人生长激素的生产工艺.doc

人生长激素的生产工艺生长素分为植物生长素和高等动物、人生长激素。植物体内的生长素,其化学成分是吲哚乙酸。而高等动物和人体内的生长激素,其化学成分是蛋白质，不同种属的哺乳动物的生长激素间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长激素对人有活性。因而动物的生长激素一般不能用在人身上。人生长激素是脑垂体前叶分泌细胞分泌的蛋白质，是由一条191个氨基酸的多肽链所构成的蛋白质,分子中有两个二硫键,相对分子质量21700,等电点4.9，沉降系数s20，w2.179，n端的1-134氨基酸段肽链为活性所必需，c端的一段肽链可能起保护作用，使生长激素在血循环中不致被酶破环。人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冻条件下可保持数年，在室温放置48h无变化。一、生长激素发展历程： ：科学家早家1920年就知道了生长激素的存在，但直到1958年才被用于临床治疗。直到1986年美国礼来大药厂通过基因工程方法，成功地制造出了191个氨基酸的hgh。 2：1985年，基于对hgh的多年研究和广泛深入的临床实验，美国威斯康辛医学院的罗德曼博士在美国抗衰老协会杂志上首次正式提出一个有关人体衰老原因的崭新理论。 3：1990年7月5日美国威斯康辛医学院的daniel rudman罗德曼医师在新英格兰医学杂志上发表了他那一篇震惊医学界的论文effects of human growth hormone in men over 60 years old（人类生长激素在60岁以上老年人中的应用），这篇论文可以说是hgh应用到抗衰老研究医学史上的一座里程碑。 4：1996年，爱德门钱博士在自己亲身体验到hgh的卓越效果后，扩展使用到超过800个患者，包括电影明星、大公司高级主管、甚至许多著名的医生、专家、学者，均达到惊人的效果。1996年8月美国fda（美国食品药品监督管理局）终于正式批准hgh在临床上使用，用来治疗所有缺乏hgh的病人，也包括正常成年人。5： 现在科学发现人体生长素hgh减少才会出现人体的衰老。合理的补充人体生长素（hgh），可以使人体的衰老现象产生逆转。二、人生长激素作用有：1：有抗衰老作用2：对人肝细胞有增加核分裂作用3：对红细胞有抑制葡萄糖利用作用4：对白细胞或淋巴细胞有促进蛋白质及核酸合成作用5：有促进骨骼、肌肉、结缔组织和内脏增长作用6：对垂体功能不全而引起的侏儒症有效。三、人生长激素的传统工艺流程：工艺过程：1：原料处理。 取出人脑垂体，速冻，置于-20保存备用。使用时用蒸馏水淋洗。剥离后叶，取腺垂体前叶。2：提取。ph= 5.5置组织捣碎机制成匀浆，水提，离心，收集沉淀用ph =4.0、0.1mol/l硫酸铵提取，离心，然后用ph =5.5、0.25 mol/l硫酸铵提取沉淀，离心，得提取液。3：分级沉淀。在ph =7.5时，提取液中加入饱和硫酸铵稀至浓度1 mol/l，离心，弃沉淀，上清液加饱和硫酸铵稀至浓度为1.8mol/l，离心，收集沉淀。 4：透析。腺垂体硫酸铵ph=5.5提取液硫酸铵ph=7.5盐析物透析除盐、去杂蛋白 将沉淀溶于少量蒸馏水中，用水透析除盐。5：等电点沉淀。再将透析液在ph=4.0和ph=4.9分别进行等电点沉淀，离心，除去杂蛋白，得上清液。盐析物蒸馏水溶解液透析液hcl或naohph=4.0, 4.9上清液。6：盐析。盐析、离心、洗脱 上清液在ph=4时用饱和硫酸铵稀至1.25mol/l，盐析，离心，收集沉淀。7：凝胶过滤。将沉淀溶于少量蒸馏水，对ph =8.5的tris-hcl缓冲液(含0.1mol/l氯化钠)透析，再上sephadexg-75柱，用50mmol/l、ph= 8.5的tris-hcl缓冲液(含0.1mol/l氯化钠)洗脱，分步收集组分。上清液硫酸铵ph4.0盐析物透析ph=8.5透析液sephadexg-75ph=8.5活性成分 8：deae-c（de-50）层析。透析、除盐、冻干 将活性成分对ph= 8.7、6.5 mmol/l的硼砂-hcl缓冲液进行透析，透析液上deae-c柱，用6.5 mmol/l、ph= 8.7的硼砂-hcl缓冲液(含0-0.3mol/l氯化钠)梯度洗脱，收集组分，合并，透析除盐，冷冻干燥即得pgh。活性成分透析ph=8.7透析液deae-cph=8.7吸附物洗脱ph=8.7洗脱峰组分透析透析液冻干-30pgh成品。四、人生长激素现在生产工艺现在生产工艺主要运用生物技术，有现采用枯草芽孢杆菌系统表达或用大肠杆菌表达系统，现主要介绍运用大肠杆菌表达系统1：构建工程菌pet30a( + ) -hgh/bl21 ( de3 ),2：种子液的制备。从- 70 甘油冻存的菌种中取出少量接种于5ml 液体lb ( 含氨苄青霉素100ug/ml ) , 在37 200r/min 振荡培养10 12h。按1% 量再转接于100ml 液体lb ( 含氨苄青霉素100ug/ml ) , 在37 200r/min 振荡培养8h 左右。3:发酵培养。培养基体积为4l, ph 控制在7.00 +/- 0.10, 由发酵控制系统自动补入5mol/l naoh 和2mol/l h2so4调节培养基ph。培养温度控制在37 。发酵过程中溶氧控制在20% 以上, 当溶氧降低至该值时可通过提高通气量和搅拌速度以提高溶氧。4: 诱导和补料发酵。当发酵进行到3.5 4h 后, 培养基中的葡萄糖几乎消耗完, 一次性加入iptg 进行诱导, 使其终浓度为0.5mmol/l, 同时以3 4ml/min 的流速滴加补料液, 补料体积为500ml。5: 分析检测。菌密度的测定; 葡萄糖的测定;周质蛋白的提取; 蛋白的定量; 生物量的测定6:hgh的纯化和纯度鉴定。hgh 多克隆抗体的制备及纯化; 抗体亲和层析柱的制备; 抗体亲和层析纯化hgh; 纯度鉴定; 相对分子质量测定; 免疫活性检测参考文献：1齐香君.现代生物制药工艺学.176-1772杨少民, 陈方, 付永标, 等. 用重组大肠杆菌发酵生产人生长激素研究. 生物学杂志, 1998, 15( 81) : 13- 153王海波，王骊丽，欧俊杰，等. 用重组大肠杆菌生产rhg-csf 高密度发酵的方法. 第四军医大学学报，2004， 25