手掌参内生真菌代谢产物抗菌活性的研究 毕业论文.doc

青海民族大学 毕 业 论 文（ 设 计 ） 论文题目：手掌参内生真菌代谢产物抗菌活性的研究 学生姓名： 学号： 指导教师： 职称： 院 系： 化学与生命科学学院 专业班级： 二一二年四月廿五日青海民族大学2012届毕业论文（设计）评审表作者姓名民族汉系别化生院专业08药剂入学时间2008.09毕业时间2012.07学习年限四年论文类型实验题目手掌参内生真菌代谢产物抗菌活性的研究评语该论文立题新颖，观点明确，中心突出，具有较高的学术研究参考价值和较大的实践指导意义。试验方法正确，试验数据详实，表格清晰，结论正确，在吸收学术界研究成果的基础上，提出自己的看法，言之成理。论述观点正确，材料比较充实，叙述层次分明，有较强的逻辑性。论文格式正确，书写规范，条理清晰，表达流畅。 指导教师（签名）：成绩系领导小组审查意见系主任（签名）2012年 5 月 9 日 独创性声明本人声明所呈交的毕业论文是本人在导师指导下进行的理论学习、实习实践以及研究所取得的成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得 青海民族大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一起探讨、工作的同学对本论文所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。毕业论文作者签名： 签字日期：2012年5月12日毕业论文版权使用授权书本毕业论文作者完全了解 青海民族大学 有关保留、使用毕业论文的规定。特授权青海民族大学可以将毕业论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。论文作者签名： 签字日期：2012年 5月12日 指导教师签名： 签字日期：2012年5月12日摘 要本论文应用琼脂扩散法对手掌参内生真菌702的代谢产物（水相、酯相）进行抗菌活性研究。结果发现乙酸乙酯相代谢产物对供试菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌有抗菌活性，对其他供试菌有无抗菌活性还有待进一步研究。关键字：手掌参；内生真菌；代谢产物；抗菌活性asbtractin this paper application of agar diffusion method on the gymnadenia conopsea endophytic fungus 702 metabolites (aqueous phase, the ester phase) are antibacterial activity research. the results found that ethyl acetate by metabolites on strains of escherichia coli, staphylococcus aureus has antimicrobial activity, to other strains showed no antibacterial activity.key words: gymnadenia conopsea; endophytic fungi; metabolites; antibacterial activity青海民族大学毕业论文1 引言手掌参（gymnadenia conopsea）含有多糖、苷类、菲醌类和芪类等多种活性成分，具有抗脂质过氧化、抗炎、抗过敏和免疫调节等多种药理作用。块根中含黏液液质、淀粉、蛋白质、糖分、草酸钙及无机盐。块根入药，具有补肾益精、滋补强壮、生津止渴、消瘀止血、理气止痛、解毒之功能，具有极佳的补气效果。主治病后体弱、虚劳消瘦、神经衰弱、肺咳嗽、益肾补脑、糖尿病、肺病、中毒、阳痿、失血、久泻、白带、跌打损伤、瘀血肿痛、乳少、慢性肝炎等症状。因此手掌参具有极高的药用疗效和保健作用。以进一步提高手掌参的临床应用价值，拓展应用范围，有效而充分地利用药材资源，保护生态环境，减少资源的浪费，本文着力于研究手掌参内生真菌代谢产物是否有抗菌活性，为开发新的保健食品与药品做好前期的准备。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种2.1.1.1手掌参内生真菌：702，从手掌参块茎中分离纯化得到。2.1.1.2供试菌：从中检所购买的标准菌株。a) 大肠埃希菌（escherichia coli）cmcc（b）44102b) 金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）cmcc（b）26003c) 铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）cmcc（b）10104d) 乙型溶血性链球菌（streptococcus hemdytis-）cmcc（b）32210e) 藤黄微球菌（micrococcus luteus）cmcc（b）28001f) 乙型副伤寒沙门菌（salmonella paratyphy b）cmcc（b）50094g) 枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）cmcc（b）63501h) 白色念珠菌（candida albicans）cmcc（f）98001i) 黑曲霉（aspergillus niger）cmcc（f）980032.1.2试剂hcl(1mol/l)、naoh (1mol/l)、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、蒸馏水等。2.1.3仪器设备zhjh-1112c超净工作台、bcd-176xz haier冰箱、ghp-9050隔水式恒温培养箱、hzq-x100a恒温振荡培养箱、th-1060高温高压灭菌锅、tgl-16c高速离心机（台式）、sb-5200d超声波清洗机、gzx-9076mbe数显鼓风干燥箱等。2.1.4培养基2.1.4.1营养琼脂培养基（g/l）：用于抗菌活性测试（细菌）。牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化钠 5.0g，琼脂 18.0g，蒸馏水 1000 ml，ph 7.27.4，121c灭菌30min。2.1.4.2改良马丁氏培养基（g/l）：用于抗菌活性测试（真菌）。蛋白胨 5.0g，磷酸氢二钾 1.0g，酵母浸出粉 2.0g，硫酸镁 0.5g，葡萄糖 20.0g，琼脂 18.0g，蒸馏水 1000 ml，ph 6.8，121c灭菌30min。2.1.4.3斜面培养基（g/l）：改良pda培养基，用于内生真菌产孢。马铃薯 200.0g，葡萄糖 20.0g，蛋白胨 2.0g，琼脂粉 20.0g，水 1000ml，ph自然，121c灭菌30min。2.1.4.4种子培养基（g/l）：用于内生真菌种子扩增。葡萄糖 10.0g，玉米粉 10.0g，去脂黄豆粉 20.0g， kh2po4 1.0g， ph自然，121c灭菌30min。2.1.4.5发酵培养基（g/l）：用于内生真菌产生代谢产物。蔗糖 10.0g，黄豆粉 10.0g，玉米粉 10.0g，金属离子（乙酸镉，乙酸镍，柠檬酸铁）各0.1g，盐（kh2po4，mgso4，nacl） 各1.0g， 蒸馏水 1000ml，ph中性，121c灭菌30min。2.2 方法2.2.1 菌种复壮采用平板划线法，将原始菌种接种于pda平板上，在28下培养5天，挑选出与菌株表观特征描述相符的单菌落，接种至pda斜面待用。2.2.2 种子培养配制种子培养基，摇瓶装量为30ml/250ml，121高压灭菌30min。在无菌条件下，取上述菌株斜面，用无菌接种铲铲取一小块（约0.5cm2）菌株培养物，接入种子培养基中，28，220rpm旋转摇床上振荡培养2天。2.2.3 发酵培养配制发酵培养基，摇瓶装量为25ml/250ml，121高压灭菌30min。在无菌条件下，将培养好的种子转入发酵摇瓶中，接种量为10%，28，220rpm旋转摇床上振荡培养5天。2.2.4 发酵液处理摇瓶发酵结束后，12000rpm离心10min，取上清水相，备用。菌丝体沉淀加入一倍体积的丙酮溶剂，振荡搅匀，超声提取30min后，10000rpm离心5min，旋转蒸发浓缩至微干，再用乙酸乙酯（5ml）萃取一次，取乙酸乙酯相、丙酮相，备用。2.2.5 抗菌活性筛选2.2.5.1供试菌种活化（1）接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌等细菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，3035培养1824h。（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2025培养2448h。（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，2328培养35d。2.2.5.2菌悬液或孢子悬液的制备（1）将上述细菌培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度为108cfu（菌落形成单位）/ml的菌悬液。（2）将上述白色念珠菌培养物用 0.9%氯化钠溶液制成浓度为108 cfu/ml的菌悬液。（3）将上述黑曲霉培养物加入 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，制成浓度为108 cfu/ml的孢子悬液。2.2.5.3混菌平板的制备（双层平板）取直径90mm的无菌培养皿，注入加热融化的培养基20ml，使在皿底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至4850（芽孢可至60），加入规定的试验菌悬液适量（1ml/100ml培养基，能得清晰的抑菌圈为度，标准品溶液的抑菌圈直径在1822mm为宜），摇匀，在每个培养皿中分别加入10ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层，放置在水平台上冷却，备用。2.2.5.4粗提物抗菌活性筛选（琼脂扩散法纸片法）将直径为6mm的圆形滤纸片浸入到不同浓度的粗提物溶液中，取出，晾干以挥去溶剂，贴于混菌平板上；同时，溶剂（丙酮、乙酸乙酯）做试剂空白对照。细菌3537培养1824h，白色念珠菌2025培养2448h，黑曲霉2328培养35d。3 实验流程3.1 发酵流程种子培养（28，220rpm旋转摇床上振荡培养2天）发酵培养（接种量为10%，28，220rpm旋转摇床上振荡培养5天）发酵液处理（离心、萃取）代谢产物的收集。3.2 抗菌活性筛选流程供试菌种活化（接种在斜面培养基上在一定条件下培养）菌悬液或孢子悬液的制备（0.9%氯化钠溶液制成浓度为108 cfu/ml的菌悬液）混菌平板的制备（双层平板）粗提物抗菌活性筛选（琼脂扩散法纸片法）。4 结果与讨论4.1 结果将手掌参内生真菌代谢产物水相、酯相（丙酮相、乙酸乙酯相）对七种供试细菌、两种供试真菌进行抗菌活性测试，结果表明乙酸乙酯相对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较低的抗菌活性，其它均无活性，见表1、图1、图2。表1 代谢产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用供试菌抑菌圈直径/mm水相丙酮相乙酸乙酯相大肠埃希菌6.006.006.20金黄色葡萄球菌6.006.006.20图1 手掌参内生真菌代谢产物对大肠埃希菌的抑菌作用图2 手掌参内生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用4.2 讨论 1本实验应用琼脂扩散法即将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(mic)呈负相关关系，即抑菌圈愈大，mic愈小。2应用琼脂扩散法对手掌参内生真菌702进行发酵实验，收集代谢产物（包括水相、酯相），做抑菌活性测试。起初看不到透明的抑菌圈，分析可能造成的原因：培养基的质量，如ph、深度、硬度和表面湿度等；药敏纸片的质量、含药量和保存方式；接种菌量正确与否；试验操作质量；孵育条件，如温度和时间等；抑菌圈测量工具的精度；质控标准菌株本身的药敏特性是否合格，有无变异。通过以上各因素的综合考虑进一步改进实验即增大滤纸片侵入粗提物的次数，增大了上样量，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌进行了抑菌活性的测定，发现手掌参内生真菌代谢产物对以上两菌有抗菌活性，但透明的抑菌圈不是很大，预计再增大上样量可能抑菌效果会更佳。至于最低抑菌浓度的测定，由于收集的手掌参内生真菌代谢产物的过少，所以没有继续。3至于手掌参内生真菌代谢产物是否对其余供试菌有没有抗菌活性由于时间的原因没有做实验，还有待更进一步的研究。4可见手掌参是极为珍贵兰科植物，又具有较高药用价值，成为医药保健等行业的重点开发药材，但由于兰科植物独特的种子结构，使得野生兰花不易成活，所以无论是对兰科植物手掌参的人工扩繁上还是对野生药用手掌参的保护上还是对手掌参的药用价值的研究上都应该做好前期的准备工作，这样不仅可以起到保护环境和野生药用植物永续利用的目的，还可以增加林区药材后备资源的贮量，有利于发展林业生态优先，同时在医药行业发挥手掌参的重要价值。7参考文献1 中国科学院西北高原生物研究所.藏药志m.青海:人民出版社,1991.248.2 青海省药品检验所.青海省藏药研究所.中国藏药m.上海:科学技术出版社,1996.343.3 江苏新医学院.中药大辞典(上册)m.上海:科学技术出版社,1986.436.4 孙明学.大兴安岭森林植物m.哈尔滨:东北林业大学出版社,2006:3.5 中国医学科学院药物研究所.中药志m.北京:人民卫生版社,1982: 276.6 郎楷永,陈心启,罗毅波,等.中国植物志(第17卷)m.北京:科学出版社