鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物肝微粒体致突变性实验课件

毒理学基础实验课 鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验 Ames test 毒理学基础实验课 原 理 鼠伤寒沙门氏菌 野生型（原养型） 人工方法正向诱变 鼠伤寒沙门氏菌 组氨酸缺陷型（异养型 ） 诱变物作用回复突变 Ames是检测遗传毒理学的体 外试验，检测终点是基因突变 通过统计回复突变的菌落数 判断受试物质的致突变性高低 毒理学基础实验课 S-9混合液的制备过程（使需要代谢激活的物质得以活化 ） 2 2 5 5 3 3 4 4 1 1 暴露肝脏，KCL灌注 断头处死大鼠、放血、去皮 取出肝脏，加入KCL剪碎 制成匀浆，9000g离心 取上清、分装、冻存 毒理学基础实验课 1 实验实验 用菌液制备备 平板菌落计计数法，是种统计统计 物品含菌数的有效方法。方法如下：将 待测样测样 品经经适当稀释释之后，其中的微生物充分分散成单单个细细胞，取 一定量的稀释样释样 液涂布到平板上，经过经过 培养，由每个单细单细 胞生长长繁 殖而形成肉眼可见见的菌落，即一个单单菌落应应代表原样样品中的一个单单 细细胞；统计统计 菌落数，根据其稀释释倍数和取样样接种量即可换换算出样样品 中的含菌数。 2 菌株性状鉴鉴定 （1）组组氨酸营营养缺陷型 （2）深粗糙突变测变测 定 （3）R因子的鉴鉴定 （4） 切除修复缺失鉴鉴定 （5）自发发回变变量测测定 （6）回变变特性鉴鉴定 实验实验 步骤骤与方法 毒理学基础实验课 深粗糙（rfa）特性2 紫外线敏感（UvrB）特性3 抗氨苄青霉素（R因子）特性4 回变特性鉴定6 组氨酸需求特性1 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 自发回变特性5 毒理学基础实验课 1、组氨酸需求特性 有细菌生长 空白 空白 组氨酸-生物素 赖氨酸 空白 37 24h 0.1ml菌液 顶层 底层 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 2、深粗糙（rfa）特性 0.1ml菌液 顶层普通培养基 抑菌环 滤纸片（有结晶紫） 3724h 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 3、紫外线敏感特性 普通培养基 15W紫外灯 33cm，8s 37，24h 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 4、抗氨卞青霉素（R因子）特性 37，24h 青霉素 普通培养基 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 5、自然回变特性 0.1ml菌液 顶层 底层 37，24h 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 菌株 基因型 组氨 酸缺 陷 脂多糖 屏蔽缺 失 抗氨 卞西 林 抗四 环素 uvrB 修 复缺 陷 自发回变 （-S9） TA97+-+90-180 TA98+-+30-50 TA100+-+120-200 TA102+-+240-320 AmesAmes试验菌株特性试验菌株特性 毒理学基础实验课 6、回变特性鉴定 0.1ml菌液 0.1ml致突变物 0.2-0.5mlS-9 顶层 底层 37，24h 菌株特性鉴定菌株特性鉴定 毒理学基础实验课 实验设计原则 受试物最低剂量为每皿0.1g 一般选用45个剂量 每个剂量应做2或3个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿5mg Ames试验设计 毒理学基础实验课 点试法点试法 将顶层培养基倒入底层培养基中，凝 固后放入滤纸片，将受试物点在纸片 上放入底层，37培养48h观察结果 掺入法掺入法 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入 顶层培养基中，倒入底层培养基中， 凝固后37培养48h观察结果 Ames试验方法及结果评价 点样纸片周围长出一 圈密集的His+回变菌 落者，受试物即为阳 性致突变物质。 背景菌生长良好受试物 每皿回变菌落数增加一 倍以上并有剂量-反应 关系，试验结果具有重 现性即可认为该受试物 为诱变阳性。 毒理学基础实验课 结结果与报报告 1 实验结 果判断与评价 （1）点试法 凡在点样纸片周围长出一圈密集的his回变菌落者， 该物质具有致突变性，即为阳性；如只出现少数散在菌 落，则为阴性。 （2） 掺入法 突变率=诱发回变his菌落数/自发回变his菌落数 确认待测物具有致突变作用，必须具有以下几点： 诱发