培训班教材 微生物部分 ppt课件

第五部分 食品微生物检测基础 第一章 食品分析概论 第二章 微生物检测程序 第三章 菌落总数的测定 第四章 霉菌和酵母菌的计数 第五章 大肠菌群的测定 第六章 实验室生物安全基本知识 第一章 食品分析概论 l微生物是一群形体非常微小，肉眼看不 到或很难看清它的个体的生物。比如中 等大小的细菌，1000个叠加在一起只有 句号那么大。想象一下每毫升腐败的牛 奶中约有50亿个细菌，或者讲毎夸脱牛 奶中细菌总数约为5千万，也就是一滴 牛奶含有5千万细菌。 第一节 食品微生物简介 l微生物种类多，分布广，有些微生物 起着有益的作用，有些微生物起着有 害的作用。微生物对于食品来说关系 尤为密切，很多微生物可应用于食品 制造，如制酒、醋、面包、泡菜以及 制造菌体蛋白等。但是，有些微生物 能引起食物变质败坏，即引起食品气 味和组织结构发生不良变化；少数微 生物能产生毒素，引起食物中毒或引 起人、动植物病害。 l微生物除了具有其他生物共同具有的 特性，如遗传性和变异性以外，还具 有以下一些特性： l个体微小，结构简单。 l分布广，种类多。 l繁殖快，数量大。 l易于变异，适应力强。 l易于培养，代谢活力强。 第二节 食品微生物检测所涉及 的类群 l食品微生物检测所涉及的类群 （按有无细胞结构分）： 微生物 非细胞生物病毒细胞生物 原核生物细菌 真核生物酵母菌、霉菌 第三节 食品微生物检测的意 义和任务 l食品是人类赖以生存所必需的物质之一， 提供安全卫生、营养丰富的食品，是保证人 类生存和身体健康的基本要求。食品在生产 、加工、储备、运输和销售等各个环节都可 能受到环境中各种因素的影响和污染，微生 物污染尤为常见。因此对食品微生物的检验 至关重要。 l通过对食品微生物的检验，能够对食品被 污染的程度作出评价，为其卫生管理提供科 学依据。对微生物的检验结果是衡量食品卫 生质量的主要指标之一。微生物的检测不仅 利于保障人民身体健康，而且对扩大世界贸 易与对外交流具有重大的政治和经济意义。 第二章 微生物检测程序 第一节 样品的采集 l采样必须在无菌操作下进行，所有与样 品接触的用具（探子、铲子、匙、采样器 、试管等）都应经过灭菌。采样时应根据 样品的种类如袋、瓶和罐装的，应取完整 未开封的包装；若样品很大，应用无菌采 样器采样；若样品是固体粉末，应边取边 混合；是液体，应振摇混匀后取样；若是 冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态（可 放在冰内、冰箱内保存），非冷冻食品需 在05下保存。样品采好后应贴上标签 ，写明品名、来源、数量、采样地点、采 样人及采样时间。总之，定型包装及散装 均采样250g l样品采好后送到微生物实验室检验，最 好不要超过三小时。 l微生物检验室接到送检申请单，应立即 登记，填写实验序号，并按检验要求， 立即将样品放在冰箱中，积极准备条件 进行检验。 l各食品卫生微生物检验室必须备有专用 冰箱存放样品。一般阳性样品在报告发 第二节 样品的微生物检验 出后3天（特殊情况可适当延长）方能处 理样品。进口食品的阳性样品，需保存6 个月后方能处理，以便复验和再次证明 。阴性样品可及时处理。 l检验完后，检验人员应及时填写报告单 ，签名后，送主管人员核实签字，加盖 单位印章，以示生效 第三章 菌落总数的测定 l定义：食品检样经过处理，在一定条件 下培养后（如培养基成分、培养温度和 时间、PH、需氧性质等），所得1mL(g) 检样中所含菌落的总数。本方法规定培 养条件下所得结果，只包括一群在平板 计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或 兼性厌氧的菌落总数。 l菌落总数主要是作为食品被污染程度的 标志。 l冰箱： 04 l恒温培养箱：361 l恒温水浴锅：461 l均质器或灭菌乳钵 l药物架盘天平：0 500g，精确至 0.5g l放大镜 4 l灭菌吸管：1mL、10mL l灭菌锥形瓶：500mL l灭菌培养皿：直径90mm l灭菌试管、玻璃珠、刀、剪子、镊子 等 第一节 设备和材料 l检样稀释及培养 第二节 检验程序 l以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于 含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭 菌玻璃瓶内（瓶内预置适当玻璃珠）或 灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨做成 1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀 释液后，最好置均质器中以8000r/min 10000r/min速度处理1 2min，做成 1:10的均匀稀释液。 l用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液 1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌 生理盐水或其他稀释液的试管内（注意 吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇 试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。 另取1.0mL灭菌吸管，按以上操作方法， 做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次 ，即换用1支1.0mL灭菌吸管。 l根据食品卫生标准要求或对标本污染情 况的估计，选择23个适宜稀释度，分 别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取 该稀释度的吸管移1.0mL稀释液于灭菌培 养皿内，每个稀释度做两个培养皿。 l稀释液移入培养皿后应及时将凉至46 营养琼脂培养基（可放置与461 水浴 保温）注入培养皿约15mL，并转动培养 皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基 倾倒入加有1.0mL灭菌生理盐水或其他稀 释液的灭菌培养皿内作空白对照。 l待琼脂凝固后，翻转平板，置361培 养箱内培养48h2h。水产品301培养 箱内培养72h3h。 l如果样品中可能含有在琼脂培养基表面 弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂 表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL）， 凝固后翻转平板，按上述培养。 检样25g(mL) 作几个适当倍数的稀释液 选择23个适宜的稀释度 各取1.0mL分别加入灭菌培养皿内 每皿内加入适量（约15mL）平板计数琼脂培养基 菌落记数 报告 361 482h 2菌落计数的方法 l做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必 要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释 倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌 落形成单位（colony-forming units,CFU） 表示。 菌落计数 1.选取菌落数在30 300CFU之间、无蔓 延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可 记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采 用两个平板的平均数。 2.其中一个平板有较大片状菌落生长时， 则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平 板的一半，而其余一半中菌落分布有很均匀 ，即可计算半个平板后乘以2代表一个平板。 3.当平板上出现菌落间无明显界线的链状 生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 菌落总数的计算方法 1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适 宜的技术范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为 每克（毫升）中菌落总数的结果。（见下表 例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计1642016400 16000或 1.6104 2.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜技术 范围内，按如下公式计算。（见下表例） N=C/(n10.1n2)d 式中： N样品中菌落数； C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数 之和； n1第一个适宜稀释度的平板数； n2第二个适宜稀释度的平板数； d稀释因子（第一稀释度）。 示例： 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计 23233 2472725000或 2.510424435 N=C/(n10.1n2)d =(232+244+33+35)/(2+0.12) 10-2 =544/0.022 =24727 最后数据经“四舍五入”后表示。 3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板 可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以 最高稀释倍数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计 多不可计313313000 310000或 3.1105 4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 两稀释 度之比 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 27115270 270或 2.7102 5.若所有稀释度（包括液体样品原液）平 板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍 数报告之。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 00011010 6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30 300之间，其中一部分大于300或小于30时， 则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。（见下表例） 稀释液及菌落数 菌落总数 cfu/g(mL) 报告方式 cfu/g(mL) 10-110-210-3 多不可计3051230500 31000或 3.1104 菌落数的报告 1.菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则 修约，采取两位有效数字报告。 2.大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五 入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位 数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入” 原则修约后，采用两位有效数字。 3.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报 告菌落蔓延。 4.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果 无效。 5.称重取样以CFU/g为单位，液体体积为 CFU/mL。 3培养基及试剂的制备 平板计数琼脂（PCA）培养基 胰蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g； 葡萄糖1.0g；琼脂15.0g； 蒸馏水 1000mL PH7.00.2 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸 溶解，调节PH。分装试管或锥形瓶， 121高压灭菌15min。 磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.282003中 3.22规定。 生理盐水 氯化钠 8.5g；蒸馏水 1000mL 制法：氯化钠溶解后，分装，高压灭菌。 75%乙醇 第四章 霉菌和酵母菌的计数 l霉菌和酵母菌广泛分布于自然界，也可作 为食品中正常菌相的一部分。但在某些情况 下，各类食品由于遭受霉菌和酵母菌的污染 ，常常发生霉变，使食品失去色、香、味； 有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢 性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致 癌性。因此霉菌和酵母菌也可作为评价食品 卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌计数 来判定食品被污染的程度。 第一节 检验方法 l霉菌和酵母菌计数 检样稀释度及培养 l以无菌操作将检验25g(mL)剪碎放于含有 225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶 内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳 钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀 释液。固体检样在加入稀释液后，最好置于 均质器中以8000r/min10000r/min的速度处 理1min，做成1:10的均匀稀释液。 l用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液 1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理 盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端 不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均 匀，做成1:100的稀释液。另取1.0mL灭菌吸 管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如 此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸 管。 l根据食品卫生标准要求或对标本污染情况 的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10 倍递增稀释的同时，吸取1.0mL稀释液于灭菌 平皿中，每个稀释度作两个平皿。 l稀释液移入平皿后，应立即将凉至45左 右的培养基约15mL注入平皿中，并转动平皿 使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置 2528培养箱中，3天后开始观察，并观 察培养5天。 菌落计数方法 l做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要 时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板 的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌 落总数。 霉菌和酵母菌计数报告 l选取菌落数在10150之间的平板作为霉菌 和酵母菌计数的标准。同稀释度的2各平皿的 菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克或每毫 升检样中所含霉菌和酵母菌数，以cfu/g(mL) 表示。 l 实验分析及结果判定 样品处理和稀释 l严格按照标准样品处理和稀释的方法进行 操作。 培养基的选择 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA） 培 养基上生长良好。用PDA做平板计数时，必 须加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红培养基 该培养基的孟加拉红和 抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可 抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟 加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌的计 数。 高盐察氏培养基 粮食和食品中常见的曲 霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具 有抑制细菌和减缓生长速度快的毛菌科菌种 的作用。 倾注平板 l每个样品应做3个适宜的稀释度，每个稀释 度倾注2个平板。培养基熔化后冷却至45， 立即倾注并转动混匀。培养基凝固后，把平 皿反过来放培养箱培养，培养温度为25 28。培养3天后开始观察菌落生长情况，共 培养5天观察记录结果。 第二节 检验程序 检样 粮食 块状食品 粉状食品 液状食品 糊状食品 称取25g，加225mL无菌水 吸取25mL，加225mL无菌水 做成几个适当倍数的稀释液 选择3个适宜稀释度，各以1mL的量加入灭菌平皿内 每皿内加入适量培养液 2528 5天 菌落计数 报告 3 营养基的制备 马铃薯-葡萄糖-琼脂 马铃薯 300g；氯霉素 0.1g；葡萄糖 20g； 蒸馏水 1000mL；琼脂20g 制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水， 煮沸1020min。用纱布过滤，补加蒸馏水至 1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化。另用 少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装， 121高压灭菌20min。 孟加拉红琼脂 蛋白胨 5g；琼脂 20g；葡萄糖 5g；氯霉素 0.1g 0.3g/L孟加拉红溶液 100mL；磷酸二氢钾 10g； 七水硫酸镁 1g；蒸馏水 1000mL 制法：上述各成分加入水溶解后，再加孟加拉红 溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中 ，分装后，121高压灭菌20min。 高盐察氏培养基 硝酸钠 2g；氯化钠 60g；磷酸二氢钾 1g； 蔗糖 30g；七水硫酸镁 0.5g；琼脂 20g； 氯化钾 0.5g；硫酸亚铁 0.01g； 蒸馏水 加至1000mL 制法：加热溶解、分装后， 115高压灭菌 30min。必要时，可酌量增加琼脂。 用途：分离霉菌用。 第五章 大肠菌群的测定 l大肠菌群是作为粪便污染指示菌提出来的 ，主要是以该菌群的检出情况来判断食品有 否被粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了 食品被粪便污染的程度，粪便内除一般正常 的细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在 ，因而以此作为粪便污染指标，来评价食品 的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 l大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标 之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生 工作中，大肠菌群并非细菌学分类命名，而 是细菌卫生领域的用语，它不代表某一个或 某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组 与粪便污染有关的细菌。定义：在36条件 下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的好氧和 兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。该 菌群包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸细 菌属肠杆菌属和克雷伯菌属。 第一节 检验方法 l检验稀释 l以无菌操作将检验25g(mL)剪碎放于含有 225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶 内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳 钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀 释液。固体检样在加入稀释液后，最好置于 均质器中以8000r/min10000r/min的速度处 理12min，做成1:10的均匀稀释液。 l样品均液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时 分别用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节。 l用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液 1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理 盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端 不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均 匀，做成1:100的稀释液。另取1.0mL灭菌吸 管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如 此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸 管。 l根据食品卫生标准要求或对标本污染情况 的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接3管 。从制备样品均液至样品接种完毕，全过程 不得超过15min。 l初发酵试验 l每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品 均液（液体样品可以选择原液），每个稀释 度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉 汤，每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双 料LST肉汤)，361培养242h，观察倒管 内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至 482h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管 数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进 行复发酵试验。 l复发酵试验 l用接种环从所有482h内发酵产气的LST肉 汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆 盐（BGLB）肉汤管中， 361培养482h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳 性管。 l报告 l根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检 索表，报告每100mL(g)大肠菌群的最可能数 。 l大肠菌群MPN检索表见教材165页。 第二节 检验程序 检 样 选择三个适宜的稀释度 接种LST肉汤管482h，361 不产气 产 气 大肠菌群阴性 BGLB肉汤361； 482h 报告 不产气 产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 报告 报告 l在乳糖发酵试验中，经常可以看到在发酵 倒管内有极细小的气泡。一般来说，产气量 与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类 而有不同，小于小米粒大小的气泡，亦有阳 性检出（约为3050%）。另外，有时可以 遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵时却有 气体产生。所以对产酸但为产气的如糖发酵 管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如 有气泡沿管壁上升，即可考虑可能有气体产 生，应做进一步观察。 l实验分析及结果判定 l培养基的制备 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化钠5.0g 磷酸氢二钾2.75g；磷酸二氢钾2.75g 月桂基磺酸钠0.1g；蒸馏水1000mL pH6.80.2 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，校正PH 值，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10mL，高压灭菌12115min。 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨10g；乳糖 10g； 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200.0mL； 0.1%煌绿水溶液 13.3mL； 蒸馏水1000mL； pH 7.20.1 制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中， 加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶 于200mL蒸馏水中，pH7.0-7.5）用蒸馏水稀释到 975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液 13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤 后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL ，121高压灭菌15min。 第六章 实验室生物安全基本知识 第一节 微生物实验室玻璃 器皿的准备 l微生物实验室常用玻璃器皿，主要包括试 管、培养皿、三角瓶、吸管、载玻片、盖玻 片等，都要经过洗涤清洁处理，至少无灰尘 、油垢和无机盐等杂质后，才能保证获得正 确的实验结果。有的器皿在清洁后，还要用 一定方法包装，经过灭菌方能使用。 l洗涤 新玻璃器皿的洗涤 l新的玻璃器皿含有游离碱，应用2%盐酸溶 液浸泡过夜，再用水洗干净；必要时先用水 冲洗后浸泡于铬酸钾洗液中，再用水冲洗。 使用过的玻璃器皿的洗涤 l先将器皿中的琼脂刮去，如果培养基已经 干涸，可放在肥皂水中煮沸，是琼脂溶化后 趁热倒出，然后用清水洗涤，并用毛刷或海 绵擦洗内壁，以除去粘在壁上的污垢。洗净 的玻璃器皿其壁上不出现水珠或局部不沾水 滴。 载玻片和盖玻片的洗涤 l新载玻片和盖玻片先在2%的盐酸中浸1h，然后用 自来水冲洗，必要时可在重铬酸钾洗涤液中浸泡几 个小时或在稀重铬酸钾洗涤液中煮沸半小时，然后 取出用水冲洗。用过的载玻片上如沾有油脂，先用 皱纹纸擦去，然后放入5%的肥皂水中煮沸10min或 在酒精碱溶液中浸泡30min后再用自来水冲洗。洗 后的载玻片再在稀的重铬酸钾洗液内浸2h，取出， 用自来水冲洗到无色为止，最后用蒸馏水冲洗数次 ，烘干或浸于95%的酒精中备用。供细菌鞭毛染色 用的载玻片，尤须保证洁净无伤痕。其洗涤方法是 先用无渣粒的洗涤剂溶液煮沸，冷后用清水冲洗， 再放入浓洗液中浸泡24h，取出后用清水冲洗，再 用蒸馏水洗净，沥干，浸于95%的酒精中备用。 l灭菌前的准备 l为了防止空气中的杂菌对灭过菌的培养基 或器皿再次污染，必须在盛有培养基的器皿 口上塞上棉塞。培养用的器皿以及其他用具 都应包扎后灭菌。 制作棉塞 l制作棉塞用的棉花，用市售的普通棉花即 可，不宜用脱脂棉。因为脱脂棉容易吸收水 而导致污染。棉塞应按器皿口径大小制作， 其长度就试管而言，一般长约45厘米。常 用的制作方法有：取适量棉花铺成长方形， 纵向松松卷起来再对折后塞入管口；或将棉 花铺成方形，于其中央衬以小块棉花，用左 手拇指为中心制成棉芯，再由外侧棉花包入 做成棉塞。棉塞制成后，将其2/3塞入容器内 ，1/3露在容器外，要求松紧适当，紧贴管壁 不留缝隙。以手提棉塞试管不滑落为度。 包扎器皿 l微生物分析用的培养皿和吸管等应事先包装 后在灭菌。吸管应在管口约0.5厘米以下的地方 塞入少许长约1.5厘米的棉花，以防止菌液吸入 口中或口中细菌吹入管内。棉花的松紧程度以 吹气时通气顺畅而不致下滑为准。然后，将吸 管尖端放在45厘米宽的长条纸的一端约与纸 成45度角，折叠纸条，包住吸管尖端，然后将 吸管卷入纸条内，末端剩余纸条折叠打结，待 灭菌。培养皿可按8或10套为一叠用纸包装，或 装在特制的铝制筒内灭菌。 灭菌 l玻璃器皿经干热或温热灭菌后备用。 第一节 微生物培养基的制 备 l微生物培养基的制备程序 称取营养成分加热溶化调整PH值煮沸 无菌检验灭菌分装过滤 l配制 根据所培养的微生物对营养元素的要求选择 适当的配方。 确定所需培养基的用量后，按配方称取药品 和其它原料（一般用1/100感量的天平即可）， 逐一加入水中加热溶解。 最好先加无机药品，后加有机药品。难溶解 的物质可先分别溶解后再加入。 易受高温破坏的药品应单独配制，采用过滤 灭菌，临用前加入培养基中。 若制备固体或半固体培养基，则需加入琼脂 （固体培养基加1.82.0%的琼脂，半固体培养 基加0.81.0%的琼脂），加热至琼脂融化，并 补足蒸发失去的水分。琼脂加入后宜开锅搅拌 ，以防糊防溢。 l调整PH值 l各种培养基因成分不同，配制以后其酸度不 一样。 l由于不同种类的微生物对培养基酸度的要求 不同，因此，在配置培养基时应根据欲培养的 微生物对酸度的要求待配方中各成分全部溶解 后，测试并调整培养基的PH值。 l常用的方法如下： 试纸法 l用PH试纸检测。用0.1NNaOH或乳酸调节培养 基的酸碱度。 酸度计法 l用酸或碱调节培养基酸度后，用酸度计侧其 PH值 对要求保持在中性以上的培养基，可加入 CaCO3或其它缓冲物质，不必再测试培养基中 的PH值。 对酸性培养基（PH5），灭菌前不可加入酸 调节，须在灭菌后临用时加入或先将酸加入培 养皿中，然后注入融化的培养基，以免在高温 和酸性条件下琼脂水解而导致琼脂软化或完全 失去凝固力。 l过滤 l液体培养基用滤纸过滤，固体及半固体培养 基用纱布夹药棉过滤，以制备清亮的培养基。 5分装 l通过漏斗或虹吸管分装于三角瓶、试管或其 它容器中。分装时严防培养基粘附在瓶口或管 口，以避免培养基贮存或使用时的污染。 6灭菌 l用高压蒸汽灭菌器灭菌。 7制作琼脂斜面 l欲制作琼脂斜面，则在培养基灭菌后，趁热 将试管成30斜置于木棒上，而斜面总长 度以不 超过试 管长度的1/3为宜，凝固后保存备用。 第三节 消毒与灭菌 l干热灭菌 火焰灭菌 l主要用于实验室接种针、接种环、试管口和 玻璃棒等的灭菌。 干热灭菌 l用干热空气灭菌的方法。常用的设备室电热 干燥箱。其法是先将洗净并晾干的玻璃器皿用 包装纸包装好，置于干燥箱中（注意需灭菌的 物品不要靠箱壁附近，不要过挤）。打开电源 开关，调节升温旋钮，使其缓慢升温至6070时， 开动鼓风开关，鼓风510min，以促使器皿上及干燥 箱空间的水汽排除。继续转动升温旋钮，使温度升至 160170，维持2h。控制温度的方法室当箱内温度 升至160 时，应将温度调节旋钮缓慢的反方现转动 ，当干燥箱上的指示灯红灯熄灭，绿灯亮时，在缓慢 的来回转动温度调节旋钮，使红灯刚亮，绿灯刚灭处 为止。这样，可继续升温约510，即可将温度控制 在165170。红灯是加热升温的信号，绿灯时切断 加热电源的信号。灭菌时间到了以后，将温度调节旋 钮按反时针方向转动至“0”点。关闭电源开关，待其冷 却至50以下，方可取出灭菌器皿。绝对不可在高温 时打开箱门。另外，干热灭菌时。定要专人看管，切 勿同时干其他事情，以免发生事故。 l湿热灭菌法 煮沸消毒 l此法是将液体材料加热煮沸至近100，维持 1020min。可以杀死所有细菌的繁殖体，但不 能杀死全部芽孢。此法多应用于实验室小件器 械的临时消毒，也可用于少量试验用果汁、饮 料的消毒。但不适用于生产使用。饮料生产中 的化糖过程，实际上起了对糖液的消毒灭菌作 用。 流通蒸汽灭菌 l此法室利用流通蒸汽灭菌器或蒸笼进行的一种灭菌 方法。要求每天蒸煮一次，每次30min，连续三天，所 以又称为间隙灭菌。因此蒸煮一次30min，只能杀死微 生物的繁殖体、真菌的孢子和