结核诊断产品培训

1 FASTPlaque 结核诊断产品培训 2 全球结核病疫 世界卫生组织报道： l目前全球有近1/3的人已感染结核杆菌 ，也就是20亿人口感染了结核菌。 l全球有活动性肺结核病人约2000万， l每年新发结核病人约800-1000万， l每年约有300万人死于结核病。 l结核病已成为全世界成人因传染病而 死亡的主要疾病之一。 3 l结核病感染率高：目前全年龄组结 核菌感染率为44.5%，全国约 5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全球人口感染率 为1/3的水平。 l结核病患病率高：估算全国现有活动性肺结核病人数450万，其 中涂阳肺结核病人150万，菌阳肺结核病人200万。 l结核病耐药率高：按照全国菌阳肺结核病人200万计算，全国有 耐药病人55.5万。 l结核病死亡率高：每年因结核病死亡13万人，为各种其他传染病 和寄生虫病死亡总和的2倍。 我国结核病疫情 4 5 结核病实验诊断方法 概 况 6 主要实验诊断方法 涂片镜检法 LJ培养法 快速培养法 免疫法 分子生物法 噬菌体法 7 涂片镜检法 快速 检出率：低，漏诊率高 便宜 无法鉴别死活菌 需进一步鉴定 8 LJ培养法 结核菌检验的金标准 检测周期超长：约8周 灵敏度：一般，有一定比率假阳性 价格一般 各种分枝杆菌均能生长 需进一步鉴定 9 液体培养 检测周期较长，但比 LJ培养快 灵敏度：较LJ高，污染率较高 价格：专用仪器，专用试剂，价格高 各种分枝杆菌均能生长 需进一步鉴定 快速培养检测法 BD BACTEC MGIT 960 培养系统 BacT ALERT 3D培养系统 液体变色培养基 10 免疫学方法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫渗滤试验（DIGFA） 免疫层析试验（DICA） 快速 灵敏度：低，有一定的假阳性和假阴性 特异性差 费用：一般 结核菌的抗原性较弱 结果判断带有主观性 缺乏有效的质控手段 11 分子法 核酸探针杂交 碱基序列测定 结核杆菌DNA扩增法PCR 结核杆菌DNA链置换扩增法-SDA 结核杆菌RNA扩增法Gen-Probe 基因芯片检测 12 需要昂贵的仪器设备，检测成本较高， 芯片制备比较复杂，样品的准备与标记又较为繁琐 基因芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入， 使整个杂交背景增高，降低特异性。 其信号检测的灵敏度也有待于进一步提高。 13 WHO的目标：70%检出率 14 检出率低的全球性问题 诊断依靠“传统的技术” 症状 - 经常和其它病兆混淆 涂片镜检 灵敏度低 培养法 时间长 免疫法灵敏度低，有交叉反应 分子法：复杂，昂贵，难于推广 X-ray 没有特定的判读标准 15 目前急需一种快速、准 确、经济、易推广的结核 分枝杆菌检测方法 16 WHO新检测法应该有以下的展望： 特异性高 敏感度高 快速 易操作 节约成本 17 FASTPlaque TB TM 结核诊断的创新性突破 18 主要特点 l 快速 痰标本处理后，仅24小时就报告结果 l 灵敏 检测下限可达100300 cfu/ml l 准确 只检出活的结核分枝杆菌 l 简单 常规操作，极易掌握 l 方便 肉眼直接判读结果，无需显微观察 l 安全 不滋长活体感染源 l 可检出大量涂片漏诊患者 l 可用于HIV高危人群的鉴别诊断 19 检测原理 20 噬菌体 病毒 核酸 衣壳 只能在活的易感細胞內生長 溶原性感染和溶菌性感染 21 先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆 菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结 核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释 放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞 ，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼 可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体 被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感 细胞菌苔上无噬菌斑出现。 结核分枝杆菌 敏感细胞敏感细胞 敏感细胞 敏感细胞 杀病毒剂杀灭未感 染MTB的噬菌体 MTB裂解, 释放出来的 噬菌体感染敏感细胞 噬菌体感染结 核分枝杆菌 产生噬菌斑 22 结果判断标准 质控 阳性对照 20个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑 阴性： 无噬菌斑 阳性： 可数噬菌斑 阳性： 噬菌斑部分融合 阳性： 噬菌斑完全融合 标本 阳性结果 50个噬菌斑 阴性结果 19个噬菌斑 可疑结果 20-50个噬菌斑 23 适用范围 l可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种 标本 l用于结核病的实验诊断 l抗痨治疗效果的评价 尤其是初诊病人的鉴别诊断 l用于结核菌耐药性的快速检测 l用于HIV高危人群的鉴别诊断 24 试验方法 25 痰标本处 理 准备质控 检测标本 判 读 结 果 试验准备：试剂配制、制备培养基等 痰标本 胸水/腹水/脑脊液/尿等 检测流程 26 超净工作台（最好使用生物安全柜） 旋涡振荡器 冷藏箱（04） 离心机 可供高压消毒的容器 水浴设备（60） 电炉或微波炉 高压蒸汽灭菌设备 恒温培养箱（37） 90mm无菌培养皿 移液枪及配套枪头 生物安全罩衣、一次性手套、一次性容器等 一、基本试验条件 27 二、试验准备 1、pH6.8磷酸缓冲液 2、配制4 NaOH（或NALC-NaOH） 3、准备试剂盒 A液： C液： D液 E液 F液 G液 4、其它： 28 FPTB 培养液准备 FASTPlaqueTB 培养基干粉 FPTB 培养液 25C 可保存4周 270ml 净化水 临用前，将 FPTB 营养添加剂倒入冷 培养液中 FPTB 增强培养 液， 2-8 C下 可保存4周 121C 高压消毒器 121 C, 10min FPTB 营养添加剂 29 FPTB 琼脂准备 FASTPlaqueTB 琼脂干粉 高压消毒器 121 C, 10min FPTB 琼脂 60ml 净化水 25C 下可保存4周 使用前 55 C保存 加热融化 (微波炉, 水浴 或 直接加热） 水浴 121C 30 C液 噬菌体冻干粉 （Actiphage） 敏感细胞冻干粉 （Sensor cells） 无菌净化水 杀病毒剂 （Virusol） 5ml 11ml 1.1ml 2-8C下可保存7天 试剂准备 31 质控制备 每次试验均应设立阴性对照、阳性对照 阴性对照 阴性对照检测杀病毒剂Virusol 的有效性 设置方法：C液 阳性对照 阳性对照检测噬菌体 Actiphage 和敏感细胞 Sensor cells 的有效性 设置方法：敏感细胞用C液稀释106倍 32 E液 阳性对照 各加10 ml C液 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 1 ml C液 阴性对照 1 ml 33 三、标本要求及前处理(痰液) 标本要求 标本应为未进行抗结核治疗的初诊疑似患者标本 痰处理的必要性 去污染：抑制某些污染细菌，以防止其在平板上过度生长 痰液液化：使标本更易于操作，释放TB杆菌，并使TB杆菌 更易为特异性噬菌体感染 浓缩MTB细胞 去除痰液中某些抑制因子 34 痰液处理方法 (NALC-NaOH) l室温下用NALC-NaOH 处理 痰液15 min l磷酸缓冲液加至45ml中和 l4000 rpm 离心 15 min l弃去上清液 l用C液15 ml 洗涤 l4000 rpm 离心 15 mins l弃去上清液 l用 C液 1 ml 重悬 35 NALC-NaOH 溶液 室温静置 15 min加等体积 NALC -NaOH 溶液 旋紧盖子后漩涡 振荡 15 s 将痰液从痰瓶中转移至 离心管中 痰标本消化方法 36 磷酸缓冲液 加磷酸缓冲液 至体积为 45ml 4000rpm 离心 15 分钟 弃去上清液加 15ml C液 C液 请勿让标本在磷 酸缓冲液中停留 过长时间 37 弃去上清液4000 rpm离心 15分钟 C液 1ml 转移至反应管中 用 1ml C 液 悬浮 0.1ml D液 38 四、检测过程 1、分别加0.1ml 试剂D溶液于阳性对照、阴性对照及标 本中，轻轻摇晃，确保试管内容物位于试管底部，37 孵育60分钟。 痰处理 0.1ml D液37孵育 60min 0.1ml D液 39 0.1ml F液 2、分别加0.1ml试剂F溶液于阳性对照、阴性对照及标本 中，充分混匀（确保杀病毒剂与反应管内壁完全接触）， 置于室温5-7分钟（严格控制时间）。 室温5分钟 40 3、分别加5 ml C液于阳性对照、阴性对照及标本中 ，颠倒混匀一次。 4、分别加1 ml 试剂E溶液于阳性对照、阴性对照及 标本中。 5ml C 液 1 ml E 液 41 5、将标本、阳性对照，阴性对照分别倒入相应的培养皿。 6、立即将冷却至552的试剂G 5ml 于培养皿中，快速混匀 。 置于室温定型。 7、倒置于37培养箱中培养，1824小时判读结果。 42 结果判定标准 43 FASTplaqueTBTM检测质控（对照），噬菌斑数应在如下范围 阳性对照 20 个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑 FASTplaqueTBTM检测临床标本，噬菌斑数应在如下范围： 阳性结果 50个噬菌斑 阴性结果 19个噬菌斑 可疑结果 20-50个噬菌斑 44 阴性： 无噬菌斑 阳性： 可数噬菌斑 阳性： 噬菌斑部 分融合 阳性： 噬菌斑完 全融合 45 评 价 一、技术评价 二、临床评价 46 一、技术评价 l灵敏性 - 可以检出低浓度的 MTB 标本MTB浓度100300cfu/ml即可检出 l特异性 - 只检测活的 MTB 噬菌体法仅对结核分枝杆菌复合群敏感，对 其它非结核分枝杆菌、非分枝杆菌均不敏感 。 l快速 - 48h内出结果 l简便 - 不需任何特殊仪器 47 48 二、临床评价 国内临床评价 1、中国CDC结核防治中心 2、解放军三O九医院 3、上海市肺科医院 4、无锡市传染病医院 49 （资料来源：中国CDC结核病防治临床中心） 各方法检测结核分枝杆菌结果比较 50 几种方法检测结核分枝杆菌结果比较（检测例数均为120例） （资料来源：解放军三O九医院结核中心） FASTPlque TB法检测结核分枝杆菌结果 51 FASTPlaqueTB法检测结核分枝杆菌结果 FPTB法与BACTEC-460法检测结核分枝杆菌结果比较 （资料来源：上海市肺科医院） 52 几种方法检测结核分枝杆菌的结果比较 （资料来源：无锡市传染病医院） 53 结论 l1、FASTPlaque法比涂片法和LJ培养法检出率 更高； l2、FASTPlaque法与BACTEC-960、 BACTEC- 460法检出率无明显差别； l3、FASTPlaque法比LJ培养法和BACTEC-960快 速培养法检测周期大大缩短，有助于真正实现 结核病的快速诊断，是结核分枝杆菌检测技术 的重大飞跃，值得广泛推广。 54 国外临床评价 FASTPlaqueTB总特异性99.0%，对涂阴及涂阳标本的检测特异性分别 达99.5和83.3。该方法可从涂片阴性标本中检出48.7%的阳性病例，表 明该方法可用于涂片阴性TB患者的快速检测。 国际结核与肺疾病杂志2002年第6卷6期） 55 FPTB法检测痰标本的结果 FPTB法检测其它类型标本的结果 *堪萨斯分枝杆菌；*MOTT：非结核分枝杆菌 ； （肯尼亚奈洛比地区Aga Khan医院对FASTPlaqueTBTM试剂盒的临床评估） 56 特异性临床数据（国外） 足够的信心 结果是真正的阳性显示 57 即使NTMs存在时，特异性仍非常高 大数量的NTMs提供了 一个竞争性的环境 在巴塞罗那，30%的分支杆 菌为NTMs 噬菌体空斑法只检测出13% 的NTMs 总特异性非常高，保持在 99.1% 58 敏感度数据（国外） 比培养更具优势 两天出结果 检测活的菌 比涂片更高的灵敏度 59 对涂片阴性标本的检出情况 培养灵敏度 （%） 特异性 （%）阳性阴性 开普墩 （n=1447） 噬菌体阳性38748 .799 .5 噬菌体阴性401362 卡拉奇 （n=332） 噬菌体阳性47467 .198 .4 噬菌体阴性23248 检测出约1/2到2/3涂片漏检的阳性标本 高特异性保证了结果的更可信 60 其它类型标本检测结果 * 资料来源肯尼亚、印度和埃及 61 应 用 1、临床初诊结核疑似病人的鉴别诊断 肺结核、肠结核、肾结核、脑结核、脊髓结核、 骨结核等 由于本方法能快速、准确地检出活的结核分枝杆 菌，且适用于包括痰液、胸水、腹水、尿、脑脊液、 骨髓在内的多种类型标本，因此通过本方法检测结果 可直接判定患者是否为活动性结核患者，无需进一步 鉴定。 如联合涂片法，检测效果更佳。 62 检测肺部以外的标本 l一些权威的刊物资料提出噬菌体空斑法在肺部 以外结核诊断中的时效作用 高特异性 高灵敏度 痰标本、淋巴组织切片和抽出物 少数资料用某些类型标本如：脑脊液等 63 2、用于抗痨效果观察 由于检测结果噬菌斑数量与标本中所含 MTB数量成正性相关，因此可通过噬菌斑数 量变化，实验结果强阳性弱阳性阴性的 转变来实时监控抗痨药物是否对症。 64 3、从“结核病并发艾滋病”中检出结核病患者 很多结核病高发国家，结核病并发艾滋病比例相当高 肯尼亚有55%的结核病人并发艾滋病 FASTPlaqueTB法检出活的结核分枝杆菌 检测结果不受被艾滋病削弱的免疫反应影响 65 4、用于涂片阴性疑