梅毒实验室诊断ppt课件

梅毒实验室诊断技术 梅毒梅毒 淋病淋病 软下疳软下疳 性病性淋巴肉芽肿性病性淋巴肉芽肿 非淋菌性尿道炎非淋菌性尿道炎 生殖器疱疹生殖器疱疹 尖锐湿疣尖锐湿疣 HIV/AIDSHIV/AIDS 梅毒梅毒 淋病淋病 软下疳软下疳 性病性淋巴肉芽肿性病性淋巴肉芽肿 50-6050-60年代年代 经典性病经典性病 80-9080-90年代年代 监测性病监测性病 目目 前前 传染法报告病例传染法报告病例 监测性病监测性病 梅毒梅毒 淋病淋病 沙眼衣原体感染沙眼衣原体感染 生殖器疱疹生殖器疱疹 尖锐湿疣尖锐湿疣 我国主要流行的性传播疾病（性病 ） 沙眼衣原体沙眼衣原体: 30%: 30%50%50% 生殖支原体生殖支原体: 10%: 10%40%40% 其它其它: 20%: 20%30%30% 梅毒梅毒 淋病淋病 HIV/AIDSHIV/AIDS 1991-2012年我国梅毒 报告发病趋势 淋病 全部梅毒 发病率： 1/10万 一期与 二期梅 毒 2012年与2011年相比： 全部梅毒增长：4.41% 一期与二期梅毒：0.33% 2012年 梅毒：44.862万例 1995-2012 梅毒分期/分类 报告发病率 隐性梅毒 一期梅毒 二期梅毒 发病率 ： 1/10 万 三期梅毒 2012年与2011年相比： 全部梅毒增长：4.41% 一期梅毒：0.44% 二期梅毒：1.63% 三期梅毒：9.49% 隐性梅毒：8.11% 胎传梅毒：6.15% 2012年梅毒发病地区分布 梅毒螺旋体的特征 小而纤细的螺旋状微生物,螺 旋整齐，数目固定 长520m，粗细0.2m,折 光性强，较其他螺旋体亮 有6-12个规则的螺旋 基本结构为一原生质的圆柱体 ，为两层膜所围绕，有鞭毛 运动缓慢而有规律，有三种运 动方式 围绕其长轴旋转运动 伸缩其螺旋间距离移动 弯曲扭动如蛇行 梅毒螺旋体的特征 属于密螺旋体属苍白螺旋体的苍白亚种 最适生存温度是37，离开人体很快 死亡 煮沸、干燥、肥皂水以及一般的消毒剂 如双氧水、酒精等很容易将其杀灭 人是梅毒螺旋体的唯一自然宿主 梅毒螺旋体不能在无活细胞的培养基中 生长繁殖 先天性梅毒新生儿 及脐带切片DFA图像 获得性梅毒分期 梅毒螺旋体 破损的皮肤及粘膜 24周潜伏期 局部大量繁殖 硬下疳（传染性极强） 经12月 自行消失 附近淋巴结 血液播散 全身组织和器官 二期梅毒 三期梅毒 心血管、神经等损害 梅毒的实验室诊断 病原学检测 血清学检测 常用的梅毒检测方法 病原学检查病原学检查 原理：一期、二期梅毒时，取原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳硬下疳 、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织 液液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在或淋巴结穿刺术得到的组织液，在 暗视野显微镜下，暗视野显微镜下，光线从聚光器的边光线从聚光器的边 缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出 亮光，从而可根据其特殊形态和运动亮光，从而可根据其特殊形态和运动 方式进行检测。方式进行检测。 方法：病原学检查的主要方法有暗视方法：病原学检查的主要方法有暗视 显微镜检查、镀银染色法和直接荧光显微镜检查、镀银染色法和直接荧光 法。法。 其它病原学检查其它病原学检查 核酸检测：先天梅毒、潜伏梅毒、神经梅 毒、早期梅毒、艾滋病合并梅毒感染者。 损伤部位的分泌物、血清、脑脊液、羊水和 组织等标本均可用于PCR检测梅毒螺旋体 。 体外培养：利用家兔对梅毒螺旋体的易感 性，把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾 丸内，观察有无感染亦象。RIT是经典的梅 毒诊断方法，由于其费用高、检查时间长等 弊病目前仅用于科学研究 。 病原学检查的临床意义病原学检查的临床意义 1.病原学方法直接镜检到梅毒螺 旋体，在临床可确诊梅毒，且具 有快速、方便、易操作的特点。 2.螺旋体检查是诊断早期现症梅毒 的最佳方法，对于患者的早期诊 断、及时治疗、预后和尽早切断 传染源都有十分重要的意义。 3.如未见到梅毒螺旋体，并不能排 除患梅毒的可能性。 梅毒感染后的血清学反应 抗心磷脂抗体：梅毒螺旋体感染人体， 在34周产生抗类脂抗原的抗体（反应 素）。这些抗体主要是IgG和IgM型混合 抗体。这种抗体仅能供梅毒血清学诊断 ，本身无保护作用。 未经治疗的患者，其血清内的反应素可 长期存在。经适当治疗后，抗体可以逐 渐减少至转为阴性，因此可用于疗效观 察及判愈。 感染梅毒后首先产生TP IgM抗体，感染后2周 即可检出，并且只要有活的梅毒螺旋体存在， 不断予以抗原刺激，其TP IgM将会维持在一定 的水平。 经治疗TP IgM抗体阴转在一期梅毒为3个月， 二期梅毒为9个月， 潜伏梅毒为2年。 TP IgM 的消失，提示体内没有活的梅毒螺旋 体存在，可以推断已经丧失传染性，可以继续 随访或判愈。再感染时又出现阳性，因此IgM 抗体的存在是活动性梅毒的表现。 梅毒感染后的血清学反应 梅毒感染后的血清学反应 感染梅毒4周左右产生 TP IgG抗体， 即使经过足量的抗梅毒治疗，梅毒螺 旋体抗原消失后很长时间，IgG抗体仍 可以通过记忆细胞的作用继续产生， 甚至终身在血清中可测出。 梅毒感染后的血清学反应 胎儿在宫内感染梅毒螺旋体后，胚胎 晚期（69个月）已能合成IgM抗体 ，出生后第3个月开始形成IgG抗体。 母亲IgM抗体不能通过胎盘，而IgG抗 体能通过，如在患儿血清中测出 TP IgM，是诊断先天梅毒的有力证。 梅毒螺旋体IgM抗体小结 梅毒最早产生IgM抗体早期梅毒、 再感染 IgM不能通过胎盘屏障、血脑屏障 新生儿血测到IgM抗体 先天感染 脑脊液测到IgM抗体 活动性神经梅 毒 梅毒血清学试验 非梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验 非梅毒螺旋体抗原血清试验 分为四种试验： 1、性病研究实验室玻片试验（VDRL) ：试剂需现配 现用，且要在显微镜下观察结果，故国内实验室很少采 用。但VDRL是诊断神经性梅毒最特异的血清学方法 2、不加热血清反应素试验（USR)：试剂无需现配现 用，但仍要在显微镜下观察结果，现已很少使用 3、快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)：在特制的纸 片上进行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗体出现 凝集，用肉眼可观察结果 4、甲苯胺红不加热试验（TRUST)：在试剂中以红色 的甲苯胺红颗粒代替黑色的炭粉颗粒，使结果更易于观 察 性病研究实验室玻片试验（ VDRL试验） 0.03%心磷脂 、0.21%卵磷脂和 0.90%胆 固醇组成 该抗原需新鲜配制不能保存 待检血清需灭活 主要用于脑脊液检查 排除血液污染的情况下可诊断神经梅毒 神经性梅毒的脑脊液细胞计数和蛋白水平通 常升高。 非梅毒螺旋体抗原血清试验 所有的非梅毒螺旋体血清试验的抗 原基本成分都一样,其基本成分是 心磷脂：与反应素结合 卵磷脂：加强心磷脂的抗原性 胆固醇：增强抗原的敏感性 抗原抗体结合形成复合物凝集成网 状沉淀。 VDRL结果 阴性 弱阳性 强阳性 不加热血清反应素试验（USR试验） 是VDRL试验的改良 抗原是心磷脂、卵磷脂和胆固醇 还有乙二胺四醋酸(EDTA)，使抗 不会变质可长期保存能维持一年 含有氯化胆碱，对血清能起到化学 灭活的作用不必加热灭活 制成试剂盒，但仍然要在显微镜下 观察结果 快速血浆反应素环状卡片试 验（RPR试验） 在USR试剂成分的基础上加入黑 色碳颗粒作为沉淀的指示物 用白色的硬纸片替代玻片 血清不需要灭活 不需要显微镜观测结果 可作定量试验 有现成的试剂盒，携带方便 操作简单,价格便宜 试验的结果可长期保存 甲苯胺红试验(TRUST) 其原理和成分与RPR试验相同 用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒 其余的特点均与RPR相同 RPR结果 TRUST结果 非梅毒螺旋体抗原血清试验 的缺陷及优点 缺点：1、特异性：在多种疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性 疾病、结缔组织病、肿瘤、静脉吸毒者、老年人以及怀孕妇女中均 可出现反应素，所以此类试验有时会出现假阳性反应 2、敏感性：感染梅毒后反应素的出现时间晚于特异性梅毒螺旋体 抗体，因此非梅毒螺旋体抗原血清试验对一期梅毒的漏检率较高。 RPR或TRUST有时出现弱阳性或阴性结果，而临床上又像二期梅毒 ，此时应将此血清稀释后做定量试验，如出现阳性结果，则为抗体 过量引起的“钩状效应”，12的二期梅毒病人可出现此现象而发生 假阴性反应。此外，晚期梅毒反应素转阴率高，再加上这类试验对 隐性梅毒也不太敏感，因此用此类试验进行梅毒筛查时，存在着相 当数量的漏检 优点： 1、非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性的患者往往是梅毒现 症感染者，临床上即可开展治疗 2、非梅毒螺旋体抗原血清试验表现为滴度随成功的治疗而逐渐下 降，故可以作为疗效观察的指标 3、此类方法价格低廉 临床意义 可用于疗效观察、判定复发及再感染 适用于普查、婚检、产前检查及其它 健康体检筛查与普查 鉴别先天性梅毒与反应素血症（由生 母的反应素通过胎盘至胎儿血中）如 无感染，生后34月内可自动转阴。 如不减反升可诊断先天梅毒 测定非梅毒螺旋体抗原血清 试验的滴度进行疗效观察 1、治疗成功：早期梅毒患者在治疗后6个月内症状消失 且非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降。晚 期梅毒或隐性梅毒患者在治疗后1224个月内非梅毒螺 旋体抗原血清试验滴度有至少4倍的下降 2、治疗失败：治疗后症状持续或重新出现；治疗后非 梅毒螺旋体抗原血清试验滴度反而上升了4倍或以上；非 梅毒螺旋体抗原血清试验初始滴度较高（1:32或以上） 但在六个月内没有达到4倍的下降。抗梅毒治疗失败的病 人应考虑合并HIV感染及神经梅毒的可能性 3、血清固定：经正规治疗后，梅毒患者非梅毒螺旋体 抗原血清试验一般都会转为阴性，但有13%的病人即使 经足量抗梅治疗，非梅毒螺旋体抗原血清试验滴度仍持 续呈低滴度阳性，这种现象称为血清固定，血清固定患 者的滴度重又上升则提示再次感染梅毒 血清固定的原因 1、早期梅毒治疗量不足、治疗不规则 2、梅毒的病期、类型、开始治疗的梅毒的病期、类型 、开始治疗的时间早晚。 3、曾有过复发或再感染，体内仍有潜在的病灶存在潜 在的病灶存在 4、合并有其他疾病 5、机体内细胞免疫受到抑制 梅毒螺旋体抗原血清试验 1、原理：用梅毒螺旋体特异蛋为抗原，检测梅毒患者血中特异 性抗梅毒螺旋体抗原的抗体 2、方法： 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA） 化学发光试验（CLIA） 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (TP-RT) 荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）等 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 原理： 用超声裂解的梅毒螺旋体为抗原，致敏经醛化、 鞣化的羊或禽类红细胞，此致敏红细胞与人血清或血浆中 的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可观察的凝集反应 优点：该方法比FTA-ABS易操作且稳定性好，它的敏感 性除早期梅毒外与FTA-ABS相似，对大样本进行批量检 测时，TPHA也比FTA-ABS易操作，是国内实验室常用的 梅毒螺旋体确证试验方法 不足：由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝 集，且保存时间较短，批间差较大,故实际使用中也存在 一些问题。目前国内使用的商品化 TPHA 试剂盒均未通过 国家的批批检。 TPPA 原理： TPPA的原理与TPHA基本相同，它以人工合成的 惰性明胶颗粒代替TPHA试验的红细胞作为载体 ，是TPHA的升级产品。 优点： 1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读更为清晰明确 3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高 4、通过了国家的批批检 不足：结果判定主观，较难实现自动化 TPPA定性试验 加 TPPA结果 TPPA临床意义 敏感性和特异性高，是梅毒的确证 试验。对未经治疗的梅毒的敏感性： 一期76，二期100，潜伏97， 晚期94。特异性99 。 一般不会阴转，因此不作为疗效观 察指标。但部分早期梅毒经有效治 疗可阴转 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验 原理：用经纯化及超声裂解处理的梅 毒螺旋体为抗原，或重组抗原包被固 相，检测特异性梅毒螺旋体抗体 敏感性可达95%98%，临床应用前应 参考试剂评价结果及与TPPA对照 双抗原夹心法 梅毒螺旋体胶体金试验 在试纸条上包被螺旋 体特异性抗原成份， 利用免疫渗滤技术， 将试纸条插入待测血 清，观察血清与特定 抗原成份的反应 可在10分钟之内得 到结果，快速、方便 是特异性螺旋体实验 荧光密螺旋体抗体吸收试验 （FTA-ABS) 原理是将有完整形态的梅毒螺旋体 作为抗原，加上经吸收剂吸收过的梅 毒患者血清形成抗原抗体复合物，再 加入荧光素（FTIC）标记的羊抗人丙 球蛋白抗体，与抗梅毒螺旋体抗体结 合，形成荧光的抗原抗体复合物。在 荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色 的荧光，即为阳性反应。 FTA-ABS IgG抗体 及IgM阳性（400） 梅毒螺旋体免疫印迹试验 通过电泳转移硝酸 纤维膜抗原条上含 有梅毒螺旋体的各 种成分来确认是否 感染梅毒。 观察15.5KD、 17KD和45KD区带 阳性：15.5KD、 17KD和45KD显色 阴性：15.5KD、 17KD和45KD均不 显色 可疑：15.5KD、 17KD和45KD有一 个或两个条带出现 梅毒螺旋体免疫印迹试验 梅毒血清学试验的敏感性和 特异性 如何选择梅毒诊断试剂？ 2012年非梅毒螺旋体抗原血清学试验用试剂评估结果 试剂简称 敏感性(%) 特异性(%) 功效率(%) Kappa值 科华RPR 96.6 96.3 94.4 0.914 英科TRUST 96.6 95.9 96.1 0.907 金豪TRUST 95.5 92.6 93.5 0.848 荣盛TRUST 91.0 98.6 96.4 0.911 万泰TRUST 71.9 100.0 91.8 0.784 (2012(2012年评估结果：梅毒螺旋体抗原血清学试年评估结果：梅毒螺旋体抗原血清学试 验验) ) 方法 试剂简称 敏感性(%) 特异性(%) 功效率(%) Kappa值 化学发光法 科美发光 96.4 100.0 98.7 0.971 酶免法 万泰ELISA 96.4 100.0 98.3 0.971 现代ELISA 96.4 100.0 98.3 0.971 英科ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 丽珠ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 科卫ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 金豪ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 华大ELISA 95.5 99.0 97.7 0.950 三维 ELISA 94.6 100.0 98.0 0.957 科华ELISA 94.6 100.0 98.0 0.957 免疫层析法 艾博RT 95.5 98.4 97.4 0.943 万泰RT 94.6 99.5 97.7 0.950 日本Determine 93.8 99.0 97.0 0.934 万孚RT 92.9 100.0 97.4 0.942 蓝十字RT 92.9 100.0 97.4 0.943 英科 RT 92.9 99.0 96.7 0.928 伊士RT 92.0 100.0 97.0 0.935 梅毒血清学试验的临床诊断意义 血清学试验 意 义 USR TPPA RPR TPHA VDRL 排除梅毒、一期梅毒的早期/极晚期梅毒、艾滋病患者合并梅毒 现症梅毒(梅毒孕妇所生婴儿除外)或治愈的晚期梅毒 生物学假阳性 早期梅毒治疗后或极早期梅毒、以往感染过梅毒、部分晚期梅毒 梅毒血清学试验生物学 假阳性的常见原因 先天性梅毒的诊断 先天性梅毒的诊断要结合临床表现、物理检查、影像检查、血清学检查 和直接显微镜检查进行综合判断 先天性梅毒的临床症状主要包括鼻音、肝脾肿大、皮损、骨软骨炎等， 50%的梅毒患儿出生时无异常表现，多数在3周至6个月时出现上述症 状中的一项或几项。可能更晚出现（2年以后出现）的其它特征有畸型 、耳聋、失明、弱智等 由于母体的螺旋体直接进入胎儿的血循环，因此先天性梅毒均直接表现 为二期梅毒 从脐带、胎盘、新生儿皮损处采样，在显微镜下直接检查到梅毒螺旋体 可确诊断