医学ppt课件初期止血的研究进展

阮长耿 江苏省血液研究所 苏州大学附属第一人民医院 初期止血的研究进展 正常止血机制 正常生理性止血是由血管、血小板及血浆凝血因子 等共同参与的一个复杂、连续的过程 。 初期止血 血管内皮细胞损伤，内皮下组织成分暴露（主要为 胶原），血小板发生黏附、聚集和释放反应，形成血 小板血栓。 二期止血 是凝血、抗凝和纤溶诸系统相互协调、有序完成的 过程，血浆中一系列凝血因子经级联酶促反应依次被 活化,最终形成纤维蛋白凝块。 初期止血机制 TXA2 ADP 纤维蛋白原 凝血酶 PF4 -TG PDGF 纤维蛋白 PGI2 聚集 白色血栓 释放 粘附 v WF EC SE 血小板在初期止血过程中的重要性 在生理状态下，血小板与暴露的血管内皮下基质发生 血小板粘附； 血小板聚集； 释放反应（TXA2,ADP等）； 促凝活性表达（PS暴露，凝血因子释放）； 血小板收缩。 血小板膜糖蛋白、血小板内在结构、血浆vWF和纤维 蛋白原功能的正常发挥是完成初期止血过程所必需的。 任何因素发生数量和/或质量异常将会导致初期止血障 碍性出血性疾病，如血小板无力症、Bernard-Soulier 综合征、血管性血友病等。 血小板膜糖蛋白与血小板的止血功能 活化 聚集 粘附 （Fn：纤维结合蛋白，Coll：胶原，Ec：内皮细胞） Adhension: platelet-VWF-subendothelial Axis Immunoinhibitory probes using GPIb MoAb AN 51 suggest that GPIb on the platelet membrance is the vWF receptor. (Ruan et al: Brit. J. Haematal,1981) SZ 1 GPIX 中国科学1986, Blood 1987 SZ 2 GPIb 中国科学1986, Blood 1987 SZ 21 GPIIIa Thromb. Hemostas. 1987 中华内科杂志 1987 SZ 22 GPIIb Thromb. Hemostas. 1987 中华血液杂志 1987 SZ 51 GMP140 ( P-Selectin ) Nouv. Rev. Fr. Hematol.1990 血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性 l在生理性止血及动脉血栓形成过程中，血小板粘附到暴露的血管内皮 下基质并发生血小板活化是血栓形成的起始阶段，进而产生血小板聚 集和释放反应，最终导致血小板血栓形成。 l现状：参与黏附的相关分子的结构、信号传导以及这些分子 缺陷所 引起的临床疾病和症状； l进展：vWF-A1/GPIb, vWF-A2/ADAMTS13, vWF-A3-胶原 l抗血栓药物：抗GPIb/IX/VvWF胶原轴； 抗GP/21胶原轴制剂； A1 A2 A3 Exposed collagen platelet GPIb-IX-V 21GPVI-Fc 血小板胶原受体 vWF 1, GPIb-IX-V结构 Canobbio I et al. Cellular Signalling 2004;16:132913440 Structure and Function of VWF 3, vWF结构与功能 胶原结合位点 4, GPIa-IIa结构与功能 21 2, GPVI结构 三、血小板黏附过程 血小板与胶原粘附是生理止血和血栓形成的起始阶段 。 目前认为血小板与胶原相互作用方式是： 在高剪切力条件下血小板初期不稳定粘附依赖 GPIb/IX/V复合物和GP的协同作用； 黏附后的血小板活化由GP介导； 血小板牢固粘附则依赖GPIa/IIa和GPIIb/IIIa 的共同作用。 活化的血小板释放ADP、 TXA2，进一步加强 血小板粘附和聚集。 血小板粘附、聚集过程模式图 血流方向 由此可见，血小板粘附功能的发挥依赖血小板膜 糖蛋白GPIb-IX-V、GPVI 、GPIa-IIa 、GPIIb-IIIa 、vWF的结构与功能的正常。 静息血小板血小板伪足形成血小板伸展 血小板黏附功能的实验室检查 1，血小板黏附试验（玻璃珠柱法） 原理： 当血流以一定速率流经玻珠后，血小板黏附于玻珠和 塑料管表面，所形成的血小板聚集体滞留在柱内，使过柱 后血液中血小板数降低，计数过柱前后血液血小板数，计 算血小板黏附率： 正常参考值：62.58.6 血小板黏附率减低见于： 血管性血友病； Bernard-Soulier综合征； 尿毒症； 使用抗血小板药物 等 该方法由于操作繁琐，影响因素多，不能模拟体内状况， 现已较少采用。 2，血小板功能分析仪 PFA-100 PFA-100 工作原理 PFA-100 Test Cartridge Injured Blood Vessel Collagen Agonist Flow 剪切率：50006000s-1 孔隙直径:150um The PFA-100 System Simulates In Vivo Conditions Platelet Plug Pipette 800 L of citrated whole blood into the sample reservoir of the test cartridge(s). Place the cassette onto the carousel of the analyzer. Using the integrated keypad, initiate the test run. PFA-100 测定步骤 PFA-100 测定结果分析 Occlusion of the Aperture PFA-100 REV. 2.00 S/N: 00370 14/07/97 14:01 ID#: 23456.17 Test Type: Collagen/EPI SAMPLE A: 110 SEC “Closure Time” 正常值范围： 胶原/ADP膜： 57120秒 胶原/肾上腺素膜：75160秒 PFA-100 测定结果异常的常见原因 Abnormal Parameters Thrombocytopenia Anemia Extra-Corporeal Circulation Plasma Protein Disorder von Willebrand Disease Platelet Disorder Aspirin GP IIb/IIIa antagonists Underlying Disease Ticlid/Plavix Storage Pool Disease Primary Secretion Defect PFA-100测定敏感性 Platelet Dysfunction COL/EPI Test Cartridge Overall SensitivityOverall Sensitivity 91%92% Cases Sensitivity （ % ） 95 ASAGTBSSPSDHPSSPD1001004491 7 5 von Willebrand Disease 2A12B2M3 Acq.Pseudo. 33174361231 84 1008992100100100100 Based on a review of 15 publications by Favaloro in 2001 and Mammen, 1998 PFA-100测定与出血时间比较 Francis, 1999 * 20/23 had abnormal platelet aggregation PFA-100优缺点 模拟体内止血过程，反映高剪切力下的血小板功能； 结果的异常与血小板功能缺陷的严重程度有良好的相关性； 所需血量少，测定时间快（3-5分钟）； 对各型vWD均较敏感； 对血小板数量和功能变化、Hct异常较敏感； 对凝血因子缺陷不敏感； 可代替出血时间测定作为筛选试验； 监测抗血小板药物治疗效果。 其敏感性和特异性有待进一步提高； 对部分SPD及阿司匹林抵抗者有假阴性；对轻型血小板功能障碍 者 假阴性为6%；尚不能作为完美的血小板疾病筛选试验。 J Thromb Haemost 2006;4:312-319 3，平行板灌注小室 (Flow Chamber) 工作原理 包被：胶原； vWF 内皮细胞； 其他细胞或介质。 灌注：抗凝全血按设定的剪切率条件通过小室，血小板 与胶原等表面发生黏附并形成血小板凝块，模拟 体内止血过程。 分析：采用相差显微镜或染色方法测定血小板凝块表面 积比例，或采用共聚焦显微镜测定血小板凝块体 积比例。 优点： 模拟体内血流状况和剪切率条件，更加接近生理条件； 对多种实验参数可以精确调节； 试验用血量少，1-2毫升； 在基础研究和药物研发方面已得到广泛应用。 缺点： 装置较复杂，需一定的仪器设备； 尚未在临床检测方面广泛开展。 血小板黏附功能异常相关疾病 一、血管性血友病(vWD) vWD是血浆中von Willebrand factor(vWF)质或量异常而 致的一种最常见的遗传性出血性疾病。 资料表明血浆vWF水平降低见于1-2正常人群，有出血表 现者约310/10万，我国尚无本病确切流行病学资料。 vWF由内皮细胞和巨核细胞合成，基因定位于12p12ter，包 括52个外显子和51个内含子，成熟单体分子由2050个氨基酸残 基组成，含有多个结构功能域。血浆中vWF以多聚体形式存在 ，其多聚化程度对维持其生物学活性具有重要意义。 vWF生理功能： 1，介导血小板与胶原的黏附，参与初期止血过程。 2，作为因子VIII的载体。 各型vWD构成比 Literature Suzhou report (1992-1995) (1995-1999) Type 1 most common 41.2% 61.5 % 75-80% of all cases Type2 15-20% 38.8% 28.6% Type3 20 min ，APTT 44.7s， PT 11.7s，TT15.2s PAgT: ADP（2um) 53.4%, 53.2%, 59.8% Risto (1.25mg/L) 12.7%, 10.1%, 15.3% (2.5mg/L) 48.3%, 51.6%, 53.9% VWF:Ag 21.7% 血浆VWF 多聚物分布正常 VWD 1型病例介绍 D1D2 D D3 A1 A2 A3 D4 B1- C1 C2 CK VWD 2型的突变谱 Type 2B Increased GPIb Binding Proteolysis Type 2A AssemblyTransport Type 2M Decreased GPIb Binding Reduced binding to collagen Type 2N Decreased FVIII Binding U. of Sheffield (Ian Peake) http:/www.shef.ac.uk/vwf/mutations.html 2A型vWD患者血浆中大、中分子量的多聚体消失，目前对其机 制也有了进一步认识： 一小部分2A型vWD是由于vWFA2区的基因突变导致vWF的结 构发生显著改变，使得vWF在细胞内质网中停留； 大部分2A型vWD的vWFA2区的基因突变并不导致vWF的结构 发生明显改变，而是通过以下两种机制使得vWF对ADAMTS13敏 感性增加：一是vWFA2区的基因突变暴露了ADAMTS13的酶切位 点；另一是ADAMTS13对vWFA2区的结合力增强； vWD2A 型 血浆VWF多聚体分析 非连续缓冲体系的琼脂糖电泳。非连续缓冲体系的琼脂糖电泳。1.5%1.5%的分离的分离 胶，胶，0.8%0.8%的浓缩胶的浓缩胶 10% 10%的乙酸，的乙酸，25%25%的异丙醇固定的异丙醇固定 漂洗漂洗 I I 125125 - - MoAb SZ-29MoAb SZ-29（1,110,000Cpm)1,110,000Cpm)温育温育 漂洗漂洗 干胶，放射自显影干胶，放射自显影 血浆VWF多聚体分析 N 2B 2A 特点：缺乏大分子多聚物；RIPA增高； 举例：vWF-A1 区Arg543/Gln改变使得vWF 与GPIba的亲和力增强； VWD2B 型 VWD2B 型病例介绍 vWF:RCo（4.9）和vWF:Ag（11.7）均降低 RIPA在低浓度Ristocetin时有反应 多聚体分析显示中高分子量缺如，符合2B型 vWD 测序发现，vWF基因存在4232CT, R1308C杂合性突变 中、高分中、高分 子量缺如子量缺如 Type 2N VWD (VWD Normandy) Mutations in FVIII binding domain of VWF - Decreased or absent FVIII binding activity - Normal adhesive function Heterozygotes - disproportionately low FVIII - co- inheritance with type 1 -? Increased severity Homozygotes - FVIII 5-25% ( ? Rare severe mutation) - mimics mild/ moderate hemophilia A, but autosomal recessive - poor response to FVIII concentrates PATIENT W. (asian origin) Bleeding time Normal Ristocetin aggregation Normal vWF :Ag 49U/dl FVIII:C 12U/dl vWF multimers Normal Binding of FVIII to Nil plasmatic vWF Conclusion: type 2N von Willebrand disease G / E G / E G / E G / E G / EG / GG / G G / GG / GG / G FAMILY Y W. STUDY ( Digesion of DNA by Sac l ) Family members with the mutation Gly(G)22Glu (E) at heterozygous state: 1-2 II-1 II-3 (propositus) II-7 III-5 Hemostatic studies in the 2N vWD pedigree VWFAg FVIII：CAg FVIII：C I2 69 56.05 70 II1 53 51.08 60 II3 43 5.51 12 II6 69 68.01 70 II8 57 2.5 / III3 35 55.28 50 III4 36 64.02 80 III5 83.35 68.01 / vWF:FVIII Binding Type 3 von Willebrand disease vSevere Bleeding Disorder vAutosomal Recessive Inheritance vMarkedly Decreaseed or Undetectable vWF:Ag, vWF Activity and FVIII:C vvWF Gene Deletion, Nonsense , Missense and Frameshift Mutation Throughout Gene Clinical Manifestation of the Patient of Type 3 vWD (Ser71stop code) Name LiFeng Sex Male Age 16-years old Symptom Severe epistaxis Bleeding after tooth extraction Easy bruising and hematomas Joint bleeding His father and mother is cousin Bleeding time 15 min vWF:Ag 5U/dl FVIII:C 4U/dl FVIII:Ag 2.8 % vWF:Rco(U/L) 50 Plasma multimer is absent Laboratory Diagnosis of the Patient of Type 3 vWD (Ser71stop code) DDAVP（1-去氨基-8右旋精氨酸加压素）商品名:弥 凝 : inducing secretion of autologous factor VIII and von Willebrand factor into plasma 替代治疗 Plasma concentrates: 可选用鲜 血，新鲜冷冻血浆，冷沉淀或FVIII浓缩物。 Fibrinolysis inhibitors(抗纤溶药物), platelet concentrates, and oral estrogen progestogen preparations are administered as adjuvant treatments. Mainstays of therapy 二、Bernard-Soulier综合症(BSS) BSS是一种常染色体隐性遗传性疾病，因GPIb, GPIb 或GPIX基因缺陷所致，引起血小板糖蛋白复合 物GPIb/IX/V质或量的异常。BSS的基因缺陷包括框移、 缺失和点突变。 临床表现：纯合子型患者出血症状较为严重，多为皮 肤 粘膜出血、月经过多，无关节出血及深部 脏器血肿。 杂合子型可无出血表现。 GPIb-IX-V结构模式图 Canobbio I et al. Cellular Signalling 2004;16:1329 1344 诊断： 临床表现特点及遗传特征； 实验检查: 出血时间延长， 血小板减少伴巨大血小板， 血小板对瑞斯托霉素诱导不聚集， vWF不能纠正，对其他诱导剂反应正常， 血小板GPIb/IX/V分子数测定， 据此常可确立诊断 血浆vWF、骨髓检查正常。 PFA-100测定闭合时间明显延长 治疗： 血小板输注为主要治疗措施， DDAVP可能有效。 流式细胞分析图 2113GA， Ala 139 Thr GPIX基因突变致BSS一例 BSS外周血片 三、血栓性血小板减少性紫癜(TTP) TTP为一罕见的微血管血栓出血综合征。 临床特征： 发热、 血小板减少性紫癜、 微血管性溶血性贫血、 中枢神经系统异常 肾脏受累等。 继发性TTP常见于造血干细胞移植，妊娠，药物 (Ticlopidine, Clopidogrel, 干扰素，Simvastatin等)，自身 免疫病，严重感染和恶性肿瘤等。 发病机制： 1， vWF-cp与UL-vWF vWF-cp基因变异， 抗 vWF-cp自身抗体， 2，血管内皮损伤 抗内皮细胞自身抗体， 细菌毒素， 3，血小板活化 Tsp1 repeat SP propeptide metalloproteinase Dis Tsp1 Cys spacer CUB NH2COOH Abbreviations include: SP: signal peptide; Dis: disintegrin-like domain; Tsp1: thrombospondin motif; Cys: cys-rich domain. CUB: complement -Uregf-Bmp-1 domain vWF-cp结构模式图 vWF-cp结构图及基因突变位点： * 我所发现的新突变位点 * 临床表现： 见于任何年龄，大多数在1550岁；女性多见 。 出血：以皮肤粘膜出血为为主，严严重者可发发生颅颅内出 血。 微血管病性溶血性贫贫血：黄疸，血红蛋白尿。 神经经精神症状：意识识紊乱、头头痛、失语语、惊厥、视视 力 障碍、谵谵妄及偏瘫瘫等；以一过过性，反复性和多变变 性为为 特征。 肾脏损肾脏损 害：蛋白尿、血尿、肌酐酐升高，肾肾功能衰竭 。 发热发热 ：热热型不一，体温常达3840.5。 实验室检查： 血小板减少、血管内溶血相关检查 vWF多聚体分析 vWF-cp活性及抗原测定 vWF-cp抑制物测定 vWF-cp基因突变检查 vWF-cp活性测定： 残余胶原结合试验， vWF瑞斯脱霉素辅因子活性试验， 利用vWF-cp特异性底物活性检测，正积极研制。 vWF-cp抗原水平测定（ELISA法）目前已取得成功，已在 部分实验室使用。 诊断： 临床上主要根据上述“五联征”作出临床诊断。 如果存在血小板减少伴原因不明的微血管性溶血性贫血时， 应高度怀疑本病。 外周血涂片发现破碎红细胞、 vWF多聚体分析发现UL-vWF 胶原结合试验检测vWF-cp活性水平 鉴别诊断：与其他类型血栓性微血管病相鉴别，如 DIC、Evans综合征、恶性高血压、SLE、PNH、 HELLP、妊娠高血压综合征、先兆子痫等 治疗： 诊断明确或高度怀疑本病时应尽早开始治疗。 1，血浆置换及输注新鲜血浆 仍是目前最有效方法，6090病例有效，血浆置换 量每天23升（20ml30ml/Kg），严重者可增加至40ml 80ml/Kg。病情稳定后继续12周。 2，免疫抑制剂 长春新碱每周12mg46周； 或泼尼松1mg/kg，酌情增减。 3，抗血小板GPIIb/IIIa单抗可阻断血小板聚集， 4，抗CD20抗体、免疫球蛋白、切脾对难治、复发 或存在自身抗体的TTP有效。 血小板与动脉粥样硬化血栓形成 动脉粥样硬化血栓形成 动脉粥样硬化血栓形 成的特征是动脉粥样 硬化斑块突然（不可 预知）破裂（破裂或 侵蚀），导致血小板 激活以及血栓形成 斑块破裂1 1.Falk E et al. Circulation 1995; 92: 65771. 2. Arbustini E et al. Heart 1999; 82: 26972. 心绞痛: 稳定性 不稳定性 心肌梗塞 外周动脉疾病 : 间歇性跛行 静息痛 坏疽 坏死 卒中 TIA 动脉粥样硬化血栓形成* 是 全世界的主导死因1 1. 世界卫生报告 2001. 日内瓦: WHO; 2001. 死亡率 (%) *心血管疾病、缺血性心脏病和脑血管疾病 全世界的定义是WHO成员国的各区域 (非洲、美洲、中东、欧洲、东南亚和西太平洋) 中国心脑血管病的现状 死亡率 占死亡总数 脑血管病 137.7/10万 22.3% 心 脏 病 106.6/10万 17.3% 血小板聚集 血栓栓子的形成 血栓栓子血栓栓子 血管壁损伤血管壁损伤 血小板附着血小板附着 血小板激活血小板激活 血小板聚集血小板聚集 Primary Platelet Adhesion Receptors 血小板黏附过程主要参与因素 动脉粥样硬化血栓形成 l“损伤反应” 假说 平滑肌增生是动脉粥样硬化的关键基础. 内皮损伤是动脉粥样硬化的起始环节. 内皮和平滑肌的各种损伤导致炎症性纤维增 生反应 ( 1999, Ross) l炎症反应 内皮剥蚀和/或功能障碍 对血浆成分脂质和血细胞的通透性 增高 激活单核细胞和血小板 平滑肌细胞迁移和增生 动脉粥样斑块形成 血小板产生的炎症调节因子 1. Libby P, Simon DI. Circulation 2001; 103: 171820. 2. von Hundelshausen P et al. Circulation 2001; 103: 17727 3. Wever RMF et al. Circulation 1998; 97: 10812. 4. Hermann A et al. Platelets 2001; 12: 7482. 5. Robbie L, Libby P. Ann N Y Acad Sci 2001; 947: 16779. 转化生长因子-5 刺激平滑肌细胞生物合 成 一氧化氮(NO)3 作用于单核细胞、白细胞 、内皮细胞和平滑肌细胞 CD154 (CD40 配体)1,4 调节巨噬细胞和 平滑肌细胞功能 RANTES2 影响巨噬细胞粘附 于内皮细胞 血小板第4因子4 介导抵抗力的内皮细胞 捕获单核细胞 血小板 血小板源生长因子 (PDGF)1 诱导平滑肌细胞增殖 血栓反应蛋白 （TSP）1 与细胞表面受体相互 作用 v 血小板不仅是动脉粥样血栓形成的主要成分，而且 是动脉粥样硬化炎症因子的主要来源 v 抗血小板治疗以减少动脉粥样血栓形成事件 (J Thromb Haemost 2005, 3: 1577-89) 抗血小板药物 药物 作用环节 第一代 阿司匹林 环氧酶抑制剂 临床应用 Ticlopidine ADP活化抑制剂 临床应用 第二代 Reopro GPIIb-IIIa受体抑制剂 临床应用 第三代 JAQ1 GPVI（胶原）受体抑制剂 动物实验 AjvW2, 6B4 “vWF-GPIb”抑制剂 动物实验 82D6A3 “vWF-胶原” 抑制剂 动物实验 SZ2 AJvW2 血小板与胶原表面的有效黏附是血栓形成的必备条件之一 ，因而GPIb/IX/V-vWF-胶原轴和GP/21