磁珠分选肿瘤干细胞操作规程.doc

肿瘤干细胞的分选工作0 l2 e% ?- i( n4 r9 v( 一、消化4 _- t% a) c7 m t) j4 _0 b（1）取出肿瘤组织，低温保存（离体组织冰上最多能保存多久仍可以用来分离cscs？）（2）pbs漂洗，尽可能去除血细胞; 9 b 6 g. w% b1 a（3）放在dmem/f12中尽量剪碎或剁碎组织3 w, z: g# - v$ 5 q+ r% p（4）用胶原酶和透明质酸酶37c 摇床中消化一小时（透明质酸酶是否必要？）5 w- h) - c4 l) l% r（5）慢速离心，去上清。dmem/f12混悬沉淀，% h5 s5 r+ r9 my+ i（6）过滤（请问40微米筛是否可以？）。+ b9 x, q! q; g0 g! （7）滤液用histopague-1077去除红细胞（据文献报道，请问是否有必要？）% l l# q1 u) 3 w; _（8）离心，沉淀用无血清cscs培养液混悬。接着进行分选（请问细胞养一天影响大不大？）( n8 o% b0 g- 二、分选（据文献看流行的做法是磁珠分选，再流式检测纯度）, t t# - 1 - v （1）负选：去除cd45标记的血干细胞及cd117、fap标记的间质细胞（请问各位大侠是否做这一步？）9 ) j( : v0 r: c( w （2）正选目的细胞1 y+ u( j. uf)5 v9 s6 s- e7 b( m5 x; j磁珠分选步骤g8 a# a7 ! r6 _试剂和设备：0 n3 y( x) i. d. c2 jbuffer：无ca，mg离子的pbs，ph 7.2, 含0.5%bsa，2mm edta, 是用automacs稀释液（美天旎货号130-091-222）稀释macs bsa储备液（130-091-376）制成，保持buffer冰冷（48），使用前脱气，避免气泡堵塞分选柱。+ 8 n5 7 o4 b一磁性标记2 z q% / iu1 m保持细胞冰冷，108或小于次数的细胞则使用下述体积试剂，磁性分选前获取较佳的单细胞悬液，可以将细胞通过40um尼龙筛，去除可能阻塞分选柱的细胞团块。高温和延长孵育时间会导致非特异性细胞标记。+ # k& a* g! w! p* p* w/ ) u1.细胞计数0 r9 w- o7 q3 |, n3 t- i9 k3 m4 e2 y, w2.300g离心细胞悬液，尽量去除上清, y; z9 s7 4 m: q- n3.用350 ul buffer重悬# w/ x+ _+ i q* o* n# o0 t# |4.加100 ul fcr 封闭试剂/ q& m6 g z: f) d; n5.加50 ul cd133/1(ac133)-biotin6 i) ( r4 e6 r% d5 h5 p6.充分混合后冷处孵育10分钟（48）% 2 h5 h: z9 b. w4 n7.加50ul pe连接cd133抗体（#130-090-853）遮光冰箱孵育5分钟( i: k; i2 k( t8.用10-20倍标记样体积的buffer洗细胞300g离心10分钟。充分洗,去上清。( n7 q4 t2 t1 f9.重复清洗细胞5 g# c! x6 f7 d6 % 8 y10.用400ul buffer 重悬细胞5 / ; e( w/ : 11.加100 ul抗生物素微珠. p# # & l8 y* f2 e12.充分混合冰箱孵育15分钟3 t- |* k) r* $ m( k13.用10-20倍体积buffer洗细胞并300g离心10分钟，充分吸去上清 c4 b7 # v: 14.用500ul buffer 重悬细胞 _2 s1 n5 r- , e15.继续磁性分选步骤5 c7 l9 m9 h8 k二磁性分选1 n: k h+ ! 4 q& q8 o1.安装分选柱+ z8 f$ a% b1 i3 ! j2.用500ul buffer冲洗分离柱# r) a o2 i# o& d; o3.细胞悬液上柱6 u. g! m, l0 b k, s4.收集过柱的未标记细胞，用适量buffer洗柱子，洗三次，每次等柱内buffer流干再加，ms柱：3500ul， 收集总流出液。这部分就是未标记细胞组分; s2 n. ) y% q$ d- s9 _ l* u5.将ms柱从分离器上取下，放在新收集管上. |+ 5 r/ u9 r8 n/ ?6.加1ml buffer 到分离柱中，立即用活塞坚定地吹洗出磁性标记的细胞& q! q8 _* # k/ c2 0 c, c7.要想进一步纯化cd133细胞，洗出的细胞可再次上柱，即用新分离柱重复16步骤注意：所有过程在超净台和冰上进行以保证细胞活力: s1 _, r5 q7 r. t/ f; t1用冰预冷的macs buffer 重悬108胶质母细胞瘤细胞7 c, m0 ) x2用冰预冷的macs buffer 洗几次: ) y/ q q: g/ h34下在90ul 冰预冷的macs buffer中用pe连接的cd133抗体10ul 与5105细胞结合30分钟（抗体浓度需要被调整） 2 ?9 k h- e4用macs buffer洗几次细胞! r# o b& q4 o* x0 l6 ? n5 4用微珠连接的抗pe的抗体处理细胞30分钟（20ul微珠连接pe抗体/5105在80ul冷macs buffer中）7 p9 c j1 s/ n0 q i1 s 9 r6用冷macs buffer洗几次细胞1 q2 n- q |u; . s l7用500ul 冷macs buffer重悬抗体黏附的胶质母细胞瘤细胞 u4 -8附图，准备ms柱2 c! a( f$ z; n( 9细胞悬液上柱. m% w n( z c7 p10收集过柱的未标记细胞，用500ul 冷macs buffer 洗ms柱三次，每次当柱内积液干时加buffer，收集总流出液为未标记细胞部分2 v7 ?; t, a6 c1 u+ i%