CR检测方法分析性能评价.ppt

PCR检测系统分析性能验证 上海市临床检验中心 肖艳群 1 相关规定 医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域 的指南CNAS-GL xx 5.5.2) 实验室应在应用于医学检验之前验证所使用的检验方 法和程序的分析性能.对于定量检测项目内容至少包括 正确度、精密度、可报告(或线性)范围.对于定性检测 项目内容应包括灵敏度、特异性或符合率及重复性 上海市医疗机构临床基因扩增检验技术审核办法 临床基因扩增检验实验室在技术审核前应完成拟开展 检测项目方法学验证。方法学验证实验应包括但不限 于：精密度、正确度、检测限、线性范围、可报告范 围、特异性试验 2 什么情况下要做性能验证 开展新项目 更换检测系统:更换仪器或试剂 3 分析性能验证项目 对配套系统,一般验证以下指标 精密度 准确度 可报告范围 参考区间 对非配套系统除验证上述指标外 分析灵敏度 分析特异性 4 依据文件(CLSI 文件) EP5-A2:定量测量方法的精密度性能评价 EP6-A:定量测量方法的线性评价 EP7-A:临床化学的干扰实验 EP9-A2:用患者样本进行方法学比对及偏倚评估 EP12-A2:定性实验方法评价用户协议 EP15-A2: 用户对精密度和准确度核实试验 EP17-A: 检出限和定量检出限确定方案 C28-A2: 医学实验室参考区间的定义和确定 5 性能验证前的准备 应熟悉待验证的检测系统 应熟悉验证方案的步骤(PCR检测项目成本高、阳性标 本来源困难,精密度和正确度验证可以采用EP15-A2 文 件) 制定质量保证措施 确保足够的样本数量和覆盖较宽检测范围 确定比较方法 6 EP15-A2:精密度和准确度性能的用户验证 实验室验证方法的操作与厂家的申明一致 为验证重复性、实验室内精密度的申明提供方案和数 据分析 其他的 CLSI 文件为厂家做出精密度(EP5-A2)和准确 度(EP9-A2)的申明提供指南 7 精密度验证 重复性:指在相同条件 (时间、操作者、仪器)下获得 的精密度,也称批内精密度 实验室内精密度:同一实验室内，使用相同的设备, 在 不同时间内获得的精密度,也称总精密度.(不包括大的 设备维护、仪器校准和更换试剂批号等) 8 实验要求 试剂:同一批号 实验样本 以前分析过的病人样本 其他已知值的物质 浓度要求: 医学决定水平 厂家说明书精密度指标所用浓度 内容 重复性 实验室内精密度 9 实验步骤 根据厂家申明的精密度比例关系可分为3种情况: 1)如果批内2/3 总:每天分析1批次,2个浓度,每个 浓度重复测定3次,连续3天. 3)如果批内与 总相对关系未知:每天分析1批次,2个 浓度,每个浓度重复测定4次,连续5天. 每天做室内质控,如果失控,剔除数据,重新进行测定 实验数据的统计学处理:批内标准差、实验室内标准差 10 结果判断 重复性验证: 批内标准差厂家申明, 则通过计算验证值进行 差异的显著性检验, 批内标准差厂家申 明,则通过计算验证值进 行差异的显著性检验, 实验室内标准差厂家指标(实验室指标),则通过计算验证值 进行差异的显著性检验, 在验证限范围内,验证通过 16 选择厂家申明中使用的比较方法为本方案的比较方法 如两种方法在检测的浓度范围内标本结果差异不一致, 应参考EP9-A2文件(用病人标本进行方法学比对和偏倚 评估)来进行实验 17 使用参考物质的正确度方案 参考物质 1)新鲜冰冻人血清或其他一些未掺入成分的人体物质: 已用参考方法或决定性方法定值 2)从能力比对实验中获得的参考物 3)厂家提供的正确度确认物或质控物 4)实验室室间质评物被众多的实验室分析,他们的均值 可用于评估一致性 5)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物质 18 实验步骤 至少2个物质,浓度为可报告范围中高和低的测量范围 在3-5天内每天测定一次,每次重复2次 将结果与设定要求进行比较,比如与能力比对实验组织 者的接受标准或医学允许总误差来比较 19 定量检出限的验证(EP17-A) 20 概念 能可靠检出分析物的最低实际浓度,并在该浓度下的总 误差符合准确度要求 总误差目标来源:实验室的需求、室间质评结果、厂家 的申明 21 实验样本 低浓度参考物质 已知浓度或活性的样品适当稀释成3-5个低浓度实验样 品 22 实验步骤 至少25个重复测量 每个样品重复测量的结果与该样品的参考值比较,以确 定是否超出目标误差,超过误差目标的结果数量可用于 评价此方法在该浓度是否合适. 23 20-1000个检测值符合超出LoB预期95%比例 的下限 检测数 观察比例的下限(%)检测数 观察比例的下限(%） 20 85 30 87 40 88 50 88 60 88 70 89 80 89 90 90 100 90 150 91 200 92 250 92 300 92 400 93 500 93 1000 94 24 分析测量范围:概念 分析测量范围(线性范围):指患者样本未经任何处理( 稀释、浓缩或其他预处理),由检测系统直接测量得到 的可靠结果范围,在此范围内一系列不同样本分析物的 测量值与其实际浓度(真值)呈线性比例关系. 临床可报告范围:指定量检测项目向临床能报告的检测 范围,患者样本可经稀释、浓缩或其他预处理. 线性:检测样本时,在一定范围内可以直接按比例关系 得出分析物含量的能力. 25 实验样品准备 选择与临床样本同样的基质,不含干扰物质; 或厂家推荐的产品 数量 验证实验:5-7个不同浓度的样本,高值样本应高于 线性上限30%,低值样本低于线性下限, 26 实验方法 上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,按试 剂说明书操作,将每一浓度样本重复检测2次,计算线性 相关系数 27 结果判断 线性范围应符合制造商规定的要求,且线性相 关系数|r|0.97 28 定性检测项目的性能验证 29 两种方法 诊断明确的定性检测性能评估:灵敏度、特异性 诊断不明确的定性检测性能评估:结果的一致性, Kappa值表示 30 诊断明确的定性检测 比较方法:目前正在使用的、”金标准”方法、某种定 量方法或临床诊断 样本要求:量足够大,稳定 样本数量:取决于评价者的目的 结果不一样标本的处理:用金标准或参考方法明确结果 31 检测方法与明确诊断比较2*2列联表 检测方法 明确诊断 阳性 阴性 总数 阳性 A B A+B 阴性 C D C+D 总数 A+C B+D A+B+C+D 灵敏度灵敏度=100%=100%A/(A+C) A/(A+C) 特异性特异性=100%=100%B/(B+D)B/(B+D) 阳性预测值阳性预测值=100%=100%A/(A+B)A/(A+B) 阴性预测值阴性预测值=100%=100%A/(A+C)A/(A+C) 检验效能检验效能=100%(=100%(A+D)/NA+D)/N 32 诊断不明确的定性检测项目性能评估 检测方法、可比较方法一致程度比较 可比较方法 检测方法 阳性 阴性 总计 阳性 a b a+b 阴性 c d c+d 总计 a+c b+d n 一致程度百分比一致程度百分比= = 100%(a+d)/n100%(a+d)/n KappaKappa值值0.7