mtt法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响(1)

MTTMTT 法分析含药血清对体外培养肺癌细法分析含药血清对体外培养肺癌细 胞增殖的影响胞增殖的影响(1)(1) 作者：赵婷秀陈振发邱幸凡由江峰许湘王秀莲姜霞刘 凌琪 【关键词】莪术瓜蒌汤 摘要:目的:MTT 法观察莪术瓜蒌汤含药血清对人肺癌细 胞增殖的影响。方法:家兔灌胃制备高、中、低剂量莪术瓜 蒌汤血清分别作用于人肺癌细胞，采用 MTT 法观察莪术瓜 蒌汤含药血清对细胞增殖的抑制作用。结果:高剂量血清组 与对照血清组之间的吸光度差异有显著统计学意义（P 关键词:莪术瓜蒌汤;人肺癌细胞;血清药理学;MTT 法 为进一步研究中医药治疗肺癌的作用机理，本实验采 用 MTT 法观察莪术瓜蒌汤含药血清对人肺癌细胞增殖的影 响，筛选出合适的血清浓度。 1 材料和方法 实验材料 人肺癌细胞系人肺巨细胞癌 （pulmonarygiantcellcarcinoma，PG）的低转移亚系 LH7（PGLH7） 1由北京大学医学部病理系提供。 主要试剂及设备 RPMI1640（美国 GIBCO） ，胰蛋白酶 （美国 SIGMA）;噻唑蓝（美国 SIGMA）;二甲基亚砜（北京 北化精细化学公司） 。高速低温离心机（美国 SIGMA）;超净 工作台（北京半导体设备一厂）;CO2 恒温孵育箱（法国 Jouan） 。 实验方法 药物制备及剂量莪术瓜蒌汤（简称“莪瓜汤” ）由莪术、 天龙、沙参、全瓜蒌、龙葵组成，购于湖北中医学院附属 医院。将上述中药饮片置煎煮容器内，加水浸泡，煮沸， 过滤浓缩，用蒸馏水倍比稀释成含生药/ml、/ml、/ml 的水 煎剂，分别作为高、中、低剂量灌胃药液。根据“人和动 物体表面积折算的等效剂量比率表” 2 ，本实验所选具体 剂量为:家兔用药量（-1.d-1）=人日用剂量/（g.kg- 1.d-1） 。莪术瓜蒌汤剂量标准为（-1.d-1） 。中剂量:为上 述标准剂量;高剂量:为标准剂量的 3 倍;低剂量:为标准剂 量的 1/3 倍。 含药血清的制备健康家兔 16 只（湖北中医学院动物房 提供） ，雄性，体重 kgkg。随机分成 4 组:空白对照组、 莪瓜汤低剂量组、莪瓜汤中剂量组及莪瓜汤高剂量组。给 药前禁食 1012h，不禁水。各组家兔于每日早、晚各灌胃 给药一次，每次/kg，共 2 次。按通法方案制备含药血清 3 ，实验分组:对照兔血清组、莪瓜汤低剂量血清组、莪 瓜汤中剂量血清组、莪瓜汤高剂量血清组、ATRA 血清组。 同组血清混合，56水浴中灭活 30min，用 m 的微孔滤膜 过滤除菌，置-20保存备用。 人肺癌细胞的培养 PGLH7 细胞株，用含 10%热灭活新鲜 小牛血清的 RPMI1640 于 37C、5%CO2 孵育箱中培养。生 长旺盛的细胞每 2 天传代一次。 MTT 法检测癌细胞生长抑制率用胰酶消化细胞，用常规 培养基配成细胞悬液种入 96 孔板，板周边的孔不加细胞， 防止有边缘效应。留空白孔调零，以只加培养液不加细胞 作空白对照。在 37、5%CO2 的培养箱内培养 24h 后，分 别加入不同剂量的含药血清和对照血清。每组设 4 个平行 孔，继续培养 24h，加入 MTT 溶液 20ul 继续培养 4h，终止 培养，弃培养液，加入二甲基亚砜 （dimethylsulfoxide，DMSO）150ul/孔，振荡，在酶联免 疫检测仪上测定各孔吸光度 A 值，比色时以空白孔调零。 按照上述同样方法检测培养 48h、72h 的 A 值。根据公式计 算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=（空白对照组 A 值-实 验组 A 值）/空白对照组 A 值100%。 统计学分析数据处理采用方差分析。 2 结果 10%的含药血清作用 PGLH7 细胞 24h、48h 和 72h 的吸光度值见表 1。由表 1 可以看出:莪术瓜蒌汤低、中剂 量血清组与对照血清组之间的 PGLH7 细胞吸光度差异无统 计学意义，而莪术瓜蒌汤高剂量血清组则与对照血清组之 间的吸光度差异有显著统计学意义（P 3 讨论 “莪术瓜蒌汤”是名老中医邱幸凡教授治疗肺癌的主 要方剂，是根据“痰瘀浊气凝结于肺”的病理特点而立法、 组方、用药的，临床治疗肺癌取得了一定疗效。中药复方 多数是通过口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体 反应体系中进行实验研究，在方法学上存在很多问题，如 中药中的杂质成分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度 的影响等，都会对实验结果造成一定的影响。中药血清药 理学实现了体外实验和体内实验的较好结合，在方法学上 具有创新性，可以排除以上各种因素的影响，比较接近药 物体内环境中产生药理效应的过程，目前是研究中药药理 学的一种较为理想的方法4 。为了减少因种属差异而造 成的免疫反应，实验动物应尽量选用与人类生物学特性近 似的物种，以家兔和大鼠为首选。李仪奎等3提出中药 血清药理研究的通用给药方案（通法）并给出增大给药剂 量以部分地弥补含药血清被稀释，较好地控制实际加入反 应体系中含药血清的药量。在体外培养体系中宜采用同种 单一血清，且含药血清在培养液中的浓度一般不能超过 20%，其中以 10%的浓度为最佳条件。MTT 显色法5是近 几年评价肿瘤细胞生存状态较受推崇的方法之一。当肿瘤 细胞在光镜下尚未出现明显外形变化时，其活细胞的线粒 体内琥珀酸脱氢酶可还原 MTT 而形成难溶的蓝紫色结晶物， 死细胞则无此功能。用酶联免疫检测仪测定其吸收值在一 定数量的细胞范围内，间接反映活细胞的数量。MTT 法反映 不同肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物的敏感性差异，而且与其 它药敏方法及临床疗效都有很好的相关性，对于临床合理 用药、实现肿瘤病人个体化治疗具有重要价值。为了研究 不同剂量含药血清对吸光度的影响，本实验选用家兔制备 莪术瓜蒌汤含药血清，以家兔的临床等效用药剂量为中剂 量，其 1/3 倍和 3 倍分别为低、高剂量，然后按通法方案， 以上述三种剂量分别给家兔灌胃给药，制备浓度为 10%的不 同剂量含药血清。结果表明，不同剂量的莪术瓜蒌汤血清 组处理 PGLH7 细胞不同时间后，癌细胞的生长受到不同程 度的影响，其中高剂量莪术瓜蒌汤血清组对于人肺癌细胞 的增殖抑制作用明显优于其它各组含药血清，并与其药物 剂量呈正相关。我们认为在制备中药含药血清时适当增加 临床等效用药剂量是必要的。王力倩等6在研究苦参、 仙鹤草的抗癌作用时显示，以临床常用量计算给药剂量所 制得的含药血清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用，而比该 药量小 1 倍的含药血清则无明显作用。本实验也显示高剂 量含药血清组对 PGLH7 细胞的作用显著。所谓低、中、高 剂量含药血清是指以给予相应剂量的药物制得的血清，绝 不应与由一种剂量的药物制备的血清予以相应稀释的浓度 高低相混淆，因为两者是截然不同的两个概念。但我们也 应看到，在中药含药血清的制备过程中，由于受到动物选 择、给药剂量、采血时