《酶的免疫化学测定》PPT课件.ppt

第五节 酶的免疫化学测定 二十世纪70年代以来，随着免疫学技术 的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利 用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接 测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶 活性方法比较，这些方法不仅灵敏度高，而 且能测定一些以前不易测定或测定条件不易 掌握的酶。 (一)测定原理 放射免疫测定(RIA)分为直接法与间接法。 直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应 抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量 测定。 间接法是将样品中无放射性的酶蛋白与放射 性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争， 根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间 接法为最常用。 另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定 (CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定 (FEIA)等。 报告方式有两类： 一类是用酶活性浓度单位，如免疫抑制法测定 CK-MB酶活性(actiyity)，结果常以UL报告； 另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测 定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量)，结果常直接用 ngml或6gL报告。 (二)免疫化学测定的优缺点 血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活 性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化 两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条 件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶 活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映 酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一 致，有时甚至出现两者变化完全相反的情况 。 与传统的酶活性测定法相比，免疫化 学测定法的优点主要有： 灵敏度高，能测定其他方法不易测 出的少量或痕量酶； 特异性高，不受体液中其他物质， 如酶抑制剂、激活剂等的影响； 能用于一些不表现酶活性的酶蛋白 ，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传 变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定 ；特别适用于同工酶的测定。 酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有： 要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免 疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且 工作量很大； 测定步骤多，操作繁琐； 测定成本高。 第六节 同工酶及其亚型测定 一、概 念 同工酶 是同一种属中由不同基因或等位基因所 编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的 催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、 生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类 酶。 亚型 某些酶或同工酶从组织进入体液后，可进 一步变化为数个不同类型即所谓“亚型，也称为同 工型(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻 译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型 往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作 用降解而形成。 三、分析方法 临床同工酶的分析大致可分为两步，即 首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然 后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的 活性。 (一)电泳法 1方法 电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、 分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态 。 目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多 采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采 用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分 离与鉴定。 此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚 焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤 主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用 电泳法进行区带分离的原理与其他蛋 白电泳相似。 2显色染料 常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易溶 于水，难溶于一般的有机溶剂。 酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成不 同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起着受 氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原成紫红 色的甲躜(formazan)和紫蓝色的双甲躜。 常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐(NBT)，碘化硝 基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT 生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用最 多。 3扫描定量 显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫 描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小 薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下 将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出 各同工酶或亚型区带的活力。 图6-6为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工 酶谱(图谱中从左至右分别为LD1-LD5)。 4注意事项 用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同 工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子 酶形成的原因主要有： 酶与免疫球蛋白形成的复合物，如 CKBB-IgG 、 CK-MM-IgA、LD-IgA等； 酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-脂蛋 白； 酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CKMt 聚合物、LD亚基自身聚合等。 如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，同工 酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造 成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。 (二)色谱法 常用色谱法是柱色谱，如离子交换色谱和 亲和色谱等用于同工酶的提纯与制备，但方法 费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。 目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微 型色谱柱。也有应用阴离子交换色谱结合免疫 化学法、聚焦色谱结合电化学检测法进行CK亚 型分析和研究的报道。 (三)免疫分析法 由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化 学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制 备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生 特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同 工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的 免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。 (四) 动力学分析法 (五) 蛋白酶水解法 第七节 临床常用血清酶、同工酶及其 亚型分析 临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。 若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引 起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增 加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌 ，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引 起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能 反应疾病的部位、性质和程度。 由于酶广泛分布于全身各器官、组织，在 血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一 酶的活性变化，很难做出独立诊断。若同时测 定一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化， 就能根据酶增高或减少的“谱型”做出诊断， 此种同时检测一组酶，称为酶谱。 如：(1)心肌酶谱：传统的心肌酶谱由CK、AST、 LD和-HBD组成，这一组合在我国临床化学实验室 一直应用至今。目前最简单而有效的心肌酶谱可由 CK、CK-MB、CK-MB 型或CK-MM 型组成。近 年来心肌酶谱在AMI的早期诊断中的应用价值受到 了心肌肌钙蛋白的挑战。 (2)肌酶谱：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监 护。可供选择的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶 。若能再加CK-MM亚型则更为理想。 (3)肝酶谱： 主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、 肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。 (4)肿瘤酶谱： 具有器官特异性的有ACP及其同工酶、 ALP及其同工酶、-GT及其同工酶、AFU、 AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性的有 ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等 。 (5)胰酶谱： 主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别 诊断。可供选择的有AMY及其同工酶、 LPS、弹力蛋白酶-1、磷脂酶A2、尿胰 蛋白酶原-2等。 一、转氨酶及其同工酶 (一)生物化学特性 转氨酶是一组催化氨基在氨基酸与- 酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶 (ALT)和(天)门冬氨酸氨基转移酶(AST)是其 中最重要的两种。 AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为 心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70存在于肝细胞线粒 体中。 AST有两种同工酶ASTs和ASTm， ASTs存在 于可溶性的细胞质中,ASTm存在于线粒体中。细胞 轻度损伤时ASTs升高显著，而严重损伤时，则ASTm 大量出现于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要 为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以 ASTm为主。 血清AST活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；肾 脏或胰腺细胞损伤时，也可出现很高的AST活性。 ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、 心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示 肝脏损伤。ALT有两种不同活性的同工酶 (ALTs)、(ALTm)，分别存在于细胞质及线 粒体，后者的活性为前者的16倍。肝细胞坏死 血清中以ALTm为主。 (二)测定方法 转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。 目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。 ALT速率法测定中酶偶联反应式为： ALT L-丙氨酸+-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸 LD 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ AST速率法测定中酶偶联反应式为： AST L-门冬氨酸+-酮戊二酸 草酰乙酸+L-谷氨酸 MD 草酰乙酸+NADH+H+ L-苹果酸+NAD+ 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶 活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据 线性反应期吸光度下降速率(-Amin)，计算出ALT 、AST的活性浓度。 (三)临床意义 ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临 床上主要用于肝脏疾病的诊断。 各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起 的急性肝损害时，血清ALT水平可在临床症状(如 黄疸)出现之前就急剧升高且ALTAST。 急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相 平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶， 是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如 能同时测定AST，并计算ASTALT之比，则对于 急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也 特别有价值。急性肝炎时比值ALT。 二、-谷氨酰转移酶及其同工酶 (一) 生物化学特征 谷氨酰转移酶(-GT或GGT)又称-谷 氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。组织分布以肾脏 含量最多，其次为胰、肺、肝等。 血清中的-GT则主要来自肝胆，红细胞中 几乎无-GT，因此溶血对其测定影响不大。- GT催化-谷氨酰基从谷胱甘肽(GSH)或其他含 -谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上 。 (二)测定方法 -GT的测定方法有数种，目前国内外 多采用连续监测法测定血清-GT活性。 IFCC参考方法采用L-谷氨酰-3-羧基 对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸( 双甘肽)作为-谷氨酰基的受体。在pH7.7 的条件下，-GT催化底物生成-谷氨酰双 甘肽和黄色的2硝基-5-氨基苯甲酸，在 410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高 速率与-GT活性成正比关系。 (三)临床意义 -GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。胆道 疾病如胆石症、胆道炎症、肝外梗阻时，-GT不 仅阳性率高，而且升高明显。肝实质疾病如肝炎 、脂肪肝、肝硬化时-GT一般只是中度升高(ULN 的25倍)，这点有助于肝胆疾病的鉴别诊断。 若ALP升高而-GT正常可完全排除ALP的肝来 源，若ALP和-GT均增加，则应先排除肝外引起 -GT增加的原因，一旦排除，则-GT增高即为 肝病所致。 -GT还可用于判断恶性肿瘤有无肝转 移，肿瘤患者如有-GT的升高，常说明有 肝转移。 -GT与乙醇的摄取量有关，饮酒时， 由于乙醇对肝细胞线粒体的诱导导致-GT 活性升高，故对乙醇性中毒的判定有相当 的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激 素的避孕药者常有-GT升高。 用醋纤膜电泳可将-GT同工酶分为- GTl、-GT2、-GT3和-GT4 四种，正常 人只见-GT2和-GT3。重症肝胆疾病和肝 癌时常有-GTl出现，乙醇性肝坏死和胆总 管结石时常有-GT2增加，胆总管结石及胰 腺炎时-GT2也增加。-GT4与胆红素增高 密切相关。 三、肌酸激酶及其同工酶和亚型 (一)生物化学特性 肌酸激酶(CK) 催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP 之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生的磷酸肌酸含 高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。CK广泛 分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。 CK是由M和B两类亚基组成的二聚体。在细胞质内 存在3种同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK- MM(CK3)。在细胞线粒体内还存在另一CK同工酶，即 所谓线粒体CK(CK-Mt)，也称CK4。各种CK同工酶还 可进一步根据所带电荷和等电点不同分离数目不等的 亚型。 (二)测定方法 CK的测定方法以酶偶联法最常用，是CK的参考 方法.有两种工具酶及指示酶参与反应。原理如下： CK 磷酸肌酸 + ADP 肌酸 + ATP HK ATP + 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 + ADP G6PD 6-磷酸葡萄糖 + NADP+ 6-磷酸葡萄糖酸盐 + NADPH +H + 可在340nm波长下测定NADPH生成速率而 计算CK活性浓度。 临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制 法，但两法均会受溶血和巨CK的干扰，免疫抑 制法还会受到CK-BB的干扰。因此现在推荐用 免疫化学方法直接测定CKMBmass，可不受 溶血和巨CK的干扰。CK同工酶亚型(CK-MM 型和CK-MB 型)多用琼脂糖凝胶高压电泳和等 电聚焦电泳等。 (三)临床意义 CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次 数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑 疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。 AMI时总CK活性升高显著，约在梗死后3 8h即升高，1024h达峰值，34d恢复正常。 CK极度升高(3000UL)主要见于全身疾病 ，特别是肌肉疾病，此时CK测定有助于肌萎缩 病因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CK显著升 高。 此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染 性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。但 神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。 CK-MM亚型测定对早期AMI的检出更为敏感， 一般以 CK-MM3CK-MM11.0作为诊断AMI的标 准，但必须排除急性骨骼肌损伤。AMI发病24h CK-MM3CK-MM1 即开始升高，812h达峰值。 CK-MB2亚型在AMI早期诊断和判断有无再灌注上有 很高的灵敏度和特异性。一般CK-MB21.9UL或 CK-MB2CK-MBl1.5可作为AMI的诊断标准之一 。 四、乳酸脱氢酶及其同工酶 （一）生物化学特征 乳酸脱氢酶(LD或LDH)催化乳酸氧化成丙 酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为NADH，依 条件不同而有可逆性。反应式如下： L-乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于 人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、红 细胞含量较多。 LD是由两种不同亚基(M和H)组成的四聚 体，形成5种结构不同的同工酶，即LD1(H4) ，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和 LD5(M4)。 这5种同工酶大致可分为三类： 一类以LD1为主，主要在心肌，可占总LD 活性50以上，也存在于红细胞内； 另一类以LD5为主，以横纹肌为代表，肝 脏中也有； 第三类以LD3为主，存在于脾、肺。 (二)测定方法 目前根据LD催化反应方向的不同，有两大类 测LD方法，一大类为以丙酮酸为底物的逆向反应 (称LD-P法)；另一大类以乳酸为底物的顺向反应 (称LD-L法)。我国多采用目前IFCC参考方法LD-L 法，用连续监测法进行测定。 LD同工酶测定以琼脂糖凝胶电泳法更多用。 一般成年人血中LD同工酶存在如下规律： LD2LDlLD3LD4LD5，部分正常儿童血中可见 LDlLD2。 (三)临床意义 临床上测定LD及其同工酶常用于诊断和鉴别诊 断心、肝和骨骼肌的疾病。 AMI时，LD由于分子量较大，在常用心肌酶中升 高最迟，通常在梗死818h升高，48144h达峰值 ，可显著升高(5ULN)，因其半寿期较长，增高持续 时间可达510d，此时其他酶已恢复正常，在亚急 性心肌梗死诊断上有一定价值。但其诊断AMI特异性 差，运动后、肾病综合征等可呈现轻度升高(0.6、腹水LD血清 LD0.4为渗出液，反之为漏出液。 临床上测定LD同工酶 有助于相应组织病变的诊 断。心肌梗死和心肌炎时 以LD1和LD2升高为主，且 绝大多数的AMI患者血中 LD同工酶都出现LDl LD21，即所谓“反转比率 ”现象，且持续的时间长 。 骨骼肌和肝细胞损伤时 常出现LD5LD4。 肺、胰、脾、淋巴结坏 死和炎症及各种恶性疾病时 LD2、LD3、LD4升高； 溶血性疾病时LD1和LD2 升高，但仍为LD2LD1；恶性 肿瘤如转移到肝脏往往伴有 LD4、LD5升高。 五、碱性磷酸酶及其同工酶 (一)生物化学特征 碱性磷酸酶(ALP) 广泛存在于各器官组织中 ，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小 肠、骨骼等。血清中ALP主要来自肝脏和骨骼。生 长期儿童血清内ALP大多数来自成骨母细胞和生长 中的骨软骨细胞，少量来自肝。尿中ALP并非来自 血液，而是直接来自肾小管细胞。人体各组织ALP 同工酶可分为3大类，即胎盘ALP、肠ALP和肝骨 肾ALP同工酶。 (二)测定方法 ALP的测定方法有多种，目前国内应用较多 的方法为连续监测法，以磷酸对硝基酚(4-NPP) 为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)或二乙醇 胺(DEA)激活型缓冲液为磷酸酰基的受体。4- NPP在碱性溶液中为五色，在ALP催化下，4-NPP 分裂出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚。后 者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的 黄色。在波长405nm处连续监测吸光度增高速率 ，计算ALP活性。 (三)临床意义 在骨生长、妊娠、成长、成熟和脂肪餐后 分泌等生理情况下，ALP活性可增高。除外上述 生理性增高，临床上测定ALP主要用于骨骼、肝 胆系统疾病等的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸 的鉴别诊断。对于原因不明的高ALP血清水平， 可测定同工酶以协助明确其器官来源。 急性肝炎包括病毒性肝炎和中毒性肝炎 ，ALP增高达25ULN，而肝硬化、胆石症和 肿瘤引起的胆汁淤积，ALP增高达ULN的5 20倍。90以上的肝外胆道阻塞患者血清 ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成 正比。如果血清中ALP持续低值，则阻塞性黄 疸的可能性很小。若血清胆红素逐渐升高，而 ALP不断下降表示病情恶化。 肝外阻塞性黄疸、转移性肝癌、肝脓肿和 胆石症时胆汁ALP检出率很高，并伴有肝ALP 增加，而肝内胆汁淤积、急性肝炎、原发性肝 癌等主要表现为肝ALP增多，大多数不出现胆汁 ALP。 各种疾病所致骨损伤等，均引起ALP活性升 高，尤其是骨ALP同工酶增高。 六、酸性磷酸酶及其同工酶 (一)生物化学特征 酸性磷酸酶(ACP) 存在于人体不同组织，如前列 腺、红细胞等，主要存在于细胞的溶酶体中，以前列 腺含量最多。 正常男性血清中ACP约主要来自前列腺，其余部分 及女子血清中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞 及破骨细胞等。 ACP同工酶分前列腺ACP(PAP)和非前列腺ACP(如红 细胞ACP、溶酶体ACP、破骨细胞或吞噬细胞ACP等)两 大类，在前列腺中含有丰富的PAP，比其他组织约多 100倍。测定标本应及时分离血清(浆)并尽早测定。 (二)测定方法 ACP的测定底物、原理和方法与ALP相 似，只是反应pH为酸性。国外多推荐使用 磷酸百里酚酞为底物的比色法，因为PAP对 此底物亲和力高，测定结果基本能反映ACP 含量高低。此外还可通过用L-酒石酸这类 抑制剂鉴别和估量PAP活性。由于ACP不稳 定，酶活性测定困难，目前已发展一些免 疫学方法特异而灵敏地测定ACP(特别是 PAP)。 (三)临床意义 ACP及其同工酶测定主要用于诊断前列 腺癌。前列腺癌时血清ACP活性显著升高， 前列腺癌患者血清PAP也明显增高，其中肿 瘤分化较好者增高尤为显著。 急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移 及甲亢时ACP可轻度升高。是否为抗酒石酸 盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴 别要点。 七、淀粉酶及其同工酶 (一)生物化学特征 淀粉酶(AMY)：人和动物只含-AMY。人体中 胰腺含AMY最多，由胰泡细胞合成后通过胰管分泌 人小肠，唾液腺也分泌大量AMY入口腔开始消化多 糖化合物。 AMY是一种需钙的金属酶，其最适pH在6.5 7.5之间，卤素和其他阴离子有激活作用。AMY分子 量较小，易由肾脏排出，半寿期很短，约2h，所以 病变时血清AMY增高持续时间很短。除肝素外，其 他抗凝剂如枸橼酸、草酸盐及EDTA等都有抑制作用 ，故不宜用去钙血浆测定AMY。 (二)测定方法 国内外目前测定AMY应用较多的是以麦 芽多糖为底物的方法，如2-氯-对硝基苯麦芽 三糖苷(CNP-G3)和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽 庚糖苷(4NP-C7)法(亦称EPS法)，以后者最常 用，也是IFCC的推荐方法。反应最后生成对硝 基苯酚，其生成量在一定范围内与AMY活性成 比，在405nm可以进行连续监测即可测出AMY的 活性。 (三)临床意义 长时间以来，AMY水平一直作为评价胰腺 外分泌功能的一种辅助诊断指标。人体胰腺 和腮腺组织损伤时，血清和尿中的总AMY可显 著增高，肾功能不全患者也有部分AMY增高。 在急性胰腺炎发病后23h AMY开始升高，多在12 24h达峰值，25d下降至正常。如持续性升高达数 周，常提示胰腺炎有反复，或有并发症发生。 而尿AMY约于发病后1224h开始升高，下降也比 血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价 值。 临床上检测AMY用于胰腺炎诊断时，应注意AMY增 高幅度与病情不成比例，如原AMY已升高却发生与症 状不相应的降低时，常为凶险的坏死性胰腺炎的预兆 。AMY水平正常也不能完全排除急性胰腺炎。 八、脂 肪 酶 (一)生物化学特征 脂肪酶(Lipase，LPS或LlP) 是胰腺外分 泌酶。LPS可被巯基化合物、胆汁酸、Ca2+及 辅脂肪酶等激活剂激活，而被重金属、丝氨 酸所抑制。血清中LPS主要来自胰腺，少量来 自胃肠粘膜。 (二)测定方法 迄今测定LPS的方法可分为3类：测定产物 (游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分 光光度法、荧光法和pH电极法等)；测定底物 的减少量(如比浊法、扩散法等)；测定LPS的 实际质量(双抗体夹心免疫分析法、乳胶凝集 法)。目前在国内大多实验室主要以滴定法、 比浊法和分光光度法为主。 比浊法以橄榄油悬液为底物，其与水混合常呈 乳糜状，血清中的LPS分解橄榄油乳剂生成水溶性的 甘油和脂肪酸，浊度随之下降，根据浊度降低的程度 ，可计算出LPS活性浓度。此类方法可在400nm波长下 比浊，测出因橄榄油乳剂的变化吸光度的变化。或者 以340nm波长连续监测浊度的变化。以连续监测法为 常用。 分光光度法目前有两类比较常用： 一类为酶偶联显色比色法，多用1，2-甘油 二酯为底物，在LPS和单酸甘油酯脂肪酶的催化 下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通过甘油激 酶作用生成3-磷酸甘油，再通过甘油磷酸氧化 酶过氧化物酶体系和4-AAP色素原体系产生紫 红色。于550nm波长连续监测吸光度的变化即可 计算LPS活性浓度。此类方法特异性高，通过双 试剂也基本可解决内源性甘油的干扰问题。 另一类采用人工合成底物1,2-二月桂基- rac-丙三氧基-3-戊二酸试灵酯设计的连续监 测法。该底物在碱性环境中，在LPS和辅脂肪 酶作用下，水解生成1,2-二月桂基甘油和戊 二酸-6-甲基试卤灵。后者不稳定，可自发 分解生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵 在577nm波长附近有吸收峰，连续监测其吸光 度变化可定量测定LPS活性浓度。此法具有简 便、快速、灵敏、稳定和抗干扰能力强等特 点。 (三)临床意义 正常人血清LPS含量极少，但在急性胰腺炎时，2 12h血清LPS显著升高，24h至峰值，可达10ULN，甚 至5060ULN，至 48-72h可能恢复正常，但随后又可 持续升高815d。由于血清LPS在急性胰腺炎时活性 升高的时间早，上升的幅度的大，持续的时间长，故 其诊断价值优于AMY。临床观察发现，凡血清AMY升高 的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高 ，约有23AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰 腺炎的急腹症有血清AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙 醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血清 LPS可有不同程度的升高。 九、胆碱酯酶 (一)生物化学特征 胆碱酯酶(ChE)是一类催化酰基胆碱水解的 酶类。人体主要有两种，即乙酰胆碱酯酶 (AChE)又称真性胆碱酯酶或胆碱酯酶、丁酰 胆碱酯酶(BuChE)又称假性胆碱酯酶或称拟乙酰 胆碱酯酶(PChE)或胆碱酯酶。临床常规检查 的胆碱酯酶(SChE)即指后者，通常简称为ChE。 AChE主要分布于神经组织、肌肉、红细胞、 肺等处，其生理功能是催化水解乙酰胆碱，能 使神经细胞反复除极。ChEBuChE主要在肝脏 合成，也分布于胰脏、心脏、小肠粘膜、大脑 灰质、血浆及淋巴液等处。ChE的真正生理功能 至今尚未阐明。许多抑制剂对两种ChE有抑制作 用，如生物碱(吗啡、毒扁豆碱)、枸橼酸盐、 氟化物、有机磷杀虫剂等 (二)测定方法 主要有两类方法用于临床常规ChE测定，一 类以乙酰胆碱为底物，测定水解反应生成的酸。 常用指示剂(如间-硝基酚或溴百里酚蓝)测pH法 。特别是纸片法简便快速，适用于急诊有机磷中 毒的快速筛查。但此类方法准确度较差。另一类 以人工合成底物测定胆碱衍生物的生成。 丁酰硫代胆碱法是目前测定血清ChE最常 用的方法。测定原理如下： 丁酰硫代胆碱+H2O *又称Ellman试剂或简称DTNB 在405nm波长连续监测测定吸光度值的变化，即 可计算血清ChE的活性浓度。 本法简便、快速，易于自动化。但只能测定血清 ChE，而不能测定红细胞AChE。 (三) 临床意义 血浆或血清中AChE的含量甚微，临床上测定红细胞 中的AChE用于有机磷中毒的诊断。 由于ChE在肝脏合成后立即释放到血浆中，故是评 价肝细胞合成功能的灵敏指标，与清蛋白生成有密切关 系，故测定血清ChE一般用作肝功能试验。肝、胆疾病 时ALT、-GT均升高，往往难以鉴别，如增加血清ChE 测定，可发现ChE降低者均为肝脏疾患，而正常者多为 胆道疾患。 血清ChE减少主要见于肝病和有机磷中毒，增加主 要见于肾病综合征。 小 结 酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊 蛋白质。体内大多数酶为结合酶，除含酶蛋白 外，还含有辅因子(辅酶和辅基)。酶可分为氧 化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶、 异构酶类和合成酶类等六大类。酶促反应具有 高效、高度特异性和可调节性等特点，影响因 素主要有酶浓度、底物浓度、pH、温度、电解 质及辅酶、激活剂及抑制剂等。其中底物浓度 对酶促反应的影响可用米-曼氏方程表示。 血浆酶可分成血浆特异酶和非血浆特异酶 两大类，后者可再分为外分泌酶和细胞酶等。 正常情况下血清中酶活性相对恒定。但一些病 理情况常导致血清中酶活性的改变。性别、年 龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人 血清中某些酶的生理性变化。 酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方 法。根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量 ，可计算出酶活性浓度的高低。按检测方法分类主 要方法有量气法、分光光度法、荧光法和放射性核 素法、电极法等，以分光光度法最常用。 按反应时间分类，可分为定时法和连续监测法两大 类。其中连续监测法是目前临床实验室最常用的方法， 可分为直接法和间接法两大类。 直接法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定 吸光度、荧光等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光 光度法应用最为广泛。 间接法以酶偶联法应用最多。测定酶活性浓度时可 受到一些如其他酶和物质的干扰、酶的污染、非酶反应 、分析容器的污染和沉淀形成等因素的影响，可通过试 剂空白管检出并加以校正或改用双试剂加以解决。 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度 或酶活性的酶称为工具酶。在临床生物化学检验中，许 多代谢物浓度的测定往往使用有工具酶的参与的反应， 即所谓共通反应途径。 用自动生物化学分析仪进行酶学测定时，要合理选 择方法并进行参数的设置。在标本的采集、运输与保存 时要特别注意溶血、抗凝剂及温度等技术因素对测定的 影响。 用自动生物化学分析仪进行酶学测定时，要合 理选择方法并进行参数的设置。在标本的采集、运 输与保存时要特别注意溶血、抗凝剂及温度等技术 因素对测定的影响。 酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单 位。临床上习惯用UL来表示体液中酶催化浓度。 酶测定的标准化工作可从使用推荐方法 和参考方法、使用公认的酶校正物或酶参考 物两方面人手。近来IFCC决定建立包括参考 测定方法、参考实验室网络和参考物等要素 在内的酶催化浓度测定的全球参比体系。 临床上还可利用酶的抗原性，通过免 疫化学方法直接进行酶浓度测定。与传统 的酶活性浓度测定法相比，这些免疫化学 法具有灵敏度高、特异性强等特点，能用 于一些不表现酶活性或无活性的酶测定， 而且特别适用于同工酶的测定。 同工酶是具有相同的催化功能，但其分子组成、 空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细 胞内定位不同的一类酶。亚型指基因在编码过程中， 由于翻译修饰差异所形成的多种形式的一类酶。往往 在基因编码产物从细胞内释人血浆时因肽酶的降解作 用而形成。 同工酶的分析大致可分为两步，即首先精确地分 离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶的总活性和各 同工酶组分的活性。常用方法有电泳法、色谱法、免 疫分析法、动力学分析法和蛋白酶水解法等。临床常 规中以电泳法最常用。 临床上以检测血清酶和同工酶应用最广，根据需 要也可测定其他各种体液(如尿液、胸腔积液、腹水、 脑脊液等)中的酶和同工酶或亚型。有时单凭某一酶的 活性变化，很难做出独立诊断。若同时测定一组性质 不同的酶，比较各酶活性的变化，就能根据酶增高或 减少的“谱型”做出诊断，此种同时检测一组酶，称 为酶谱。常用的如心肌酶谱、肌酶谱、肝酶谱、肿瘤 酶谱和胰酶谱等。 谢 谢！ hc61(#VQKFzupje83-$XRMHBwqlga50&ZTOJDysnic71(!VQKFAupje93-%XSMHCwrlgb50&ZUOJDytnid72(!WQLFAvpke94-%XSNHCxrmgb60*ZUPJEytoid72)!WRLGAvqkf94+%YSNICxrmhb61*#UPKEztojd82)$WRLGBvqlfa4+&YTNIDxsmhc61*#VPKFzuoje83)$XRMGBwqlfa5+&ZTOIDysnhc71(#VQKFzupje93-$XSMHBwrlga50&ZTOJDytnic72(!VQLFAupke93-%XSNHCwrmgb50*ZUOJEytnid72(!WQLGAvpkf94-%YSNHCxrmgb60*#UPJEztoid82)!WRLGAvqkfa4+%YTNICxsmhb61*#UPKEzuojd83)$WRMGBvqlfa4+&YTOIDxsnhc61(#VPKFzuoje83 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