热休克蛋白与热休克反应

热休克蛋白与热休克反应热休克蛋白与热休克反应 (一一)* * 王晓临（综述） 青海大学附属医院 徐存栓（审校） 河南师范大学科技部重点实验室 张宝琛（审校） 中国科学院西北高原生物研究所 摘要摘要 热休克蛋白是生物体在不良环境刺激后产生的一种特殊蛋白质，称为应激蛋白或 分子伴侣，其中 HSP70具有重要的细胞作用，如抗逆性，分子伴侣及抗氧化。各种应激因 子引起的应激反应被称为热休克反应, 是一种以基因表达和调控变化为主的细胞应激反应。 本文重点介绍 HSP70的分类、结构、基因调控及功能。 关键词关键词：热休克蛋白、热休克反应、应激、HSP70 中图分类号中图分类号 R33 文献码：文献码：A Heat shock protein and Heat shock Response (一) Wang XiaoLin（Summarize） : Affiliated Hospital of Medical College with QingHai University Xu Cunshuan （Review） National Key Laboratory of Ministry of Technological of China, Henan Normal University ZhangBaochen（Review） Northwest Plateau institute of Biology, the Chinese Academy of sciences Abstract objective: The heat shock protein is a special protein that produces by organism from stimulation in hard environment. Heat shock protein70 have important function with cells, for example, hard environment resistance, chaperones. And oxidation-proof Kinds of stress factor cause stress response, Heat shock response is a stress response from gene express and regulation level. The article introduces classification, structure, gene regulation and function with HSP70. Key words: Heat Shock protein Heat Shock response Stress HSP70. 2 1.引言引言 1962 年 Ritossa 等把黑腹果蝇幼虫暴露 3032oC 的环境中，30min 后发现巨大的唾液腺染色体上出现 了新的膨突，当温度恢复到正常时，其他部位才出现类似的膨突，这些独立的膨突部位的基因具有活跃的 转录活性 1。1974 年 Tissieres 和他的同事发现，经多年研究发现，生物体细胞在环境温度突然升高时， 细胞内某一蛋白质的表达迅速增加,合成了一组特殊的蛋白质, 会产生一种非常相似的反应，这一现象及 期间的产物分别被称为热休克反应（heat shock respond HSR）和热休克蛋白（heat shock proteins HSPs）2, 研究人员发现热休克反应除能被热损伤诱导外，还能被其他因素诱导，如氨基酸类似物、各种中 金属、代谢性毒物、缺氧、损伤等。目前将各种应激因子引起的热休克反应称为应激反应（stress response） ，是以基因表达和调控方面变化为主的细胞应激反应，热休克蛋白被称为应激蛋白（stress proteins）3 热休克反应的特点是在短暂的环境温度升高（40-45oC）下观察组织和细胞的变化得来的。1992 年 Burel mRNA 被优先翻译，发现不同分子量的热休克蛋白在细胞内的不同部位堆积。细胞对于抵抗强烈 的热损伤是必须的，但却是短暂的 4。 热休克反应有如下特点：普遍性，所有的原核和真核生物都有热休克反应；保守性，不同物 种有同源性很高的热休克蛋白；热休克反应时热休克蛋白的合成迅速增加而原有的蛋白合成减少；除 热损伤以外的各种刺激如缺氧，缺血，各种物理化学损伤，肿瘤等均可诱导热休克蛋白。 2.2.热休克蛋白的分类和结构热休克蛋白的分类和结构 各种生物的 HSPs 及其编码基因具有高度的保守性，人类与细胞的 HSPs 具有 50%以上的同源性 5。哺乳动物中 5 种不同种系的细胞热休克后和 HSPs的表达方式相似3。 应激蛋白的调节模式,分为两大类： HSPs 和调节糖蛋白（glucose-regulated proteins，GRPs） 。按分 子量大小和诱导进行分类，在哺乳动物细胞中，HSPs 分为 8（泛素） 、10、28、32、47、60、70、90 和 110kPa（表 1） 。饥饿时 GRPs 诱导表达增加，主要为 75、78、94 和 170kDa 四大类。 表 1 哺乳动物细胞中的热休克蛋白 3.10.14 分号定位特性细菌类似物 3 HSP110 HSP90 HSP70 HSP60 HSP47 HSP32 HSP28 HSP10 细胞浆 细胞核、核仁 细胞浆 细胞浆 细胞核，核仁 线粒体 内质网 细胞浆 高尔基体 细胞核 线粒体 细胞浆 正常细胞成分、促进热休克后核仁功能的恢复 正常细胞成分，与类固醇受体及肌动蛋白结合，发挥调节作用 HSP73-丰富的细胞蛋白，与 ATP 有高亲和力 HSP72-正常细胞蛋白，被热诱导，表达受细胞周期调控，与 ATP 有高亲和力 正常线粒体蛋白、促进单体蛋白的折叠和装配 膜糖蛋白，与胶原有高亲和力 血红素氧合酶，被紫外线及 H202 诱导 正常细胞成分，磷酸化水平依赖于细胞增殖的刺激 热休克时高尔基提转移至细胞核内 正常线粒体蛋白，参与线粒体蛋白的装配 正常细胞蛋白，维持染色体结构，与非溶酶体性蛋白降解有关 Dnak GroEL GroES Morimoro 将热休克蛋白分为四个家族：HSP90 家族（83-90KD） ，HSP70 家族（66-78KD） ，HSP60 家族, 小 HSP 家族 6。分子量 70KD 的热休克蛋白（诱导型）在正常细胞中水平较低，在应激状态下可明显升高 7，是热休克蛋白研究中最多的一种。尤其是对 HSP70 家族的结构、功能以及表达调控机理的研究较多， 正常情况下 HSP70 位于胞浆内，受到热休克刺激时，核内 HSP70 迅速增加，浆内只有少量存在，细胞处 于恢复阶段时，核内的 HSP70 消失，浆内仍有低水平 HSP70 表达 8。HSP70 家族在细胞内的分布不同， 但均有与核苷酸结合的特性，特别是与 ADP 或 ATP 结合 9。它包括四类蛋白质，一类为 HSP73，是哺乳 动物细胞内的结构蛋白，属结构型 HSP70，称为 HSP70 同源蛋白（HSC70） ，热刺激后只有少量增加。二 类为 HSP72，正常细胞内也有少量表达，细胞发生应激后，表达迅速增加，属诱导型 HSP70。HSP72 和 HSP73 具有高度的序列同源性（95%）和相同的生化特点.5.。三类为 GRP78，四类为 GRP75。HSP 家族的 生化特点为：（1）氨基端具有弱的 ATPase 活性，与肌肉的肌动蛋白结构很相似；（2）当 ATPase 被激 活时，可与伸展的多肽结合；（3）保护各种酶免受损伤，使聚合的蛋白质解聚 10。 HSP70 家族由分子量为 68KD，70KD，72KD，及 78KD 的热休克蛋白组成。特点:分子量相近，等电点 PH5.2-6.3 之间，存在于每个细胞中,HSP70 是生物体中最保守蛋白之一 11。原核细胞和真核细胞的 HSP70 的氨基酸序列有 45%的同源性，表明了 HSP70 家族在生理活动中的重要性。HSP70 都有“卷线样”构象段， 如其它蛋白有绞链部分（如肌球蛋白）一样，是 ATP 依赖的构象。ATP 结合蛋白现已成为热休克蛋白中最 特殊和研究最多的一种 蛋白 12。 3.HSP70 反应的调节及基因表达反应的调节及基因表达 .细胞受到热休克刺激时，HSP 由无活性转变为刺激转录的形式。人类和果蝇的 HSF 只在热休克时才 与 DNA 结合，需 HSF 首先获得与 DNA 结合的能力，才能激活 HSP 基因的启动子。热休克后人类 HSF 会发生磷酸化。有两条途径可以激活 HSF，第一条是：HSF 单体聚合成寡聚体，形成 HSF 复合物与 HSEs 结合；第二条是：HSF 磷酸化形成具有转录活性的复合物。HSF 与 HSEs 结合后，启动 HSP 基因转录 10。 在原核生物和真核生物中热休克反应有不同的调节机制。原核生物中，细胞内的热休克启动因子 可被识别-包含有一个 32RNA 的聚会酶,它不仅直接将转录装置作用与 Hsp70 的启动子，并直接调节 Hsp70mRNA 转录的数量。Hsp70 的编码基因 5 端含有一段 14 对碱基的保守序列，对 Hsp70mRNA 的转录 有启动作用。热休克启动因子是无活性的，在高温下能被激活。热休克反应时，热休克蛋白的变化取决于 转录和翻译水平。转录调控由热休克转录因子（heat shock transcriptional factors HSF）决定，且能识别热 4 休克元件（heat shock ele ment HSE）的靶序列。常位于编码部位的上游，蕴涵在 Hsp70 基因的启动部分， 以 5 个碱基为单位的重复排列而成，是 Hsp70 转录成功的必要因子。热休克时 HSF 结合于 HSE 的蛋白质 因子上, 具有共同结构：一个 N 末端 DNA 结合域，相邻的和位于羟基末端的脂肪族氨基酸组成的单位-亮 氨酸拉链结构。在正常细胞中，HSF 与 HSE 的结合水平低；热休克时 HSF 与 HSE 结合迅速增加，5 分钟 内达到高水平，约为热休克前的 1020 倍，保证了热休克蛋白的高效转录 14.15。 当温度高于细胞生长温度 28oC 时，细胞内 hsp 基因转录迅速增加， HSP 的 mRNA 选择性转录， HSP 迅速选择性地积聚在细胞内。应激时,HSP 基因的激活机制在进化上是非常保守的，真核细胞 HSP 基 因的转录调节过程包括 1).热休克因子（heat shock factor，HSF）的激活、2).HSF 与热休克元件（heat shock elements，HSEs）的结合 3).HSP 基因的转录等三个步骤 10。 热休克元件（HSEs） HSEs 是位于 HSP 基因 5 端上游的一段特殊 DNA 序列，由 5 个碱基（NGAAN）为基本单位重复 排列而成，N 代表在进化上保守性较差但非常重要的碱基。HSE 最少有两个“NGAAN”单位，才对 HSF 有较强的结合力,连接方式有两种:1).头-头相连（NGAANNTTCN） ，2).尾-尾相连（NTTCNNGAAN）10。 热休克时，结合增加，五分钟即达高峰，比热休克前高将近 20 倍。刺激持续存在，这种结合活性的高峰 状态可以维持 1h，去除热休克刺激后，结合活性恢复至原来的低水平状态 15。 热休克因子（HSFs） 实验发现酵母菌和果蝇的 HSFs 与 DNA 结合时可结合蛋白质三聚体，当 HSF 与 HSE 结合时， HSF 多聚体的每一个亚单位分别与 HSE 的一个“NGAAN”单位结合。用克隆技术可以分离出两种 HSF 蛋白。 热休克蛋白的基因结构 人类 HSP70 基因，没有内含子，由 2440 个核苷酸组成，5，端上游含“TATA 盒子” （真核细胞启动子的 一个元件，距离转录起始位约 30 个核苷酸）和 HSE（两个头-头相连的 NGAAN 单位组成，距离转录起始 位约 79 个核苷酸） 。 .4.热休克蛋白的功能热休克蛋白的功能 1).使细胞的功能稳定，有保护细胞的作用。研究表明:细胞在受到各种应激，如高热，缺氧时，产 生的 HSP70 可以增强细胞对下一次损伤的耐受，维持细胞的正常代谢，提高生存率 16.19。HSP70 与耐热 性有关。2).使细胞过量表达重组 HSP70 的能使细胞获得热耐受性。如 Li 等将重组入诱导型 HSP70 基因转 入鼠成纤维细胞，发现 HSP70 表达增加，成纤维细胞对热的抗性增加 16; 2).竞争性抑制细胞内 Hsp70 的基 因表达或向细胞内注射 HSP70 抗体后，使细胞产生更高的热敏感性，降低细胞的存活率。HSP70 对热休 克后细胞的复原也是重要的 17。热休克诱导细胞产生 HSP70 不仅增加细胞对该刺激的耐受性，而且使细 胞对其它应激源刺激的耐受性增加。这就是 HSP70 的“交叉保护作用” 。Karmozyn 发现热休克后的小鼠 较没有经过热休克刺激的小鼠，心肌局部缺血再灌注后，左心室功能恢复较快，心肌收缩力和心率恢复较 快，心肌肌酸激酶释放较少 18。HSP70 的细胞保护作用机理尚不清楚。实验已证明在应激时 HSP70 以高 浓度集聚在染色体和核质内，并以特殊方式与解聚染色质相互作用，防止染色质和 hnRNA 复合物降解。 研究表明 HSP70（或羟基端部分的碎片）具有保护细胞免遭应激损伤作用，而氨基端的蛋白碎片无此效应； 且只有 HSP70 完整表达，才能降低热休克时的翻译抑制程度，才能最有效的加速转录和翻译抑制的恢复， 说明 HSP70 对细胞的抗损伤能力非常重要 20。 应激反应是细胞的基本防御反应，临床上开始将 HSPs 用于判断组织和器官在缺血和再灌注损伤 时的损伤程度 1,3。例如：短暂缺血后，大脑 HSPs 在某些区域表达增加，缺血后细胞存活能力与细胞内 HSPs 的表达增加呈正比。短暂的脑缺血后，诱导型 HSP72 在齿状核颗粒细胞和海马 CA3 区细胞内明显增 多，这两个区域的细胞是脑组织内缺血性损伤后存活率最高的部位。应激状态下，生理状态不同 HSP70 5 的表达有所差别。Nitta 和 Heydari 发现，随着机体衰老和细胞的老化，HSP70mRNA 水平, HSP70 的功能 （如与底物结合的活性）及合成均减低，生理老化使机体对环境应激的反应能力下降， HSP70 表达的改 变不仅是机体衰老或细胞老化的一个重要因素，也可以是判断细胞状态和应激能力的一个标准 21。 .细胞内的蛋白质为完成其生物学功能，其肽链需经正确的折叠、加工、定位于细胞内的合适位置， 有时还须与其它多肽链形成复合体。细胞浆内蛋白质的浓度很高，从核糖体上新合成的多肽链在其成熟过 程中会与其它蛋白质的结构域发生结合，为防止蛋白质的错误折叠，应避免成熟前蛋白质结构域之间的接 触。蛋白质在穿过生物膜时，需要伸展结构，因此，在细胞内需要一些具有“伴侣”活性的因子来维持蛋 白质的伸展状态并阻止其错误结合。研究发现，正常情况下 HSPs 从 3 个方面来维持和保护新合成蛋白质 的伸展状态：（1）防止新合成蛋白质的错误折叠或聚集；（2）允许其穿过生物膜;（3）使蛋白质正确折 叠并形成寡聚体。在应激状态下，HSPs 可防止其他蛋白质发生变性或解聚，使恢复活性，一般将 HSPs 称为分子伴侣 3.10。HSP70 是主要的分子伴侣，在细胞内的分布最广，含量最丰富3.10。 研究证实 HSP70 对于蛋白质穿过内质网和线粒体膜的转运过程是必需的。正常情况下，HSP72/HSP73 也 参与蛋白质成熟过程的早期阶段。新合成的蛋白质与 HSP72/HSP73 形成复合体，促进蛋白质的有序折叠， 这种结合是短暂的，ATP 的参与，15min-30min 后，新合成的蛋白质与 HSP72/HSP73 解离。在应激状态 下，HSP72/HSP73 与蛋白质之间的结合时间较久 3.10。 .HSP70 还有抗细胞凋亡。有害应激包括热休克，氧化应激等可以导致细胞程序性死亡，即凋亡。 应激诱导的细胞凋亡需要激活细胞内应激激酶（JNK） 。研究发现细胞内 HSP70 水平增高可以通过阻断信 号通路，抑制应激诱导的 JNK 激活，从而减少细胞的凋亡。HSP70 还能抑制应激 P38（HOG1）的活性。 所以，在应激状态下，细胞内 HSP70 家族基因表达增加，可抑制应激激酶激活，防止细胞凋亡，可能是 HSP70 增加细胞热耐受性的机制之一 14.。 果蝇 HSP28 的表达受类固醇激素的控制，处于静止期的哺乳类动物细胞结构型 HSP28 的表达受生 长的调控，即受蛋白质增加的相对量的控制 3。乳腺癌细胞 HSP28 的表达增加与雌激素有关。研究发现： 细胞处于有丝分裂期或经钙离子载体及致癌物质的处理后，HSP28 磷酸化迅速增加。 在生理状态下，HSP72 的表达也受细胞周期的调控，处于 G1 和 S 期交界区的非应激细胞 HSP72 大 量表达。转染 myc 或 EIA 等癌基因的人体细胞其 HSP72 表达增强。此外，还发现 HSP72 与细胞癌基因蛋白 P53，特别是变异型 P53 蛋白，互相作用。目前认为 HSP72 对于这些病毒或细胞癌基因产物的功能可能具 有重要作用，他们之间的相互联系代表着 HSP 的“保护”和“清楚”功能 16。 类固醇受体家族中的许多成员如孕酮、睾酮和糖皮质激素受体等与 HSP90 结合成复合物，以一种 无活性状态（8S/9S）存在于细胞内，不能与 DNA 结合启动激素特异性的基因表达。一般认为，HSP90 与 类固醇受体形成复合物后，除具有防止受体与靶基因之间不适宜结合的作用外，也是受体完成正确折叠和 装配过程中的一个必须进行的前期步骤 16。总之，HSP90 可与细胞内的许多蛋白质结合，通过抑制或刺激 靶蛋白的活性，对靶蛋白的功能发挥调节作用。 5.结论结论 热休克蛋白是高度保守的蛋白质，其基因也具有高度保守性，热休克蛋白既参与细胞的正常生理 过程，又对外环境变化或刺激所作出应答或防御反应。不同种类的热休克蛋白功能各异，在执行某些功能 时又相互协作，如作为“分子伴侣” ，数种热休克蛋白均参与细胞内新合成蛋白质的折叠、加工及转运。 从分子水平上研究热休克蛋白的调控机制有助于进一步阐明细胞的生理过程，为了解细胞的应激、病变状 态下的分子调节机制打下基础。 6.参考文献：参考文献： 6 1. Ritossa, F A new puffing patten induced by temperature shock and DNp in Drosophila Experientia 1962 13:571 573. 2. Tissieres A Mitchell, H, K and Tracy, v ,M protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromoso me puffs J Molec Biol 1974 84:389389 3.Welch WJMammalian guess response：ceil physiology，structurefunction of stress proteins，and implications for medicine end diseasePhysiol Rev，1992。72：1063-1081 4. Bure C Mezger v Ma m malian heat shock protein fa milites Expression and function Experienta 1992 48:621643 5 Mori mot o RT, Tissiers A The stress response function of the proteins and perspectives :stress proteins in biology Me dicine Col d spring Harbor:Press 1990136. 6 Santoro M. G,Morimoto RI., Stress-inducedresponsesand heat shock proeins:newpharmacologicalfor cytoprotection.Nature, Biotechnology1998,16:533-538 7.Craig EAThe heat shock responseCRC Crit Rey Biochem，198518：239280. 8. Velazquez JM,Lindquist S。Hsp70：nuclear concentration during environmental stress and cytoplsmic storage during recoveryCell 198436：655662. 9.Welch WEFemnd8C0 JRRapid purification of malian 70,000 一 dalton stress proteins：afi3nJty of the proteins for nucleotides. Cell Bid1985.5：1229-1237. 10.Burdon RHHeat shock proteins in relation to medicineMol Meal, 1993,14:3-l65. 11 Bukau B, Harwich, A L., The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines, J.Cell, 1998,92 (3):351.366. 12. Boorstein, W ,R Ziegelhoffer, T Molecular evolution of the hsp 70 multigene fa mily j, Mol Evo 138(1):117 13. Ling M S., The molecular companion HSP70 research progresses, overseas medicine molecular biology fascicle, 1,993, 15 (5): 227-230. 14.Baler R,Dah; G Activation of hu man heat shock genes is accompanied by oligomerization, mo dification, and rapid transloaiton if heat shok transcription asctor HSEI .MolCe