第五章 干细胞工程

第五章：干第五章：干细细胞工程胞工程 主要知识点： 干细胞的基本概念 干细胞的类型 胚胎干细胞系 成体干细胞 干细胞与组织工程 人类干细胞研究的应用 教学内容： 一、干一、干细细胞的基本概念胞的基本概念 干细胞： 具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。 全能干全能干细细胞：胞： 包括胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES 细胞）, 早期胚胎（4-5 天）胚泡中内细胞群（inner cell mass, ICM），生殖干细胞（embryonic germ cells, EG 细胞），具有全能性，能分化成全身 200 多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 多能干多能干细细胞：胞： 具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体 的能力。如：内、中、外三个胚层的各种细胞。 专专能干能干细细胞：胞： 多能干细胞进一步分化成具有专门功能细胞的干细胞。如：造血 2 干细胞、皮肤干细胞、神经干细胞等。专能干细胞又分化为定向干细 胞，如：造血干细胞可分化为红细胞系定向干细胞、粒细胞系定向干 细胞 胚胎生殖胚胎生殖细细胞胞(embryonic germ cell, EG cell ) ： ： 来自于早期胚胎（5-10 周）胎儿生殖嵴的原生殖细胞，也属于全 能干细胞。但与胚胎干细胞在特征上并不相同。 成体干成体干细细胞胞(somatic)： ： 出现在已特化的组织中的未分化或未特化的细胞，能够自我更新， 并且产生它来源的所有特化类型的组织细胞，通常成体干细胞分裂产 生祖细胞，后者分化成熟为组织细胞。 可塑性可塑性(plasticity)： ： 一种组织类型的干细胞转化为另一种组织类型的细胞的能力。 畸胎瘤畸胎瘤细细胞（胞（embryonic carcinoma cell, EC cell)： ： 3 源于胚胎组织，保留胚胎组织特点的肿瘤。 祖祖细细胞胞(progenitor cell)： ： 存在于胎儿或成体组织中，部分地特化化，分裂产生继续分裂的 祖细胞或分化的细胞。 二、干细胞的分类 按分化潜能大小来分类: 全能干细胞（ Totipotent stem cell ）： 它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。 多能干细胞（ pluripotent stem cell ）： 具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的 能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞 。 专能干细胞（ multipotent stem cell ）， 这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化， 如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。 根据来源来分: 来源于胚胎- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体- 成体干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ） 4 根据干细胞组织发生的名称进行分类: 胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞 胰腺干细胞 三、胚胎干细胞 1、来源： (1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞 ES 细胞 (2) 从 5-9 周的胚胎生殖腺中分离出人的 EG 细胞（embryonic germinate cells） (3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞（embryonal carcinoma, EC) (4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT） 5 2、胚胎干细胞的分离 酶消化 免疫方法去除滋养层细胞 流式细胞仪分离法 3、培养条件： (1) 特殊的培养液： 用 DMEM 培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加 非必须氨基酸；-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入 LIF，抑制细胞分化。 4、胚胎干细胞诱导分化 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如 VGEF、bFGF 、DMSO 和 RA 等 （2）将 ES 细胞与特定的细胞共培养 6 （3）将某种分化诱导因子的基因转入 ES 细胞内 5. ES 细胞的全能性主要体现在以下几方面： 形成畸胎瘤。将 ES 细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包 括三个胚层细胞； 形成类胚体。培养 ES 细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制 增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种 系混杂的集合体、具有三个胚层组织； 直接分化。通过控制 ES 细胞生长环境，或遗传操纵特定基因 表达，ES 细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因 NeuroD2 和 NeuroD3 转人 ES 细胞，可使之分化为神经细胞； 形成嵌合体。将 ES 细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形 成嵌合体（chimera），ES 细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的 发育。这是检验一个细胞系是否为 ES 细胞的标准。 6、ES 细胞的应用前景及面临的难题 ES 细细胞的胞的应应用前景：用前景： 研究哺乳动物个体发生发育规律 研究细胞分化 研究基因功能 生产转基因动物 ES 细胞治疗性克隆 研究细胞癌变机理及新药物的筛选 ES 研究面研究面临临的的难题难题 7 （1）体外培养 ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。 如何平衡这一对矛盾, 必须筛选适宜的培养条件。目前在 ES 细胞研 究中存在着建系成功率也不高等问题, 只在小鼠中建立了稳定的 ES 细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。 （2）ES 细胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用 ES 细胞进行治疗前必须首先体外诱导 ES 细胞分化产生某种特异的组 织细胞或设计自杀基因, 当移植的细胞向肿瘤发展时, 自杀基因能启 动自毁机制使其凋亡。但如何诱导 ES 细胞定向分化成单一类型的分 化细胞, 是至今仍未解决的难题。 （3）ES 细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官 的形成是一个非常复杂的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组 织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官, 要离 体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到, 器官的体外保存 和维持仍是器官移植中的难题。 （4）最大的障碍来自于伦理学问题，特别是 ES 细胞应用受到伦理、法 律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类 ES 细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看， 人类 ES 细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面 影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到 ES 细胞对临床医学及 生物学理论研究的重要作用。 四、成体干细胞 没有证据表明成体干细胞是多能干细胞 8 成体干细胞稀少，难以识别与纯化，也难以在培养条件下在未分 化状态保持长时间增殖，或能够保持长时间增殖时，又不定向分化。 来源：来源： 成体内的干细胞：多为专能干细胞。如造血干细胞、皮肤干细胞等。 脐带血干细胞：新生儿脐带血内含有丰富的干细胞，可以用来进行干 细胞的培养和移植。 胎盘组织：美国新泽西州的“人类创造”生物技术公司报道他们从人胎 盘中分离出干细胞。 造血干造血干细细胞作胞作为为干干细细胞研究与胞研究与应应用的突破口用的突破口 1. 造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。 2. 造血干祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清 楚，细胞表型特征可进行定量分析，且可分选。 3. 造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因 子、受体、信号转导、微环境等因素较为清楚。 4. 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、 神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因 此便于直接应用于临床。 9 干细胞名称干细胞名称StemStem cellcell nicheniche干细胞标志干细胞标志分化细胞标志分化细胞标志分化促进因子分化促进因子 神经祖细胞 神经干细胞 侧脑室室管膜 细胞 巢素蛋白 CD133 微管结合蛋白-2 神经胶质原纤维 酸性蛋白GFAP 表皮生长因子 成纤维细胞生 长因子 表皮干细胞 毛囊干细胞 基底细胞角蛋白15K5、K14Wnt 肠干细胞肠腺基部及近 基部 K8、 K18、 K19 肝干细胞Hering管 门管区胆管周 围 卵圆细胞： OV-6、c- kit、CD34、A FP 小肝细胞： 间充质干细胞骨髓窦的内腔 面 SH2、SH3、CD 29、CD44、CD 71、CD99、CD 106 多种组织标志 （如骨形态发生 蛋白受体- BMPR） 多种诱导因素 造血干细胞骨髓、脐带血、 外周血 CD34+、CD38- 、 c-kit 五、干细胞与组织工程 组织工程是指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常 或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机制，研究开发能 够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。 组织工程化皮肤 组织工程化骨骼 组织工程化血管 组织工程化管状器官 组织工程化腺体器官 六、人六、人类类干干细细胞研究的胞研究的应应用用 基基础础研究方面研究方面 .研究动物胚胎的发生发育 10 利用转基因技术研究动物内分泌功能的关系 研究激素与控制生物发育基因的关系 寻找与生长发育有关的基因 研究细胞分化机制 研究干细胞在胚胎发育过程中的功能 .研究疾病的发生机制和发展过程 研究肿瘤的形成过程 建立人类遗传病研究的动物模型 动物抗病育种 应应用研究方面用研究方面 1.生产克隆动物：提高良种家畜的繁殖效率；抢救濒危动物；创造新物 种；实验生物学的新材料。 2.生产转基因动物：提高畜产品产量；生产药用蛋白；动物抗病育种。 3.生产用于人类器官移植的动物器官：如生产含人基因的猪，为人类 提供器官移植材料，修复更换 丧失功能的组织和器官。 4.用于新药的发现及筛选：用多能干细胞定向培育出某种组织，对新 药的药理、药效、毒理及药物代谢等进行 研究。 5.治疗性克隆：通过 ESC 定向分化，培育出皮肤、肌肉、神经、软骨等 组织及至心脏、肝脏、肾脏、胰腺等器官，人体的任何 器官和组织一旦出现故障，就可以象修理损坏的机器 11 零件一样随意更换和修复。 干干细细胞的胞的产业产业化化 目前世界上干细胞产业化已起步，美国有家进行脐带血研究 的生物企业。法国、日本、意大利等国建立了脐血干细胞库。协和干细 胞基因工程有限公司是我国第一个国家级干细胞产业化基地。 七、有关干细胞的若干问题 1. ES 细胞与 EG 细胞在体外增殖而不分化的机制 2. 干细胞分化的内部机制 3. 通用的干细胞在哪儿 4. 有多少（组织）成体干细胞？成体干细胞的可塑性？ 5. 怎样使干细胞定位于受损的组织或器官？ 6. 干细胞通常居住在什么地方？ 7. 是否多能干细胞必须经祖细胞才能特化为成熟细胞？ 8. 祖细胞是移植质量的最适当细胞？ 9. 为什么当周围的细胞都已经分化，而成体干细胞可以保持未分化 状态？ 作业: 1. 名词解释: 干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。 12 全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES 细胞）, 早期 胚胎（4-5 天）胚泡中内细胞群（inner cell mass, ICM），生殖干细胞 （embryonic germ cells, EG 细胞），具有全能性，能分化成全身 200 多 种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成 完整个体的能力。如：内、中、外三个胚层的各种细胞。 专能干细胞：多能干细胞进一步分化成具有专门功能细胞的干细胞。 如：造血干细胞、皮肤干细胞、神经干细胞等。专能干细胞又分化为定 向干细胞，如：造血干细胞可分化为红细胞系定向干细胞、粒细胞系 定向干细胞 2. 干细胞的分类 按分化潜能大小来分类: 全能干细胞（ Totipotent stem cell ）： 它具有形成完整个 体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。 多能干细胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞 。 专能干细胞（ multipotent stem cell ），这类干细