食用菌多糖抗氧化性的研究 毕业论文.doc

学学 士士 学学 位位 论论 文文 论文题目：论文题目：食用菌多糖抗氧化性的研究食用菌多糖抗氧化性的研究 姓名 院系化学与材料科学院化学与材料科学院 专业化学（师范类）化学（师范类） 年级2003 级级 学号0324220326 指导教师 独创声明独创声明 本人郑重声明：所呈交的毕业论文（设计） ，是本人在指导老师的指导下，独立进行 研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。尽我所知，除文中已经注明引用的 内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式表明。 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 二 00 年 月 日 毕业论文（设计）使用授权说明毕业论文（设计）使用授权说明 本人完全了解鲁东大学关于收集、保存、使用毕业论文（设计）的规定。 本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的 印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其他复制手段保存论文（设计） ；同意学校在不 以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布论文（设计）的部分或全 部内容，允许他人依法合理使用。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者（签名）： 二 00 年 月 日 a.2 毕业论文毕业论文( (设计设计) )选题报告选题报告 姓名 性别女学院化学年级 03 学 分 学号 0324220326 论文题目 食用菌多糖抗氧化性能研究 课题来源 自选 课题类别 论文 选做本课题的原因及条件分析： 人们研究发现食用菌具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，抗氧化，降血脂，提高 机体免疫力，减少各种放疗化疗的毒副作用等生理功能。而食用菌的这些生理作 用与其所含的多糖有密切的关系。 实验采用能够产生羟基自由基 fenton 体系和产生超氧阴离子自由基的邻苯三 酚自氧化体系，用分光光度计测定食用菌多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基 的清除作用 指导教师意见： 所选论文题目的研究内容，具有较高的应用价值和实际意义。 同意选做该题目。 签名： 2006 年 11 月 27 日 学院毕业论文（设计）领导小组意见： （签章） 年 月 日 b 指导教师用表 毕业论文（设计）任务下达书毕业论文（设计）任务下达书 学院 化学 专业 化学（师范类） 学号 0324220326 姓名 现将毕业论文（设计）任务下达书发给你。毕业论文（设计）任务下达 书内容如下： 一、 毕业论文（设计）题目 食用菌多糖抗氧化性能研究 二、 主要内容 从食用菌子实体中提取粗多糖；食用菌多糖清除羟自由基能力的研究； 食用菌多糖清除超氧阴离子自由基能力的研究。 三、 具体要求 掌握分光光度计的原理和操作方法； 能够熟练而准确地进行常用分析操作； 能够阅读英文文献。 四、 主要参考文献 1、徐向荣,王文华,李华斌.羟自由基的测定方法j.中国卫生检验杂志,1997,7（5）:311313 2、 张宏,谭竹钧. 四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较.内蒙古大学学报 （自然科学版）,2002,33（6）:677681 五、 进程安排 阶 段起 止 日 期主 要 内 容 第一阶段12.4-12.11查阅相关文献资料，确定实验方法 第二阶段12.11-1.10食用菌多糖清除超氧阴离子自由基试验 第三阶段1.10-1.25食用菌多糖清除羟自由基试验 第四阶段1.25-1.30撰写论文 六、本毕业设计（论文）任务下达书于 2006 年 12 月 4 日发出。毕业 设计（论文）应于 2007 年 1 月 30 日前完成后交指导教师，由指导教师 评阅后提交毕业论文（设计）答辩委员会。 七、毕业设计（论文）任务下达书一式两份，一份给学生，一份留学院 存档。 指导教师： 签发于 2006 年 12 月 3 日 分管院长（主 任）： 签发于 200 年 月 日 a.3 毕业论文毕业论文( (设计设计) )开题报告开题报告 姓名 性别女学院化学年级 03 学 分 学号 0324220326 预计完 成时间 11 月 15 日 至 1 月 25 日 论文题目 食用菌多糖抗氧化性能研究 课题来源 自选 课题类别 论文 指导教师 姜华 毕业论文（设计）实施方案： 首先通过查阅文献资料，确定采用热水浸提的方法提取食用菌粗多糖；然后采用分 光光度法利用改进了的 fenton 反应体系测定食用菌粗多糖对羟基自由基的清除作用， 通过粗多糖对邻苯三酚自氧化过程的影响测定多糖清除超氧阴离子自由基的能力，并与 具有抗氧化作用的维生素 c 对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用作为对比。 论文（设计）主要内容（提纲）： 1、食用菌多糖抗氧化能力的测定方法及多糖抗氧化能力的研究进展。 2、实验部分：食用菌粗多糖的提取；食用菌多糖清除羟基自由基能力的测定； 多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定。 3、结果与讨论：不同食用多糖清除羟基自由基能力的比较；不同食用菌多糖清除 超氧阴离子自由基能力的比较。 指导教师意见： 实验方案设计合理，实验内容全面具体，同意开题。 签名： 2006 年 12 月 10 日 （签章） 年 月 日 学院毕业论文（设计）领导小组意见： （公章） 年 月 日 （签章） 年 月 日 a.4 毕业论文毕业论文( (设计设计) )结题报告结题报告 姓名 性别女学院化学年级 03 学分学号 0324220326 论文（设计）题目 食用菌多糖抗氧化性能研究 课题来源 自选 课题类别 论文 指导教师 姜华 本课题完成情况介绍（包括研究过程、实验过程、结果分析、存在的问题及应用情况等。 ） 本文以香菇、木耳、裙带菜、真姬菇为原料提取粗多糖，并通过改进了的 fenton 反应和邻苯三 酚自氧化反应，以维生素 c 和甘露醇为对照，测定了这几种多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由 基的能力，对其抗氧化性进行了研究。实验结果表明，香菇、木耳、裙带菜、真姬菇等粗多糖对羟 基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，其中羟基自由基清除率达 50%时香菇粗多糖浓 度为 199g/ml，木耳为 149g/ml，裙带菜为 263g/ml。相同浓度的多糖溶液清除超氧阴离子自 由基的能力大小依次是木耳粗多糖、香菇粗多糖、裙带菜粗多糖。 指导教师意见： 签名： 2007 年 3 月 12 日 （签章） 年 月 日 学院毕业论文（设计）领导小组意见： （公章） 年 月 日 （签章） 年 月 日 论文（设计） 成绩 d.3 毕业论文（设计）答辩成绩评分表 （答辩委员会用表） 学院 化学与材料科学学院 学号 0324220326 姓名 评 分 评价内容具 体 要 求分值 abcde 报告内容 思路清晰；语言表达准确，概念清楚， 论点正确；实验方法科学，分析归纳合 理；结构严谨；论文结果有应用价值。 505045403530 创 新 对前人工作有改进或突破，或有独特见 解。 10109876 答 辩 回答问题有理论根据，基本概念清楚， 主要问题回答准确、有深度。 303027242118 报告时间 符合要求。 10109876 总分 答辩委员会委员（小组）签名： 、 、 、 、 d.4 毕业论文（设计）答辩情况记录表 学院：化学与材料科学学院 答辩日期： 2007 年 3 月 日 姓名 性别女专业化学年级03 级学分学号 0324220326 论文（设计） 题目 食用菌抗氧化性能的研究 答辩时间时 分至 时 分答辩地点 记录人 答辩委员会（小组）出席情况： 主任（组长）签名： 委员（成员）签名： 答辩记录：（所提出问题及对问题答辩要点） （可以加页） d.5 毕业论文（设计）成绩评定表 学院：化学与材料科学学院 学号：0324220326 姓 名 论文（设计）总成绩： 论文（设计）题目食用菌抗氧化性能的研究 指 导 教 师 评 语 评定成绩： 签名： 2007 年 3 月 16 日 评 阅 人 评 语 评定成绩： 签名： 年 月 日 答 辩 小 组 评 语答辩成绩： 组长签名： 年 月 日 注：1、论文（设计）总成绩=指导教师评定成绩（50%）+评阅人评定成绩（20%）+ 答辩成绩（30%）2、将总成绩由百分制转换为五级制，填入本表相应位置。 食用菌多糖抗氧化性的研究食用菌多糖抗氧化性的研究 摘要摘要：本文以香菇、木耳、裙带菜、真姬菇为原料提取粗多糖，并通过改进了的 fenton 反应和邻苯三酚自氧化反应，以维生素 c 和甘露醇为对照，测定了这几种多糖清除羟基自 由基和超氧阴离子自由基的能力，对其抗氧化性进行了研究。实验结果表明，香菇、木耳、 裙带菜、真姬菇等粗多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，其中羟 基自由基清除率达 50%时香菇粗多糖浓度为 199g/ml，木耳为 149g/ml，裙带菜为 263g/ml。相同浓度的多糖溶液清除超氧阴离子自由基的能力大小依次是木耳粗多糖、 香菇粗多糖、裙带菜粗多糖。 关键词关键词： 食用菌； 多糖； 抗氧化； 自由基 abstract: in this article ,the polysaccharides was isolated from edible fungi such as mushroom, auricularia auricula, undaria pinnatifida,and so on. and through improved the fenton response and the pyrogallic acid from the oxidizing reaction,we has determined these kind of polysaccharide elimination hydroxyl free radical and ultra oxygen anion free radical ability by taking vitamin c and the mannitol as the comparison. the experimental result indicated that the polysaccharide from mushroom, the auricularia auricula, the undaria pinnatifida has certain scavenging action to the hydroxyl free radical and the ultra oxygen anion free radical.the scavenging activity to hydroxyl free radical was represented by the content of scavenging 50% of all radicals(ec50).the ec50 of polysaccharide from mushroom to hydroxyl free radical was 199g/ml ,and auricularia auricula for 149g/ml, undaria pinnatifida for 263g/ml. the same density polysaccharide solution eliminates the ultra oxygen anion free radical ability size is in turn the auricularia auricula thick polysaccharide, the shiitake mushroom thick polysaccharide, the undaria pinnatifida thick polysaccharide. key words: edible fungi; polysaccharide; antioxidation; free radical 目 录 1引言 1 11 食用菌多糖的提取、纯 化1 1.2 多糖的抗氧化性 3 1.2.1 多糖的抗氧化机制 3 1.2.2 清除羟基自由基活性分析方法4 1.2.3 清除超氧阴离子自由基活性分析方法4 2 实验部分5 2.1 材料与试剂5 2.2 仪器设备5 2.3 实验方法5 2.3.1 粗多糖的制备6 2.3.2 清除羟基自由基的实验方法6 2.3.3 清除超氧阴离子自由基的实验方法7 3 结果与讨论7 3.1 清除羟基自由基实验研究7 3.2 清除超氧阴离子自由基实验研究15 4. 结论16 5. 结束语17 参考文献17 致谢19 1 引言 食用菌已经成为人们日常生活中的一种重要的食品，它不仅味道鲜美，而 且营养丰富。近年来，人们对食用菌的研究也越来越深入广泛，人们研究发现 食用菌具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，抗氧化，降血脂，提高机体免疫力，减 少各种放疗化疗的毒副作用等生理功能。食用菌的这些生理作用与其所含的多 糖有密切的关系。有关文献就曾经报道，发现食用菌中提取的水溶性多糖可以 抑制肿瘤的生长1。 多糖是由多个单糖分子以糖苷键结合而成的天然高分子化 合物，广泛存在于植物、动物和微生物的组织中，是生命机体的重要组成部分。 多糖在机体内具有特殊的活性和多种生物学功能。真菌多糖是从真菌子实体、 菌丝体、发酵液中分离出来的，能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的 一类活性多糖。真菌多糖在国际上被称为“生物反应调节剂”简称 brm，作为一 种生物非特异性免疫促进剂，具有抗肿瘤，抗病毒，延缓衰老，讲学质，护肝 排毒，促进核酸和蛋白质生物合成等多种生物功效2。 近年来，对多糖的活性研究表明，其中部分多糖对物理化学以及生物来源 的多种活性氧（reactive oxygen species ros）具有清除作用，这其中三个具有 代表性的自由基：超氧阴离子自由基（o2），羟基自由基（oh），脂质过 氧化物（lpo）3，4，其中超氧阴离子自由基（o2）和羟基自由基（oh）是 生物体内两种重要的自由基，地球上的生物大多是需氧生物，在氧分子接受电 子还原为水的过程中首先产生 o2或其质子化产物，如果能在此阶段将其淬灭， 阻断自由链式反应，无疑具有十分重要的意义。oh 是体内最活跃的活性氧， 可介异许多病理变化6。自由基的产生与机体的许多功能障碍和疾病的发生如 吞噬，解毒，炎症，肿瘤，衰老，辐射损伤等有密切关系，氧化代谢过程中自 由基一旦产生，便会呈几何级数增长，直到加入自由基清除剂后才会减少和消 失。以下从食用菌多糖的提取、抗氧化活性及作用机理等方面作了综述。 1.1 食用菌多糖的提取 纯化10-15 食用菌多糖的提取流程一般是固体原料粉粹脱脂溶剂浸提 23 次 浸取液浓缩醇沉真空低温干燥粗多糖制品。得到的粗多糖一般含有蛋白 质、色素、低聚糖等小分子杂质。所以要得到比较精制的多糖还需要进一步的 纯化，一般的纯化过程包括去蛋白，除色素，除低聚糖、氨基酸等小分子杂质， 最后要得到分子量不同的纯化多糖还要进一步纯化 食用菌多糖的提取常常受提取时间，温度，ph 值，加水量，提取次数，乙 醇沉淀浓度等因素的影响，从而影响多糖提取率的高低。为解决这个问题我们 在提取过程中可采用正交实验方法通过排除或减少干扰因素，确定最佳提取方 法，提高食用菌多糖的提取率。 1.2 多糖的抗氧化性 1.2.1 多糖抗氧化作用的机制 近几年来，随着自由基生物学与自由基医学研究的迅速发展，现已证明多 种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤关系密切16。如果自由基的产 生和清除失衡，就会对机体造成损伤，导致疾病。 大量研究表明多糖具有抗氧化性，但是对于多糖抗氧化性的机理现在才刚 刚起步，有些机理还不甚明确，人们认为多糖的抗氧化性机理可能与以下几种 情况有关： （1）多糖分子间接作用与自由基本身。具体又可以分为两种：多糖直接 作用于抗氧化酶。通过提高体内原有抗氧化酶如：sod，cat，gsh2px 等的 活性，间接发挥抗氧化作用。多糖分子络合产生活性氧所必需的金属离子。 多糖结构中的醇羟基可以与产生oh 等自由基所必需的金属离子（如 fe2+，cu2+等）络合，使羟基自由基的产生受 到抑制，进而影响脂质过氧化的启动，最终抑制活性氧的产生17（2）多糖分 子直接作用于自由基本身。对于脂质过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质 过氧化链式反应中产生的活性氧，阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于oh 而 言，多糖碳氢链上的氢原子可以与其结合成水，达到清除oh 的目的，而多糖 的碳原子则因此成为碳自由基，并进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对 机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言，多糖可与其发生氧化反应，达 到清除的目的18。 1.2.2 清除羟基自由基活性分析方法 目前国内外对有关oh 的分析测定方法有许多报道，关于oh 的分析一 般是通过一定的体系产生oh，再用一些方法来测定反应产生的oh，产生oh 的体系有 fe3+edta抗坏血酸h2o2体系，fe2+edtah2o2体系，抗坏 血酸cu2+h2o2体系和黄嘌呤黄嘌呤氧化酶h2o2体系及紫外光照 h2o2 光解产生oh 等1823。测定oh 的方法主要有电子自旋共振法，高效液相色谱 法，化学发光法，荧光分析法和分光光度法33。电子自旋共振法和高效液相色 谱法测定oh，虽然灵敏度较高，但是所需仪器昂贵，操作也比较复杂，一般 实验室难以应用。化学发光法操作简便，不需要昂贵的仪器，测定快速。曾有 人24用化学发光法测定抗坏血酸cu2+h2o2体系产生的oh。荧光分析法灵 敏度同样很高而且仪器也较化学发光法普及，徐向荣等25采用 ce3+荧光分析法 测定 fenton 反应产生的oh，该法简便实用，测定快速。与以上方法相比应用 最广泛最普及的还是分光光度法，李平等26利用分光光度法检测各种自由基清 除剂对 fe2+edtah2o2体系产生的oh 的清除作用。其原理是 fenton 反应 是经典的产生oh 的体系，可认为能模拟人体内产生oh 的过程，该反应是以 双氧水为氧化剂，在亚铁盐作用下的氧化反应： fe2+ + h2o2 fe3+ + oh + oh 反应产生的羟基可以氧化番红使其褪色，利用分光光度法检测吸光度变化 间接测定所产生的羟自由基。在加入 h2o2前加入羟基自由基清除剂，fenton 反 应产生的羟自由基被清除或部分清除，体系在 520nm 波长处的吸光度降低程度 相应减少，采用固定反应时间法，在 520nm 波长处测量被测物反应液的吸光度 并与空白液比较，从而测定被测物对oh 的清除作用。用番红与羟自由基反应 的光度测定法，李平等利用分光光度法测定过山茱萸多糖清除羟自由基的能力， 但是由于反应体系中 h2o2含量过高，使实验结果误差很大，为此我们通过试验 对该方法进行了改进，确定了最佳反应条件。 1.2.3 清除超氧阴离子自由基活性分析方法 对于超氧阴离子自由基（o2）分析测定方法与oh 的分析方法相似，一 般也是通过产生超氧阴离子自由基（o2）的体系产生 o2，然后再通过各种 方法测定 o2，产生超氧阴离子自由基（o2）的体系有黄嘌呤黄嘌呤氧化 酶碱性 dmso，甲硫酸非那宗nadph27，28和邻苯三酚自氧化法29，30。测 定oh 的方法同样适用于测定 o2，另外还有脉冲辐射法、比色法、单扫描 极谱法31、氧电极法32等一些间接测定方法。由于实验方法需要仪器设备或条 件特殊，一般难以满足，所以测定 o2最常用的方法还是分光光度法。一般是 利用分光光度法检测邻苯三酚自氧化产物从而间接测定反应产生的 o2，进而 研究 o2清除剂的清除 o2能力。其反应原理是：利用邻苯三酚自氧化反应， 测定加入自由基清除剂对产生的 o2清除作用。邻苯三酚在弱碱性（tris-hcl- edta 缓冲液 ph=2）环境中自氧化分解产生 o2的反应 邻苯三酚 o2 + 其他产物 随着反应的进行，o2在体系中不断积累，致使反应液在 320nm，325nm，440nm 波长的吸光度在反应开始一段时间内随时间变化而线性 增长，通过测定邻苯三酚自氧化系统的吸收光谱，确定自氧化速率最大值及最 大吸收波长为 325nm29，在此条件下，测定加入自由基清除剂反应的吸收光谱 确定自氧化速率，各系统的自氧化速率为 s，清除率为 e。另外人们模拟人体 黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶产生 o2的原理研制出了抗超氧阴离子自由基试剂盒， 应用起来更方便。 2 2 实验部分实验部分 2.1 材料与试剂 香菇（新鲜市售），东北黑木耳（干，市售），裙带菜（干，市售），真 姬菇（市售），真姬菇纯化多糖（zj-2），番红为生化试剂，乙醇，丙酮，邻 苯三酚，l抗坏血酸（vc），双氧水，三羟甲基胺基甲烷，磷酸盐，edta- na-fe（）等试剂均为国产分析纯。 2.2 仪器设备 uv4802 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司）； sk3200h 超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；zht 型自动恒温电热套， 山东鄄城永兴仪器厂；wc/09-05 超级恒温箱；恒温水浴锅；fc204 电子天平等 2.3 实验方法 2.3.1 粗多糖的制备 称取干燥的真姬菇 10g 粉碎，研磨，置于烧杯中加 40 倍的蒸馏水，混匀， 超声波 15min 后于 90恒温水浴锅中搅拌浸提 3h，减压抽滤，提取液置于烧杯 中，残渣以同样的方法提取，合并两次提取液，浓缩至原来体积的三分之一， 将浓缩液加到三倍体积的无水乙醇中醇沉 24 小时，减压抽滤，沉淀物依次用 95%乙醇，丙酮洗涤，60烘箱干燥，即得到真姬菇粗多糖。 将新鲜香菇撕碎烘干，称取 9g，粉碎，置于烧杯中加入 20 倍体积的蒸馏水 混匀，在 80恒温水浴锅中搅拌浸取 5h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩 至原来体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽 滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于 60烘箱中干燥称重，得香菇粗多糖。 称取干木耳 10g，粉碎，置于烧杯中加 60 倍体积的蒸馏水，混匀在 80水 浴锅中搅拌浸取 4h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩至原体积的三分之一， 将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将 沉淀于 60烘箱中干燥称重，得木耳粗多糖。 称取裙带菜 10g，粉碎，置于烧杯中加 20 倍体积的蒸馏水煎煮 1h，共煎煮 三次，合并滤液，置于烧杯中，提取液置于烧杯中，浓缩至原体积的三分之一， 将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将 沉淀于 60烘箱中干燥称重，得裙带菜粗多糖。 2.3.2 清除羟基自由基（清除羟基自由基（oh）活性分析方法）活性分析方法 fenton 反应是经典的产生oh 的体系，可认为能模拟人体内产生oh 的过 程，该反应是以双氧水为氧化剂，在亚铁盐作用下的氧化反应： fe2+ + h2o2 fe3+ + oh + oh 反应产生的羟基可以氧化番红使其褪色，利用分光光度法检测吸光度变化 间接测定所产生的羟自由基。在加入 h2o2前加入羟基自由基清除剂，fenton 反 应产生的羟自由基被清除或部分清除，体系在 520nm 波长处的吸光度降低程度 相应减少，采用固定反应时间法，在 520nm 波长处测量被测物反应液的吸光度 并与空白液比较，从而测定被测物对oh 的清除作用。 反应体系（1）中加入 ph=4 的磷酸缓冲液0ml，番红（520g/ml）0.2m l ，edta-na-fe（）（0.1moll）1.0ml，再加入不同浓度的样品溶液 5.0ml，0.6%的 h2o2 0.8ml，用蒸馏水定容至 10ml，混匀后于 37水浴中保温 30min，在 520nm 波长处测吸光度 a 值。反应体系（2）中加入 ph=4 的磷酸 缓冲液0ml，番红（520g/ml）0.6m l ，edta-na-fe（）（0.1moll） 1.0ml，再加入不同浓度的样品溶液 5.0ml，0.6%的 h2o2 0.3ml，用蒸馏水定容 至 10ml，振荡摇匀后于 37水浴中保温 30min，在 520nm 波长处测吸光度 a 值。以上两体系测定时，每个试样做三次平行测定，取其平均值。 空白组以等体积的重蒸水代替样品溶液，对照组以等体积的重蒸水代替样 品溶液和 edta-na-fe（）溶液，实验结果以清除率 e 表示： 100% 空白吸光度值对照组吸光度值 空白吸光度值样品组吸光度值 e ec50 表示清除率为 50%时的样品浓度 2.3.3 清除超氧阴离子自由基（o2）活性的分析方法 利用邻苯三酚自氧化反应，测定加入自由基清除剂对产生的 o2清除作用。 邻苯三酚在弱碱性（tris-hcl-edta 缓冲液 ph=2）环境中自氧化分解产生 o2的反应 邻苯三酚 o2 + 其他产物 随着反应的进行，o2在体系中不断积累，致使反应液在 320nm，325nm，440nm 波长的吸光度在反应开始一段时间内随时间变化而线性 增长，通过测定邻苯三酚自氧化系统的吸收光谱，确定自氧化速率最大值及最 大吸收波长为 325nm。，在此条件下，测定加入自由基清除剂反应的吸收 光谱确定自氧化速率，各系统的自氧化速率为 s，清除率为 e。 具体方法是：在反应体系中加入 ph=2 的 tris-hcl-edta 缓冲液 5.0ml， 加入 0.5ml 不同浓度的样品溶液,25水浴中恒温 20min 后，加入 50 mmoll 的 邻苯三酚 10l，迅速摇匀，于 325nm 处每隔 30s 测定吸光度 a 值。实验中抑 制率在 0-60%范围内与样品浓度成线性关系，自氧化速率应控制在 0.070（0.002）/min，自氧化速率 s=a/t，加入样品后，使邻苯三酚氧化速 率控制在 0.035（0.002）/min29，计算公式为： %100 空白 样品空白 清除率 s ss e 3 3 结果与讨论结果与讨论 3.1 清除羟基自由基实验研究 3.1.1 fenton 体系（1）oh 清除条件试验 （1） 番红用量对oh 清除率的影响 按本文所述的实验方法，固定其它量不变，用 vc 做阳性对照（vc 浓度为 500g/ml，取样量为 5.0ml），改变番红用量，分别取 0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.5ml，0.7ml，1.0ml，测的在 520nm 波长处测吸光度 a 值，根据公式求清除率，测定结果如下表所示： 表 1 番红用量与oh 清除率的关系 番红量 /ml 0.1 0.2 0.3 0.5 0.7 1.0 a空白 0.060 0.067 0.072 0.082 0.085 0.095 a对照 0.066 0.091 0.132 0.220 0.304 0.419 a样品 0.069 0.083 0.084 0.101 0.112 0.131 e% / 66.7 24.0 13.8 12.3 11.1 图1 番红用量对oh清除率的影响 0 20 40 60 80 00.30.60.91.2 番红用量（ml） e% 从上图可知，番红作的用量对测定结果影响很大，随着番红用量的增大， 相同用量的 vc对oh 的清除率逐渐减少。由于同样条件下，测得的oh 清除 率 e 越高，测定的灵敏度越高，因此番红的用量选为 0.2ml。 （2） h2o2用量对oh 清除率的影响 按本文所述的实验方法，固定其它量不变，用 vc 做阳性对照（vc 浓度为 500g/ml，取样量为 5.0ml,反应温度为模拟人体温度 37，反应时间为 30min ）改变 h2o2用量，分别取 h2o2（0.6%）0.6ml，0.7ml，0.8ml，0.9ml，1.0ml， 在 520nm 处测吸光度 a 值，根据公式求清除率，测定结果如下表所示： 表 2h2o2用量与oh 清除率的关系 h2o2/ml1.00.90.8 0.7 0.6 a 空白 0.058 0.064 0.064 0.073 0.074 a 对照 0.094 0.096 0.095 0.097 0.102 a vc0.068 0.074 0.079 0.088 0.084 e% 21.7 31.3 48.4 62.535.7 图2 h2o2用量对oh清除率的影响 0 10 20 30 40 50 60 70 0.50.60.70.80.911.1 h2o2用量(ml) e% 从 fenton 反应的原理我们知道 h2o2用量与oh 生成量呈正相关，h2o2是 产生oh 的必要条件。实验结果表明，h2o2用量多少对oh 清除率的影响很大， 当 h2o2的用量较低（h2o2的用量为 0.6ml1.0ml）时，随着 h2o2用量的增大， 同样浓度的 vc 对oh 的清除率也增大。但是 h2o2用量也并非越大越好，继续 增大 h2o2用量，oh 生成量较多，vc 对oh 的清除率反而下降。上图表示 h2o2用量取 0.7ml 时，e 最大，测量的灵敏度高。因此我们选择 h2o2用量为 0.7ml。 3.1.2 fenton 体系（2）oh 清除条件的试验 fenton 体系（1）虽然较原方法有所改进，但是由于 a= a 对照 - a 空白， 一般在 0.03 左右，数值偏小，a 值的轻微变化，对抑制率的影响较大。在加入 羟基清除剂，重复实验时，清除率 e 的测量结果误差太大。因此在 fenton 体系 （2）中，我们通过改变番红，edta-na-fe（）和 h2o2量使 a 对照和 a 空 白大于或者接近于 0.2，a 在 0.1 左右，这样空白和对照的吸光度值 a 在分光 光度计测量的最佳范围内（0.2-0.8）。 （1）改变 edta-na-fe（）用量对清除率的影响 按本文所述的实验方法，固定其它量不变，番红（520g/ml）1.0m l，样品为 vc 溶液（vc 浓度为 250g/ml，取样量为 5.0ml）改变 edta-na-fe（）用量， edta-na-fe（）浓度为（0.1moll），分别取 0.3ml，0.5ml，0.7ml，0.9ml，1.0ml，1.2ml，在 520nm 处测吸光度 a 值，根据 公式求清除率，测定结果如下表所示 表 3 edta-na-fe（）用量与oh 清除率的关系 edta-na- fe（）量 (ml) 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 1.2 a 空白 0.061 0.131 0.198 0.250 0.282 0.315 a 对照 0.489 0.493 0.489 0.492 0.495 0.496 a 样品 0.114 0.195 0.281 0.333 0.356 0.374 e%12.4 17.7 28.5 34.3 34.7 32.6 图3 edtanafe()用量对oh清除率的影响 10 15 20 25 30 35 40 0.20.40.60.811.2 edtanafe()的用量（ml) e% 由于 edta-na-fe（）带有颜色，对反应中的颜色变化有影响，从上述结果 我们也可以得出结论，edta-na-fe（）对清除羟基自由基有影响，并且在一 定范围内随着 edta-na-fe（）用量的增加抑制率增加，但是在大于 0.9ml 后， 抑制率基本上变化不大，因此，根据抑制率最高和移取方便我们选取 edta- na-fe（）的量为 1.0ml。 （2）改变番红用量对oh 清除率的影响 按本文所述的实验方法，固定其它量不变，样品为 vc 溶液（vc 浓度为 200g/ml，取样量为 5.0ml）改变番红量，分别取 0.6ml，0.7ml，0.8ml，0.9ml，1.0ml，测定在 520nm 波长处测吸光度 a 值，根 据公式求清除率，测定结果如下表所示： 表 4 番红用量与oh 清除率的关系 番红量 /ml 04050.6 0.7 0.8 0.9 1.0 a 空白0.1120.146 0.190 0.201 0.238 0.258 0.291 a 对照 0.1970.2390.291 0.337 0.392 0.4380.505 a 样品 0.235 0.251 0.2880.315 0.343 e% 44.6 39.7 32.5 31.6 24.3 图4 番红用量对oh清除率的影响 20 25 30 35 40 45 50 0.50.60.70.80.911.1 番红用量（ml） e% 番红用量对 e 的影响在 0.6ml-1.0ml 范围内随着番红用量的增加而减少，当 用量低于 0.6ml 时，a 空白远远小于 0.2，故不足取，所以番红用量应该取 0.6ml。 （3）改变 h2o2用量对oh 清除率的影响 实验方法如前文所述，固定其它量不变，样品为 vc 溶液（vc 浓度为 250g/ml，取样量为 5.0ml）反应体系中加入 ph=4 的磷酸缓冲液0ml，番 红（520g/ml）0.6m l ，edta-na-fe（）（0.1moll）1.0ml。在加入不同浓 度的样品溶液 5.0ml，0.6%的 h2o2用量分别取 0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，将比色光定容至 10ml，振荡摇匀后于 37水浴中保温 30min，在 520nm 波长处测吸光度 a 值。 表 5 h2o2用量与oh 清除率的关系 h2o2量/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 a 空白 0.265 0.2160.168 0.134 0.117 a 对照0.282 0.288 0.287 0.290 0.294 a 样品 0.274 0.253 0.2260.175 0.159 e%52.9 51.4 48.7 26.3 23.7 图5 h2o2用量对oh清除率的影响 20 25 30 35 40 45 50 55 00.10.20.30.40.50.6 h2o2用量（ml） e% 从结果我们可以看出，h2o2对oh 清除率的影响很大，前文我们也曾经提 到过 h2o2是产生oh 的必要条件，结果可以表明当 h2o2用量在 0.1ml-0.3ml 范 围内抑制率相差不大，但是由于 h2o2用量在 0.1ml 和 0.2ml 时，a 分别为 0.017 和 0.072，数值偏小，对结果造成的误差较大，因此我们选择 h2o2用量为 0.3ml。 综合上述条件，我们确定 fenton 反应体系（2）的最佳反应条件是 ph=4 的磷酸缓冲液0ml，番红（520g/ml）0.6m l ，edta-na-fe（） （0.1moll）1.0ml。在加入不同浓度的样品溶液 5.0ml，0.6%的 h2o2 0.3ml，将 比色光定容至 10ml，振荡摇匀后于 37水浴中保温 30min，在 520nm 波长处 测吸光度 a 值。 3.1.3 fenton 体系（2）测定几种物质对oh 的清除作用 表 6 fenton 体系（2）测定几种物质对羟基自由基的清除作用 抗氧化 剂 浓度 (g/ml) e/%ec50 (g/ml) 抗氧化 剂 浓度 (g/ml) e/%ec50 (g/ml) 2516.537.92.9 5024.363.16.9 7529.9189.319.6 12543.5315.530.5 17551.9441.743.1 vc161 甘露醇 631.056.3 539 8.110.733.85.1 16.316.856.410.2 24.425.4112.826.9 32.634.5169.240.8 40.753.3225.660.2 硫脲 48.871.5 38 香菇粗 多糖 28270.3 199 21.37.617.64.0 35.616.929.36.7 71.126.458.510.9 106.737.887.814.9 142.248.111722.8 木耳粗 多糖 177.857.9 149 裙带菜 粗多糖 146.328.7 263 *以上个溶液浓度均为反应混合液中的浓度以上个溶液浓度均为反应混合液中的浓度 图6 不同浓度的vc溶液清除oh的能力 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 050100150200 vc浓度(g/ml) e% 图7 不同浓度的甘露醇清除oh的能力 0 10 20 30 40 50 60 0100 200 300400 500 600 甘露醇的浓度(g/ml) e% 图8 不同浓度的硫脲清除oh的能力 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0102030405060 硫脲的浓度(g/ml) e% 图9 不同浓度的香菇粗多糖清除oh的 能力 0 10 20 30 40 50 60 70 80 050100150200250300 香菇粗多糖的浓度(g/ml) e% 图10 不同浓度的木耳粗多糖清除oh的能力 0 10 20 30 40 50 60 70 04080120160200 木耳粗多糖的浓度(g/ml) e% 图11 不同浓度的裙带菜粗多糖清除oh的 能力 0 5 10 15 20 25 30 35 0306090120150 裙带菜粗多糖的浓度(g/ml) e% 硫脲，vc 是良好的清除羟基自由基的清除剂，甘露醇也有一定的清除能力， 因此我们选用这三者作为阳性对照，由上述结果我们可以知道清除清基自由基 能力的大小依次是硫脲（ec50 约为 38g/ml）、木耳粗多糖（ec50 约为 149g/ml）、vc（ec50 约为 161g/ml）香菇粗多糖（ec50 约为 199g/ml）、 裙带菜粗多糖（ec50 约为 263g/ml）甘露醇（ec50 约为 539g/ml）。由此可 见，木耳粗多糖、香菇粗多糖、裙带菜粗多糖均具有较强的抗氧化性。 3.2 清除超氧阴离子自由基（o2）活性分析方法 3.2.1 邻苯三酚浓度与其自氧化速率的关系 由于该反应中邻苯三酚自氧化速率与邻苯三酚的用量密切相关，为了确定 符合要求的反应体系，实验研究了不同浓度下邻苯三酚的自氧化速率，并做了 定性分析，按前文所述的实验方法分别取不同浓度 （30mmoll，45mmoll，50mmoll，65mmoll，80mmoll）的邻苯三酚溶液 10l，在 04min 内每隔 30s 测定在 325nm 处的 a 值，根据自氧化速率 s=a/t，计算自氧化速率。 表 7 邻苯三酚浓度与其自氧化速率的关系 c（mmoll ） 3045506580 s （min）0.0290.0580.0720.1160.144 根据自氧化速率应控制在 0.070（0.002）/min 的要求，实验中邻苯三酚的浓度 应该选择 50mmoll。 3.2.2 几种物质对超氧阴离子自由基清除作用的研究 抗氧化剂浓度（g/ml）e/% vc5.720.4 7.131.5 9.347.6 17.970.3 香菇粗多糖55.313.8 110.515.1 165.823.5 221.124.6 木耳粗多糖52.14.4 104.312.6 156.418.3 208.620.1 裙带菜粗多糖48.31.7 72.43.1 96.611.3 *以上个溶液浓度均为反应混合液中的浓度以上个溶液浓度均为反应混合液中的浓度 上述结果我们可以看出，vc 具有良好的清除超氧阴离子自由基的能力，所 以一般采用 vc 做阳性对照，香菇，木耳，裙带菜这三种物质是我们日常生活 中常吃的食品，实验结果表明三种相同浓度不同多糖的清除超氧阴离子的能力 顺序为香菇、裙带菜、木耳，但是在等量的干子实体中，所含多糖的量又是不 一样的，其中裙带菜的含量远远低于香菇木耳，因此单位质量的香菇，木耳， 裙带菜的清除超氧阴离子自由基的能力是香菇，木耳，裙带菜。 4 4 结论结论 根据实验，香菇，木耳， 裙带菜等这些日常蔬菜有明显的清除自由基的作 用，具有一定的抗氧化性。对于羟基自由基的清除能力是木耳粗多糖（ec50 约 为 140g/ml）大于香菇粗多糖（ec50 约为 170g/ml 大于裙带菜，而木耳又略 低于 vc（ec50 约为 120g/ml），对于清除超氧阴离子自由基的清除能力顺序 为香菇、裙带菜、木耳，但是在等量的干子实体中，所含多糖的量又是不一样 的，其中裙带菜的含量远远低于香菇木耳，因此单位质量的香菇，木耳，裙带 菜的清除超氧阴离子自由基的能力是香菇，木耳，裙带菜。 5 5 结束语结束语 人们对食用菌多糖的研究不断深入，大量研究表明，食用菌多糖是一类具 有复杂的多方面的具有生物活性的物质，目前对于多糖的作用原理还不甚了解， 对于抗氧化性的研究也只是停留在表面阶段，对于多糖抗氧化的药理作用也只 是猜想，现在有人正从多糖结构入手研究其抗氧化性的机制3，所以关于这方 面的研究还有待继续深入。 参考文献 1 周林珠,杨祥良,周井炎等. 多糖抗氧化作用的研究进展j.中国生化药物杂志,2002, 23（4）:210212 2 秦俊哲,陈明,陈合等. 食药用真菌多糖的研究现状与展望.中国食用菌,23（2）:68 3 冉靓,杨小生,王伯初等.抗氧化多糖的研究进展j.时珍国医国药,2006,17（4）:7880 4marx jl oxygen free radicals linked to many d