紫外分光光度计的使用原理和方法.ppt

紫外分光光度计的使用原理和方法 紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法 在医学检验中的应用 紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 按所吸收光的波长区域不同，分为紫外 分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外- 可见分光光度法。 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性 分析、定量分析及结构分析, 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 紫外-可见分光光度法的特点： 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快; 2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度和准确度较高; 5 用途广泛。 1. 紫外-可见吸收光谱 1. 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性的，利用 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础。 通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线。如图3-1； 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长 max进行物质含量的测定。 2 2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱 与紫外与紫外- -可见吸收光谱有关的电子有三可见吸收光谱有关的电子有三 种，即形成单键的种，即形成单键的 电子、形成双键的电子、形成双键的 电电 子以及未参与成键的子以及未参与成键的n n电子。电子。 跃迁类型有：跃迁类型有： * * 、n n * * 、 * *、 、 n n * * 四种。四种。 2.1 2.1 有机化合物的电子跃迁有机化合物的电子跃迁 饱合有机化合物的电子跃迁类型为*， n* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区， 吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n*， * 跃迁，吸收峰一般大于200nm。 生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电 子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外 、可见光的原子团或结构系统定义为生色团 。见表3-1和3-2。 助色团：是指带有非键电子对的基团，如- OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等， 它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当 它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰 向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见 表3-4。 红移和紫移 在有机化合物中，常常因取代基的变更 或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长 max发生移动。向长波方向移动称为红移(表3- 3)，向短波方向移动称为紫移。 2.2 2.2 有有机化合物的吸收带机化合物的吸收带 吸收带吸收带( (absorption band): absorption band): 在紫外光谱中，吸在紫外光谱中，吸 收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分 子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型 。 (1)(1) R R吸收带吸收带 (2)(2) K K吸收带吸收带 (3)(3) B B吸收带吸收带 (4)(4) E E吸收带吸收带 3 3 无机化合物的紫外无机化合物的紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱 镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的 吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其 紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰， 这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影 响。 1. f电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨 道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰 强烈受配位环境的影响。 例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm 处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此 类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。 2. d电子跃迁吸收光谱 3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给 体，又是电子受体，当电子受辐射能激发 从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生 较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱 。如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应 。 1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系 。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同 ，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强 度等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影 响不大。 2. 溶剂 注意如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液 具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值 1.5 紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量 分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定 、结构分析。 1.定性分析 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。 3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物 的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化 合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定 价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说 明该物质无共轭结构和芳香结构。 2. 2. 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It，反射光强度为Ir，则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵 消，上式可简化为： I0= Ia+ It 一、吸光度和透光度 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=lgI0/It 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0 二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= cl 式中比例常数与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的 理论基础。 三、吸光系数 当l以cm，c以g/L为单位，称为吸光 系数，用 a表示。 A= a cl a的单位为L/(g.cm) 当l以cm，c以mol/L为单位，称为摩尔 吸光系数，用 表示。 的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度 为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光 度。 摩尔吸光系数 比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm 时的吸光度值，用 表示。 四、偏离朗伯-比耳定律的因素 （1）入射光为非单色光 （3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。 （2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸 馏水中的微生物，存在散射以及共振发射 等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 3. 紫外-可见分光光度计 一、主要部件的性能与作用 基本结构: 光源单色器吸收池检测器信号显示系统 样品 在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 1 光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 2 单色器 单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。 吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 3 吸收池 吸收池的种类很多，其光径可在 0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。 4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计 ，电位调节指零装置，以及自动记录和 数字显示装置等。 二、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。 1.单波长单光束分光光度计 目前国内广泛采用721型分光光度计 。具有结构简单、价格低廉、操作方便 、维修也比较容易，适用于常规分析。 单波长单光束分光光度计还有国产 751型、XG-125型、英国SP500型和伯 克曼DU-8型等。 2.单波长双光束分光光度计 单波长双光束分光光度计有国产710型 、730型、740型、日立UV-340型等就属于 这种类型。 3.双波长分光光度计 双波长分光光度计的优点：是可以在有 背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下 对某组分进行定量测定。 国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、 UV-265型等。 三、分光光度计的校正和检验 1.波长校正 2.吸光度校正 3.杂散光的检验 4.稳定性的检验 4 分析条件的选择 一、 仪器测量条件的选择 1.适宜的吸光度范围 由朗伯-比尔定律可知： A=lg1/T=cl 微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -ldc 或 0.4343T/T= -lc 代入朗伯-比尔定律有： c/c=0.4343T/TlgT 要使测定的相对误差c/c最小，求导取极 小得出： lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小 。 最适宜的测量范围为0.20.8之间。 通常是根据被测组分的吸收光谱，选择 最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当 最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸 收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测 定。 2.入射光波长的选择 3 狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度，应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。 一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半 宽度的十分之一。 对多种物质进行测定，常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。 二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择 这些显色反应，必须满足以下条件： 4.反应生成物的组成恒定。 3. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保 证测量过程中溶液的吸光度不变； 2反应有较高的选择性，即被测组分生成 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱 有明显的差别； 1反应的生成物必须在紫外-可见光区有较 强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大； 1酸度 显色反应最适宜的酸度范围可通过实 验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸 光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标， 溶液的PH值为横坐标作图。 3.显色时间和温度 2.显色剂的用量 测定试样溶液的吸光度，需先用参比 溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以 消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反 射和吸收带来的测定误差。 三、参比溶液的选择三、参比溶液的选择 参比溶液的选择视分析体系而定，具体有 ： 1溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸 收池等因素； 2试样参比 如果试样基体溶液在测定 波长有吸收，而显色剂不与试样基体显 色时，可按与显色反应相同的条件处理 试样，只是不加入显色剂。 3试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收，按显色反应相同的条件 ，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为 参比溶液。 4. 平行操作参比 用不含被测组分的试 样，在相同的条件下与被测试样同时进 行处理，由此得到平行操作参比溶液。 5 5 测定方法测定方法 一、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组分 ，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收 峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法、标准对比 法和吸收系数法。 1 校准曲线法 方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适