分泌绝对或相对不足，是糖尿病发病的重要病理基础，前人对多糖的研究表明，多种植物多糖降低血糖的机理都与其能够促进胰岛素的分泌有关24。机体在新陈代谢中产生的自由基，包括超氧化物自由基、过氧化物自由基、羟基自由基等。自由基在体内产生过多或清除过少，均可损伤机体。自由基引发的脂质过氧化反应是细胞损伤的主要机制之一，MDA是脂质过氧化反应的主要降解产物，其含量可反应脂质过氧化的程度。在正常情况下，机体内的自由基生成系统和消除系统，相互协调，维持着自由基的产生和消除的动态平衡。有实验结果显示25，在四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型中，模型组小鼠血清SOD活性低于正常组，而MDA含量高于正常组，表明糖尿病小鼠体内的自由基清除出现障碍。褐藻多糖可能通过提高机体抗氧化功能，抑制氧自由基对胰岛细胞的损伤，从而降低糖尿病小鼠的血糖。血浆中所含的脂类统称为血脂，主要包括甘油三酯和总固醇等，糖尿病患者常可见血脂代谢紊乱，且与血糖程度有相关性，但是与对比其他研究26 ，多糖类能够降低糖尿病小鼠的血脂浓度，但是本研究造模糖尿病小鼠血脂升高不明显，导致褐藻多糖在调节血脂浓度方面未观察到明显效果，因此本研究得出褐藻多糖对血脂未升高的糖尿病小鼠的血脂无明显影响,至于本研究具体什么因素导致这些造模小鼠的血脂浓度无明显变化，有待进一步研究。结论褐藻多糖能有效的调节血糖代谢，是一个非常有前景的多糖类降糖药物。参考文献1 Bergam RN,Phillips LS,Cobelli C.Physiologic evaluation of factors controlling glucose tolerance in man:measurement of insulin sensitivity and beta-cell glucose sensitivity from the response to intravenous glucose J.The Joural of clinical investigation,2001,68(6)1456.2 孔庆胜.南瓜多糖的分离、纯化及其降血脂作用J.中国生化药物杂志2000,21(3):130.3 Kiho T,Yamane A,Huij,et al.Polysaccharides in fungi.XXXV Hypoglycemic activity of polysaccharides(CS-F30)from the cultured mycelium of Cordyceps sinensis and its effect on glucose metabolism in mouse liverJ.J Bio Pharm Bull,1996,19(2):294.4 陈建国,梅松,付颖等.四氧嘧啶高血糖模型小鼠的实验研究J.浙江省医学科学院学报,2004,56(3):9.5Rahimian R,Masih-KhanE,Lo M,ETAL.Hepatic over-expression of peroxisome proliferator activated receptor game 2 in the ob/ob mouse model of non2insulin dependent diabetes mellitusJ.Mol Cell Biochem, 2001,224(1-2):29.6 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