微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件优化 毕业论文.doc

微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件优化目 录目 录- 1 -摘 要- 3 -1 前言- 3 -2 材料与方法- 4 -2.1材料- 5 -2.1.1菌种来源- 5 -2.1.2 培养基- 5 -2.1.3 仪器- 5 -2.2 方法- 5 -2.2.1菌种分离方法- 5 -2.2.2 菌种初筛方法- 5 -2.2.3 菌种复筛方法- 6 -2.2.4 絮凝率的测定- 6 -2.2.5 菌种的鉴定方法- 6 -2.2.6 菌种培养条件优化- 7 -3 结果与分析- 8 -3.1样品采集与分离- 8 -3.2 菌种初筛与复筛结果- 8 -3.3菌种鉴定结果- 9 -3.4 优化实验结果及分析- 10 -3.4.1 正交试验结果- 10 -3.4.2 正交试验分析- 11 -4 结论与讨论- 15 -5 参考文献- 16 -abstract- 17 -致 谢- 18 -微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件优化摘 要：用平板划线纯化法，从土壤、污水处理厂活性污泥、荷塘污泥中分离出21支菌株，以各菌株发酵液对高岭土悬浮液絮凝效果为指标，筛选出1株微生物絮凝剂产生菌。经过形态学特征、生理生化反应初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis) 。通过正交试验对其培养条件进行研究确定了其培养条件的优化组合，即碳源为蔗糖、培养时间3天、ph 6.7、温度37，并在该条件下培养后测其发酵液的絮凝率。结果显示絮凝率由优化之前的43.2提高到了条件优化后的55.2。关键词：微生物絮凝剂 筛选鉴定 絮凝率 培养条件 正交试验1 前言微生物絮凝剂是一种由絮凝微生物在生长过程中代谢产生的一类具有絮凝活性的高分子化合物，能够聚集、沉淀水中的悬浮颗粒、金属离子、色素及有机物质。与传统的无机和有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有如下特点：1）高效性，同等用量下，微生物絮凝剂的使用效率明显高于常规絮凝剂；2）安全无毒性，完全能用于食品、医药等行业的发酵后处理；3）可生化性，即能自行降解，不会带来二次污染；4）较高的热稳定性，如将paecilomyces sp.菌株产生的絮凝剂煮沸后其活性几乎不变1；5）用途广泛，脱色效果显著，对多种絮凝颗粒以及合成高分子的可溶性色素物质都具有优良的凝聚能力；6）能产生絮凝剂的微生物种类多，生成快，易于采取生物工程手段实现产业化，且生产成本低，因此越来越受到研究者的关注。影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素主要可归结为三个方面：1）产生微生物絮凝剂的微生物菌体自身性质，如细胞结构组成、遗传因素、代谢活性、产生微生物絮凝剂时培养基的营养成份组成及生长时所处的环境情况（如供氧、温度、ph值等）；2）使用微生物絮凝剂时所处的环境，包括温度、ph、金属离子种类及含量情况等；3）被絮凝的对象的性质等。早在20世纪50年代人们就发现了能产生絮凝作用的细菌培养液，真正的深入研究始于1976年由j.naknmura等人进行的专门研究。至今发现的具有絮凝性状的微生物种类有真菌、酵母菌、细菌、藻类等，由它们产生的微生物絮凝剂类型很多。报道最多的主要有：酱油曲霉（aspergilluss sojae）产生的aj7002絮凝剂2、红平红球菌s-1（rhodococcus erythvopolis sp-1）生产的mbfnoc-13、拟青霉菌i-1（paecilomyces sp.i-1）产生的mbfpf101等4。国外的研究者已经开发出一系列微生物絮凝剂56，目前制约微生物絮凝剂发展的关键问题在于以下几方面：一是原材料价格高，絮凝剂产量低。一般微生物絮凝剂合成的最适培养基是葡萄糖和酵母膏等，成本非常高。因此应利用废弃物或高浓度有机废水培养微生物，以降低生产成本，同时优化培养条件，提高絮凝剂产量。这是使微生物絮凝剂在工业上能够推广应用的关键。二是研究水平低。研究过程中菌种大多采用自然育种方法获得，工作量大，周期长。应该利用分子生物学技术获得高效的絮凝基因，通过转基因技术，或者对高效的微生物絮凝剂产生菌诱变育种，构建絮凝作用的工程菌，这将大大提高研究效率。三是测定絮凝剂活性的指标单一并且存在一定误差。目前，国内外常用对高岭土悬浊液的处理能力表征其活性，对于性质和种类千差万别的工业废水而言,此指标显然不能全面衡量。有研究表明，培养基中 po43-浓度较高时，高岭土评价体系会受po43-与ca2+的影响，不能真实地表示微生物絮凝剂的絮凝效果，需要对现有评价体系进行修改。四是絮凝机理尚无明确解释。微生物絮凝剂絮凝机理的研究目前仍没有重大突破，与各种废水的作用机制尚不清楚。应对不同水质废水的作用机制进行研究，找出其中的规律，根据不同的废水水质开发出具有针对性的高效微生物絮凝剂，这样不仅能从本质上显著提高絮凝效果，还可以大大降低絮凝剂投加量, 从而降低处理成本。五是单一微生物絮凝剂絮凝能力有限。可以考虑开发复合型微生物絮凝剂，包括多株菌作用产生的絮凝剂以及在应用过程中与一定量的无机絮凝剂或有机高分子絮凝剂配合使用，以达到更好的絮凝效果7 。在这之中筛选絮凝剂产生菌并提高其絮凝剂产量变得尤为重要，同时也是开发和系统研究微生物絮凝剂关键的第一步。本实验采用常规细菌分离纯化方法，从荷塘污泥中筛选出一株絮凝剂产生菌，通过形态学特征、生理生化反应对该菌株进行鉴定，并对该菌株产絮凝剂的最佳培养条件进行了研究。2 材料与方法2.1材料2.1.1菌种来源分别以开封浦华紫光水业公司、河南大学北苑菜地及河南大学荷塘取回活性污泥、土壤和淤泥为样品。 2.1.2 培养基分离培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，nacl 5 g，琼脂1520 g，水1000 ml ，ph 7.07.2，121 灭菌20 min。发酵培养基：葡萄糖20 g，kh2po4 0.2 g，k2hpo4 0.5 g，(nh4)2so4 0.2 g，nacl 0.1 g，脲0.5 g，酵母膏0.5，mgso4 0.2 g，水1000 ml，ph 7.2，112.3 灭菌30 min。2.1.3 仪器卧式圆形压力蒸汽灭菌器（yxq.wy21.600-11r, 张家港华菱医疗设备制造公司）752n紫外可见分光光度计（上海精科）恒温培养振荡器（zhwy-1112b，上海智城分析仪器制造公司）台式离心机（tdl-608，上海安亭科学仪器厂制造）洁净工作台（vs-1300-v，苏州安泰空气技术公司）2.2 方法2.2.1菌种分离方法在超净工作台各称取1 g 上述三种样品，溶于100 ml无菌水中制成菌悬液。用移液枪取0.5 ml菌悬液于盛有4.5 ml已灭菌的试管中依次做梯度稀释至10-4，取10-2、10-3、10-4三个稀释度的菌悬液0.1 ml至分离平板中用涂布棒涂布均匀，37培养24 h。待菌落长成之后，每个菌落做两支分离培养基斜面做菌种保存。2.2.2 菌种初筛方法在无菌操作工作台中，用接种环从试管斜面或平板中取一环待筛选的菌种，接种入盛有30 ml发酵培养基的150 ml三角瓶中，做摇瓶发酵。发酵条件为37，160 r/min , 72 h。待发酵结束后取发酵液5 ml离心，取其上清液，条件3600 r/min，10 min。取新配制好的4 g/l的高岭土溶液56 ml，实验菌发酵培养液上清液2 ml， 0.1mol/l cacl2溶液2 ml于100 ml的烧杯中，快速搅拌3 min，慢搅1 min，静置一段时间目测其有无絮状沉淀生成，根据目测结果，将有沉淀生成的菌种筛选出来。2.2.3 菌种复筛方法将初筛出来的菌种做平板划线接种获得其单菌落，每个菌种做三支斜面保存。用接种环从斜面中取一环菌种，接种入盛有30 ml发酵培养基的150 ml三角瓶中，做摇瓶发酵。发酵条件为37，160 r/min，72 h。待发酵结束后取发酵液做絮凝沉淀实验，测其絮凝率，再将絮凝率最高且稳定的菌株筛选出，利用正交试验方法对该菌种的培养条件进行优化以进一步提高絮凝率。2.2.4 絮凝率的测定取实验菌种发酵液5 ml离心，取其上清液，条件3600 r/min，10 min。取新配制好的4 g/l的高岭土溶液56 ml，实验菌发酵培养液上清液2 ml，0.1mol/l cacl2溶液2 ml于100 ml的烧杯中，快速搅拌3 min，慢搅1 min，静置30 min取上清液测其od550作为实验组。同时将实验组中的2 ml实验菌发酵培养液上清液改为2ml无菌发酵培养基，其他条件不变作为对照组。絮凝率计算公式为：絮凝率=（ab）/a 100式中，a：对照组上清液550nm处的od值；b：实验组上清液550nm处的od值。通过絮凝率的计算可以知道各种菌在实验条件下的絮凝能力，絮凝率的大小可表示菌种絮凝能力的强弱，借此判断哪个菌有最强的絮凝能力。2.2.5 菌种的鉴定方法 菌种革兰氏染色1）涂片，2）晾干， 3）固定， 4）结晶紫色染色， 5）水洗， 6）媒染， 7）水洗， 8）脱色， 9）复染， 10）水洗， 11）晾干， 12）镜检。 菌种芽孢染色schaeffer-fulton法 1）涂片，2）固定， 3）染色，4）水洗吸干，镜检。 菌种形态及运动性观察压滴法 1)制成菌悬液，2) 各取23环三种稀释菌液，放在清洁的载玻片中央，再放一环染色用美蓝水溶液混匀，3) 加盖玻片，4) 镜检。 耐盐性试验以肉汤培养液配成7的nacl溶液，培养基要求十分澄清，接种时采用幼龄菌直针接种，37培养27天，与未接种的对照管对比，目测生长情况。若菌种能生长说明该菌种耐盐，做三个平行。 v-p实验测定1) 培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖 5 g，k2hpo4 5 g，水 1000 ml，ph 7.07.2 每管分装5 ml，115 灭菌30 min。试剂：肌酸 0.3，naoh 40。2) 接种培养：接种试验菌于以上培养液置37培养24天，同时做三个平行。3) 操作与观察：先用酸度计测培养液的ph，然后取培养液和40naoh等量相混，加少许肌酸，10 min如培养液出现红色，有时需放入沸水中加热几分钟，观察是否变红，做三个平行。 水解淀粉实验蛋白胨 10 g，nacl 5 g，牛肉膏 3 g，琼脂 1520 g，0.2可溶性淀粉，蒸馏水1000ml，ph 7.07.2，0.11mpa、121灭菌20 min。培养基灭菌后倒平板，用接种环划线接种，培养两天后利用革兰氏染色用碘液检验实验结果，如果碘液变蓝表明该菌不能够水解淀粉，否则相反，做三个平行。 接触酶实验用无菌接环在无菌环境下，于平板中取菌苔一环与3过氧化氢溶液相混，看是否立即有气泡产生，有气泡产生则为阳性，做三个平行。 需氧性试验将牛肉膏蛋白胨培养基倒入试管中约试管一般高度，用接种针穿刺接种到琼脂柱中，穿到管底但不穿破，37培养24天，如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如既能在琼脂柱表面也能沿着穿刺线上生长者为兼性厌氧菌，若只能在底部生长为厌氧菌，做三个平行。2.2.6 菌种培养条件优化为了筛选出的菌种其絮凝剂产量达到最大，有必要对其培养条件进行优化，据相关文献报道，发酵培养时间、培养温度、培养基ph、培养基碳源、氮源、摇床转速等对絮凝剂产生菌产量有较重要的影响，且一些产絮凝剂菌种的发酵培养时间设定在24d，培养温度维持在2837，培养基ph在6.58.0之间为佳，并可利用多种不同的碳源812。现选取培养温度、培养基ph、培养基碳源、培养时间四个因数，设置三个水平做正交试验，其中培养温度三水平依次为：28、30、37；培养基ph三水平依次为：6.7、7.6、8.6；培养基碳源三水平依次为：葡萄糖、蔗糖、乳糖；培养时间三水平依次为：2d、3d、4d。其余因数按照文献报道的最佳值来操作，为了和筛选实验时保持一致，在测对照组od值时所加空白发酵培养基都用以葡萄糖为碳源的培养基，摇床转速为160r/min。参照l9(34)正交表13设计实验表，并做三次重复实验。测定在各条件下培养液对高岭土悬浮液的絮凝率。根据正交试验结果和极差分析结果得出各因素对菌种产絮凝剂影响的显著性大小和各因素最佳水平，从而确定出菌产絮凝剂的最佳培养条件。3 结果与分析3.1样品采集与分离从开封浦华紫光水业公司、河南大学北苑菜地及荷塘分别取回活性污泥、土壤和淤泥三份样品，进行菌种分离，先后共进行了三批分离实验。最后从中分离了21株菌种，命名为j1j21。其中j1j4共4株来自开封浦华紫光水业公司活性污泥，j5j7、j16j21共9株来自河南大学北苑菜地土壤，j8j15共8株共来自河南大学荷塘淤泥。3.2 菌种初筛与复筛结果将分离所得的每个菌株做两支斜面保存，对这21株菌株进行初筛，做三次平行实验，经初筛筛选出两株絮凝现象较明显的菌株分别为j2和j8。然后按照2.2.3复筛方法对这两株菌株进行复筛，三次平行实验结果如下表所示：表1 j2与j8絮凝率比较菌 种j2j8絮凝率（）42.722.75.5039.847.142.6平均絮凝率（）23.643.2由上表可知，j2的絮凝率波动较大不是很稳定，不适合做后续的优化试验，而j8的絮凝率较稳定，平均絮凝率为43.2，因此，取j8作为优化实验的实验菌种平板划线接种，经培养获得单菌落，接种于斜面生长。以下实验均以j8作为实验菌。3.3菌种鉴定结果该菌种的菌落不圆整呈锯齿状，淡粉红色，中间有凸起，菌落表面呈似毛状物，培养时间稍长菌落周围有淡黄色胶状物质分泌出来。用0.5美兰染色观察细菌的形态，可知该菌呈短杆状接近椭圆状，且原生质中没有不着色的颗粒。经革兰氏染色判j8为革兰氏阳性菌，且能观察到芽孢，该菌种芽孢不明显膨胀，芽孢呈柱状、中生。其他鉴定实验结果如下表所示：表2 j8菌株生理生化鉴定结果生 理 生 化 鉴 定 项 目 实验结果 运 动 性 耐 盐 性 实 验 v.p 实 验v.p 实 验培 养 液 ph 接 触 酶 实 验 淀 粉 水 解 实 验 需 氧 性 实 验原 生 质 中 不 着 色 颗 粒 + + + 5.5 + + 兼性厌氧 注：具有指示特征的菌株百分数：+ = 85100； = 04图1 j8在肉胨培养基上的菌落形态结合以上实验，参照微生物学实验手册14中芽孢杆菌（bacillus）典型菌株的检索，可初步鉴定该菌种为地衣芽孢杆菌（bacillus. licheniformis）。3.4 优化实验结果及分析3.4.1 正交试验结果表3 正交试验影响因数及其水平表水平因 数1温度（）因 数2ph因 数3培养基碳源因 数4 培养时间(d)1232830376.77.68.6葡萄糖蔗 糖乳 糖234根据四因数三水平的正交试验特点设计l9(34)正交表如下表所示：表4 正交试验设计表实验 因数1 因数2 因数3 因数4组号 温度（） ph 培养基碳源 培养时间(d)1 28(1) 6.7(1) 葡萄糖(1) 2(1)2 28(1) 7.6(2) 蔗 糖(2) 3(2)3 28(1) 8.6(3) 乳 糖(3) 4(3)4 30(2) 6.7(1) 蔗 糖(2) 4(3)5 30(2) 7.6(2) 乳 糖(3) 2(1)6 30(2) 8.6(3) 葡萄糖(1) 3(2)7 37(3) 6.7(1) 乳 糖(3) 3(2)8 37(3) 7.6(2) 葡萄糖(1) 4(3)9 37(3) 8.6(3) 蔗 糖(2) 2(1)正交试验结果记录如下表所示：表5 正交试验结果实验 因数1 因数2 因数3 因数4 平均絮凝率组号 温度 ph 培养基碳源 培养时间 （）1 1 1 1 1 37.32 1 2 2 2 32.53 1 3 3 3 7.604 2 1 2 3 25.85 2 2 3 1 9.606 2 3 1 2 32.67 3 1 3 2 22.98 3 2 1 3 19.89 3 3 2 1 37.8注：平均絮凝率指三次重复正交试验所得的絮凝率的平均值3.4.2 正交试验分析参照参考文献13，对正交试验结果进行极差分析。具体分析过程如下所示：以因数1（温度）做分析举例：取温度水平1的三次实验（实验组号1、2、3）的平均絮凝率结果相加记作k1，即k1= 37.3+32.5+7.60=77.4，水平2的三次实验（实验组号4、5、6）的平均絮凝率结果相加记作k2，即k2 =25.8+9.60+32.6=68.0，水平3的三次实验（实验组号7、8、9）的平均絮凝率结果相加记作k3。即k3=22.9+19.8+37.8=80.5，由于正交表的特点，k1反映的是因数1（温度）取1水平三次及其余因数1、2、3水平各一次的影响，k2反映的是因数1（温度）取2水平三次及其余因数1、2、3水平各一次的影响，k3反映的是因数1（温度）取3水平三次及其余因数1、2、3水平各一次的影响，从而在比较k1，k2，k3时，可以认为除温度以外其他因数对k1，k2，k3的影响大致相同，k1，k2，k3之间的差异可以认为是由于温度取三个不同水平所产生的。k1，k2，k3都是三次试验的絮凝率之和，它们的平均值分别记作k1，k2，k3，对于因数1有：k1= k1/3=77.4/3=25.8；k2= k2/3=68.0/3=22.7；k3= k3/3=80.5/3=26.8。再求k1，k2，k3的极差r： r=max(k1 , k2, k3)-min(k1 , k2, k3)。对于因数1（温度）有： r=26.8-22.7=4.10。同理，对于其他三个因数算出相应的k1，k2，k3，与k1，k2，k3和r。结果如下表所示：表6 正交试验结果记录因数1温度因数2ph因数3培养基碳源因数4培养时间k1k2k377.468.080.586.061.978.089.796.140.184.788.053.2k1k2k325.822.726.828.720.626.029.932.113.428.229.317.7r4.108.1018.711.6为了使数据更加直观，现取因数水平为横坐标，各水平三次絮凝率的平均值，即k值为纵坐标作出因数和试验指标（絮凝率）的关系图。首先作温度各水平与絮凝率的关系图，如图2所示：图2 因数1（温度）各水平对絮凝率k的影响由图2我们可以看出温度在37时絮凝率要比另两水平高，所以在温度这一影响因数中37为最佳温度水平。ph各水平与絮凝率的关系，如图3所示：图3 因数2（ph）各水平对絮凝率k的影响由图3我们可以观察到在ph三个水平中，当其值在6.7这一水平时的絮凝率要ph比其他水平的絮凝率值高，因此，我们在ph这一影响因数中选取ph 6.7作为最佳水平。培养基碳源各水平与絮凝率的关系，如图4所示：图4 因数3（培养基碳源）各水平对絮凝率k的影响 从图4中我们可以清楚的发现培养基碳源的三个水平中，当碳源为蔗糖时，其絮凝率要比碳源其他两水平的絮凝率值大，达到了32.1，所以在培养基碳源这一影响因数中蔗糖为最佳水平。培养时间与絮凝率的关系，如图5所示：图5 因数4（培养时间）各水平对絮凝率k的影响从图5中我们可以得出当培养时间为3d时絮凝率最大，说明在培养时间这一因数中3d为最佳水平。由表6我们可以知道极差r值由大到小排列为：18.711.68.104.10,而极差越大，说明该因数的水平变动时，实验指标的变动越大，即该因数对试验指标的影响最大，所以按极差大小决定因数的主次水平顺序为：培养基碳源培养时间 ph 温度因此，通过以上分析我们可选取主次因数中使絮凝率最大的水平，组成较优的培养条件组合，即培养基碳源使用蔗糖，培养时间为3d，ph为6.7，温度37。使用该条件培养实验菌种（j8），测其絮凝率，并与优化前做对比。将所获得的优化组合作为菌种培养条件，其他条件与优化前一致，做三平行实验。结果如表6所示：表7 条件优化后j8絮凝率对 照平行1平行2平行3od550絮凝率（）平均絮凝率（）1.010.46154.30.44755.755.20.44855.6由上表可知条件优化后j8的平均絮凝率为55.2，相比较优化前如表1所示平均絮凝率43.2提高了12.0，优化实验取得了一定的效果。4 结论与讨论本研究筛选出一株能产絮凝剂的菌种命名为j8，其发酵液对4g/l高岭土溶液的絮凝率经培养条件优化之前达到43.2，经过形态学特征，生理生化检测初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis）。 通过培养条件的优化，经分析最后选定出一培养条件较优组合，即培养基碳源使用蔗糖，培养时间为3d，ph为6.7，温度37。在使用该培养条件培养j8之后，测其发酵液的絮凝率达到了55.2，虽然絮凝率有了12.0的提高，但是比较其他文献报道的絮凝率有达到90.0，还是存在不小的差距，可能有以下几个主要原因：第一，就是在做絮凝实验时高岭土溶液的ph未调到位，文献报道生物絮凝剂在ph为7.0左右时可达到较好的絮凝效果15；第二，影响絮凝剂产生菌产絮凝剂的因数有很多，而影响絮凝剂发挥作用的因数又有很多，本实验由于时间关系只做了四个因数的优化，而未作其他一些重要因数如摇床转速、培养基氮成分及cacl2溶液浓度等的优化，因此未能得出所需的最优组合而影响了菌种的絮凝效果。本实验还有很多后续的工作可做，例如第一，在该实验过程中我们使用高岭土来模拟污水，所以可以直接采用污水来检测絮凝率大小情况; 第二，正如本文前言中所提到的生物絮凝剂有诸多自身独特的优点，因此，可以用化学絮凝剂如al2o3等与本实验菌种产生的生物絮凝剂作絮凝对照，以验证生物絮凝剂优点。然因时间有限上述工作我们都未能完成，深表遗憾。5 参考文献1 salehizadeh h, shojaosadati s a .extracellular biopolymeric floceulants recent trends and biotechnological importancej. biotechnilogy advances,2001,19:371-385.2 nakamura j .conditions for production of microbial cell flocculants by aspergillums sojae 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