家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探 毕业论文.doc

摘要 i 硕 士 学 位 论 文 家蚕 30k 蛋白 lp7 的分离纯化及功能初探 特种经济动物饲养专业硕士研究生 摘 要 家蚕30k蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋 白质。该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋 白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。30k 蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高， 因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。目前，已经分离纯化出的30k蛋白只有4种。家蚕基 因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30k蛋白基因， 这些基因所编码的氨基酸数目在246-271 个之间，理论等电点在6.1-8.4 之间，分子量在28- 31kd之间，它们的氨基酸序列同源性都在 60%以上。本研究通过分析各类 30k蛋白的理论等 电点和分子量，设计并开展了30k 蛋白的纯化工作，获得了一种新的30k 蛋白，在此基础上对 该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下： 本研究首先参考了10个30k蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和 实验条件。通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水 层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30k蛋白。通过基质辅助激光解析 电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， maldi-tof-ms）检测，所获得的蛋白样品信号峰单一。同时，通过maldi- tof-ms获得该蛋白的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting,pmf)，利用 gpmaw（general protein/mass analysis for windows）软件搜索家蚕蛋白质理论数据库，该 蛋白被鉴定为30k蛋白基因bmlp7编码的蛋白lp7，且其序列与已报道的所有30k蛋白序列均 有较大差异。 利用多克隆抗体制备技术，将分离纯化获得的30k 蛋白lp7作为抗原，采取多次皮下注射 的方法对家兔进行免疫，颈动脉放血法采集血液，获得其抗血清。通过饱和硫酸铵沉淀法粗 西南大学硕士学位论文 ii 提抗血清中的抗体，去掉了大量杂质和部分杂蛋白，最后获得了抗30k蛋白lp7的抗体粗品， 达到下一步实验的要求。 通过western blot技术，分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检 测。结果发现，5龄起时，只在血液中检测到lp7；5龄3天时，血液中的lp7 杂交信号强度明 显增加，此外，在头、脂肪体和生殖腺中均检测到lp7，体壁和中肠中也有少量lp7 存在，而 丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。同时，分析家蚕5龄3天组织芯片数据，结果表明 bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达，其中头的表达量最高，在丝腺和马氏管中 只有微量表达，而在中肠和血液中没有表达。因此，我们推测5龄第3天血液中增加的lp7蛋 白是由脂肪体中合成后转移而来的；中肠的微量lp7可能从血液中转移而来；丝腺和马氏管 中bmlp7 基因的表达量较低，导致蛋白水平上检测不到。对羽化第3天的组织器官进行检测， 发现所有组织中均存在lp7，但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。 lp7蛋白在家蚕大量组织器官中的广泛存在，暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常 重要的作用。 同时，利用western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。发现在血液 中，从5龄第3天开始检测到明显lp7杂交信号，并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加， 到化蛹第1天达到最大值，而后逐渐降低，羽化第3天时杂交信号已非常微弱；而在生殖腺中， 5龄第3天的lp7杂交信号非常微弱，而后逐渐增加，蛾期达到最大值。这一结果表明生殖腺 中的lp7 蛋白可能是由血液中转移而来，并参与了卵母细胞的形成，推测该蛋白在家蚕胚胎 发育过程中起着一定作用，可能是胚胎发育的重要能源物质。检测化蛹第6天的雌雄生殖腺， 结果显示雌雄生殖腺中均存在lp7，表明该蛋白在家蚕生殖发育过程中具有重要作用。进一 步分析家蚕芯片时期表达谱，结果表明30k 蛋白基因bmlp7 的表达量从5龄后期急速增加，吐 丝前后达到最大，此后急剧下降，从上簇后的一段时间到化蛹4天，其表达又有缓慢上升的 趋势，化蛹5天后表达量有所降低，到化蛾时又上升。而已有的研究报道表明该基因在脂肪 体中的表达只持续到化蛹第5天。因此，推测30k 蛋白lp7从血液转移到生殖腺的同时，其他 组织中也可能合成该蛋白。 此外，利用玻璃毛细管注射器，将黑曲霉菌（一种真菌）注射到化蛹3天的蚕蛹体内， 分别提取注射24h和48h后的血液，通过western blot技术检测血液中30k蛋白lp7的变化情况。 发现在注射黑曲霉菌的家蚕蛹期血液中，lp7杂交信号有微弱增强，而对照组中，lp7 杂交信 号趋于降低。注射黑曲霉菌后，血液中的lp7有增加的趋势，这可能是由于黑曲霉菌导致家 蚕体内bmlp7基因mrna的表达量增加，也可能是外来物质在某种程度上阻止了血液中lp7蛋 白的转移，从而导致血液中lp7 蛋白含量增加。这一结果暗示30k蛋白lp7可能与家蚕免疫系 统相关。 综上所述，本研究从家蚕血液中分离纯化到一种新的 30k 蛋白 lp7。并制备了 lp7 蛋白 摘要 iii 的多克隆抗体，结合 30k 蛋白基因 bmlp7 的芯片数据分析结果，对该蛋白的功能进行了初步 研究。为进一步研究 lp7 蛋白以及其他 30k 蛋白的功能创造了条件，同时为家蚕免疫机制的 研究提供了新的切入点。 关键词：家蚕 30k蛋白 lp7 分离纯化 功能初探 abstract iii isolation, purification and functional analysis of lp7, one member of 30k family in silkworm, bombyx mori raising of special economic animal liu hongli supervisor professor zhao ping supervisor professor xia qingyou abstract 30k proteins，a family of low molecular lipoprotein, express highly during fifth instar larvae of silkworm, which are specific lipoprotein in silkworm.they are synthesized in the fat body then secreted to hemolymph. 30k proteins are not only the main storage protein for growth, but also the important energy material of the development of embryo. till now, the function about 30k protein is scarce and the function about physiological is not clear completely. 30k proteins have multi-members, whose comparability is so high that is difficult to separate and purify. at present, 4 members of 30k proteins have been separated and purified sucessfully. how many kinds of 30k protein need to further study. after the complete of silkworm genome, we have predicted 10 genes of 30k family by utilizing the database. by analysis of the data, we found that the amino acid numbers encoded by those genes are around 246-271. the theoretical pi of them are between 6.1-8.4 and the molecular weight of them are between 28kd-31kd. whats more, the similarity of the amino acid sequences is above 60%. these information offered important reference for research of 30k protein. based on the result, we started purification of 30k protein, obtained a novel protein, and carried on further analysis and research. considering the difference of the molecular weight and theoretical pi of the 30k proteins, we have designed the purified experiment procedure and experiment condition of separating. by ammonium sulfate precipitation, and three separate technologies (cation ion-exchange chromatography, anion ion-exchange chromatography and hydrophobic chromatography), we separate the proteins of the hemolymph of silkworm sucessfully and got a single strip of 30k protein. by analysis using assist matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (maldi-tof-ms), the single signal peak of this protein sample is obtained. it was proved that we had been succeeded in getting a single member of 30k protein in this research. meanwhile, we got the pmf(peptide mass fingerprint map) of this protein and utilized gpmaw(general protein/mass analysis for windows) software to analyze in the silkworm protein database. we found that this protein is encoded by 30k 西南大学硕士学位论文 iv gene bmlp7.compared the amino acid sequences of this protein with 30k protein reported, we found this protein is a new protein of 30k protein lp7. through polyclone antibody preparation, we obtained the antibody of lp7. firstly, we regarded 30k protein lp7 as the antigen and injected it to the rabbit and carried on the immune program. then, gathered the blood from the arterial, thus succeeded in getting antiserum. utilized the saturation solution of ammonium sulfate to purify the antibody in antiserum, we removed a large number of impurity and other protein. so we succeed in getting the antibody of 30k protein lp7 which can meet the requirement of next experiment. by western blot, we have investigated the 30k protein lp7 in every organization of some periods of silkworm. the result showed that in the 3th day of the fifth instar larvae, lp7 was detected in the hemolymph, head, fat body and gonad, and the level in the hemolymph is the highest.in addition, lp7 appeared faintly in skin and midgut, but never detected in the silk gland. at the same time, we analyzed the gene chip, and the result showed that gene bmlp7 was expressed in head, fat body, skin and gonad。 so, we deduce that lp7 in hemolymph is shifed from fat body，and lp7 in midgut may be shifed from hemolymph.the expression amount of bmlp7 gene is relatively low in silk gland and malpighian tubule, so wo cant detect the protein. in the 3th day of the moth, we detected lp7 in all organization almost, but the expression level of lp7 is faint in the hemolymph, while highest in the gonad. the pattern of 30k protein in silkworm, that suggested its important function in growth of the silkworm, especially in growth of the embryo. at the same time, by western blot, we had investigated the hemolymph and gonad of some periods of the silkworm. the result showed, in the hemolymph, lp7 was detected since the 3th day of five instar, and the signal level of lp7 increased gradually, during the first day of pupa, it reach peak, then reduce gradually and while in the 3th day of moth the signal is very faint; in the gonad, the circs of lp7 reverse completely. in the 3th day of fifth instar, its signal is very faint, and then increase gradually until the moth when reached the peak. so this protein is important to development of silkworms embryo. it may be the important energy substance. we also had investigated the male and female gonad of the 6th day of pupa, lp7 was detected in male and female. it suggested lp7 protein have important function in procreant growth. at the same time, we analyzed the gene chip, and the result showed that gene bmlp7 was expressed since the anaphase of five instar, and the signal level increased gradually, during the prophase of pupa, it reach peak, then reduced, and increased in moth. but existing research indicates expression of this gene in the fat body only last to the 5th day of pupa. it is concluded that lp7 was shifted from the hemolymph to gonad, the gonad oneself might format this protein at the same time. furthermore, using the glass capillary syringe, aspergillus niger, a kind of fungi, was injected into the body of the 3th day of pupa, the hemolymph of 24h and 48h were collected for analysis of lp7 in the hemolymph by western blot. the result showed that in the injected pupa, the lp7 show a abstract v faint increase, compare to the control in the normal situation where the amount of lp7 in hemolymph should be reduced gradually after the 3th day of pupa. after injected, it maybe promoted the synthesizing of lp7, also maybe have some reasons to hold back the shifted of lp7, induced lp7 protein increased in hemolymph. so, we deduce that lp7 may be related to silkworms immune system. as a result, we purified successfully a novel protein, a member of 30k protein family from the hemolymph of silkworm, named as lp7. after preparation of polyclone antibody of this protein, and the result of gene chip, we carried on the preliminary discussion about its possible function. it made a fundament for further studying of lp7. it was also offered important data for researching 30k protein family. at the same time, it offered the new theoretical entry in researching the immune mechanism of silkworm. keywords:silkworm 30k protein lp7 purification functional 西南大学硕士学位论文 vi 目录 1 目 录 第一章 文献综述 1 1.1 脂蛋白 .1 1.1.1 脊椎动物的脂蛋白研究 1 1.1.2 无脊椎动物的脂蛋白研究 2 1.2 家蚕血液中的脂蛋白 .2 1.2.1 30k 蛋白简介 3 1.2.2 家蚕 30k 蛋白的分子性质 .3 1.2.3 30k 蛋白基因的时期特异性 4 1.2.4 30k 蛋白的遗传多态性 5 1.2.5 家蚕 30k 蛋白基因的结构特征 .5 1.2.6 30k 蛋白基因的同源性分析 7 1.2.7 30k 蛋白基因的表达与调控 7 1.2.8 30k 蛋白的生理功能 8 1.3 蛋白质的鉴定 .8 第二章 引言 11 2.1 研究背景及研究意义 11 2.2 技术路线 12 第三章 30k 蛋白 lp7 的分离纯化及鉴定分析 13 3.1 材料及试剂 13 3.1.1 材料 13 3.1.2 主要仪器和试剂 13 3.1.3 主要试剂及溶液的配制 14 3.2 方法 17 3.2.1 血液蛋白的硫酸铵粗提 17 3.2.2 透析 18 3.2.3 蛋白的层析分离 18 西南大学硕士学位论文 2 3.2.4 蛋白的电泳检测 19 3.2.5 蛋白的纯度检测 20 3.2.6 蛋白的质谱鉴定 20 3.3 结果与分析 22 3.3.1 30k 蛋白的分离纯化 22 3.3.2 蛋白的纯度分析 25 3.3.3 蛋白的鉴定分析 26 3.4 讨论 27 第四章 家蚕 30k 蛋白 lp7 多克隆抗体的制备 29 4.1 材料及试剂 29 4.1.1 材料 29 4.1.2 抗原 29 4.1.3 主要试剂和仪器 29 4.1.4 主要试剂及溶液的配制 29 4.2 方法 31 4.2.1 注射 32 4.2.2 效价检测 32 4.2.3 采集血液 32 4.2.4 分离血清 32 4.2.5 抗体的提取 33 4.2.6 抗体的电泳检测 33 4.2.7 抗体的特异性检测 33 4.3 结果与分析 34 4.4 讨论 35 第五章 家蚕 30k 蛋白 lp7 的功能初探 .37 5.1 材料及试剂 37 5.1.1 实验材料 37 5.1.2 主要试剂 37 5.1.3 实验仪器 37 目录 3 5.1.4 主要溶液及试剂的配制 .37 5.2 方法 38 5.2.1 30k 蛋白基因 bmlp7 的芯片数据分析 38 5.2.2 各组织器官中的 lp7 蛋白分析 38 5.2.3 病原物诱导后血液中 lp7 含量变化分析 39 5.3 结果与分析 39 5.3.1 30k 蛋白已经 bmlp7 的芯片分析结果 39 5.3.2 各组织器官中的 lp7 蛋白分析 40 5.3.3 不同时期的血液和生殖腺中 lp7 的含量变化分析 41 5.3.4 病原物诱导后血液中 lp7 蛋白的变化情况 .42 5.4 讨论 43 5.4.1 各组织中的 lp7 蛋白 43 5.4.2 血液中生殖腺中的 lp7 比较 44 5.4.3 病原物诱导后血液中的 lp7 变化 44 第六章 小结 .45 参考文献 47 发表论文目录及参与课题一览表 51 致谢 53 西南大学硕士学位论文 4 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 1.1 脂蛋白 动物脂蛋白的研究已有相当长的历史，1929年，macheboeuf等人在研究马的血浆时，发 现了血浆中脂质和蛋白质相结合的物质即血浆脂蛋白（lipoprotein, lp） 。lp为一种大分子复 合物，可使非水溶性脂类分散在血浆中，使血浆清晰而不混浊 1。1935年mcfarlane用超速离 心的方法分离脂蛋白，为脂蛋白的研究开辟了一个新纪元。 脂蛋白一般由油脂和蛋白质两部分组成。其中蛋白质部分称为载脂蛋白 （apolipoprotein，apoprotein，apo ） ，分为以下几大类：apoa、apob、apoc 和 apod。1972 年 alaupovic 提出将载脂蛋白组成作为鉴定脂蛋白颗粒的标志及脂蛋白分类的基 础，按照这个分类方法一般可将脂蛋白分为 5-7 类。 目前，脂蛋白的分类主要是根据不同密度梯度进行划分，主要分为以下几大类型：乳糜 微粒(chylomicron) ，极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，vldl) ，中间密度脂蛋白 (intermediate density lipoprotein，idl) ，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，ldl) ，高密度 脂蛋白(high density lipoprotein，hdl)和极高密度脂蛋白(very high density lipoprotein，hdl)， 其中一些又可以划分为许多亚类。此外，还可以根据脂蛋白的电泳迁移率对脂蛋白进行分类。 主要分为 -脂蛋白、-脂蛋白、前 -脂蛋白等类型。 随着研究的不断深入，人们发现动物的可溶性脂蛋白是血液中的一群非常重要的蛋白， 特别是对人类来说，脂蛋白系统与心血管疾病密切相关。脂蛋白的代谢规律和功能，已成为 现代人类生活中普遍关注的健康问题之一。对各种动物脂蛋白的研究，可以帮助人类治疗和 预防某些疾病。 1.1.1 脊椎动物的脂蛋白研究 在鱼类的脂蛋白研究中，已发现八目鳗鱼、穴鳗鱼和多刺鱼血液中主要的脂蛋白是极低 密度脂蛋白（50%） 。硬骨鱼的血液脂蛋白中也含有大量的极低密度脂蛋白，但是其脂蛋白组 成中油脂的含量随季节的变化而变化，与鱼类的产卵行为有关。软骨鱼中（除鲟鱼外） ，高 密度脂蛋白的含量都比较低，通常在 10%以下。在鲟鱼、鲑鱼和沙丁鱼中，高密度脂蛋白占 主要的成分，其含量可以达到 1060-3300mg/100ml2-5。此外，除鲟鱼外各种鱼类含有的低 密度脂蛋白量都比较少，有的甚至完全检测不到 6,7。 在两栖动物和爬行动物的研究中，发现它们体内含有的脂蛋白水平都比较低，大部分只 含有少量的高密度脂蛋白，缺乏极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白。而鸟类则有些不同，其体 内以极低密度脂蛋白为主，且其含量在雌性激素的调控下有一定变化。同时，还发现鸟类的 脂蛋白中蛋白成分的含量比较高（45%） ，推测这与鸟类的某些特异性有一定的关系。 在哺乳动物的三大亚类中（单孔目动物，有袋动物和胚胎动物） ，胚胎动物研究最多。 西南大学硕士学位论文 2 哺乳动物的脂蛋白种类较多，它们的组分也非常复杂。目前的初步研究表明，肉食性动物含 有较多高密度脂蛋白，而低密度脂蛋白较少；草食性动物中也是以高密度脂蛋白为主；而杂 食性动物中脂蛋白含量变化比较大。灵长类动物中，除人类以外，其低密度脂蛋白的含量明 显高于肉食性和草食性动物。 1.1.2 无脊椎动物的脂蛋白研究 甲壳类动物的脂蛋白 在对甲壳动物脂蛋白的研究中，发现了脂蛋白的性别特异性与卵、胚胎发育相关。allen 和adiyodi等首次在甲壳类动物中发现了雌特异脂蛋白 8,9。fielder, kerr和ceccaldi分别对提琴 蟹、食草蟹和蓝蟹进行研究时也发现了雌特异脂蛋白 10-12。通过对这些雌特异脂蛋白的研究， 发现脂蛋白与卵子的发生（比如卵巢的成熟）密切相关。kerr等推断血液脂蛋白是卵黄原蛋 白的前体，在胚胎发育过程中卵母细胞将血液脂蛋白合成为卵黄原蛋白 11。barlow, allen分 别对龙虾和邓杰内斯蟹进行了相关脂蛋白的研究 13,14。 研究发现，在甲壳类动物的油脂运输过程中，脂蛋白具有多种功能。这些高密度脂蛋白 在这一过程中扮演着多重角色，例如可将脂质、色素或雌性卵黄原蛋白运输到成熟的卵母细 胞中，还可以运输甘油二脂和甘油三脂等脂质作为能源物质等。 昆虫类的脂蛋白 目前，对昆虫血液脂蛋白的研究方法主要有各种介质电泳染色和密度梯度离心。通过研 究，发现在昆虫血液中广泛存在着可溶性的脂蛋白。这些脂蛋白的种类繁多，其含量和种类 在不同种类的昆虫中通常存在差异。通过电泳的方法，在家蚕、美国蟑螂、马铃薯甲虫中可 以发现4-7 条脂蛋白条带 15-20。thomas 和gilbert 从惜古比天蚕血液中分离到三种脂蛋白。烟青 虫血液中，仅仅高密度脂蛋白组分就可以分为两个组分。蝗虫血液脂蛋白可能是lp-1型脂蛋 白或高密度脂蛋白 21。gamo在家蚕成虫血液中鉴定了三或四群脂蛋白。 whitmore和gilbert对大量昆虫血液进行电泳检测后，发现这些昆虫都含有一种雌特异的 脂蛋白，目前已经知道该蛋白为卵黄原蛋白 15。在惜古比天蚕和蓖麻蚕的研究中，科学家们 发现了它们的血液中含有两种主要的血液脂蛋白，后来证明其中一种为卵黄原蛋白 22,23。 将昆虫血液脂蛋白与人类脂蛋白相比较，发现在人类的低密度脂蛋白中胆固醇和磷脂占 主要成分，而在昆虫中其主要成分是甘油二脂。昆虫脂蛋白的这一特点与其特有的生长发育 机能相关。同时，昆虫脂蛋白的多样性，暗示各类脂蛋白在昆虫的发育过程中起着不同的生 理功能。目前已有研究证明血液脂蛋白在甘油二脂的释放以及在固醇运输中起着重要作用 24。 1.2 家蚕血液中的脂蛋白 家蚕是重要的鳞翅目昆虫，具有开放性的血液循环系统。其血液量占其体重的 第一章 文献综述 3 21%25%。家蚕血液中含有大量海藻糖和游离氨基酸。血液中的蛋白含量随着家蚕的生长发 育而不断变化，4龄时开始增加，到化蛹前后达到最大，之后又逐渐降低。 家蚕血液中的蛋白大部分由脂肪体合成，且这些蛋白的表达大多具有明显的时期特异性， 它们在家蚕的生长发育过程中往往具有非常重要的生理功能。家蚕30k蛋白就是这类蛋白中 的一种。 1.2.1 30k蛋白简介 最初的研究者们在对家蚕5龄血液进行sds-page分析时，发现在大约30kd处有一群小 分子量脂蛋白（low molecular weight lipoprotein），之后，研究者们便称该群蛋白为家蚕30k 蛋白 25。该类蛋白是家蚕5龄初期以后血液中表达量最多的一类蛋白质，在化蛹第三天时， 约占血液蛋白的40%左右。在雌蚕蛹期的发育过程中，大量的30k 蛋白被卵母细胞摄取，使 卵中30k蛋白的含量达到了卵黄蛋白的 35%26,27。 1.2.2 家蚕30k蛋白的分子性质 maki, n等用5龄幼虫的血液和卵母细胞提取液为材料，利用硫酸铵沉淀，凝胶层析和 deae层析等方法纯化出4种30k 蛋白（lp1 、lp2、lp3、 lp4）。通过sds-page电泳，发现 它们的分子量在2729kd之间。30k 蛋白是糖脂蛋白质，平均含脂类0.7% ，含糖类2.2%。它 们在血液中一部分以单体形式存在，一部分形成二聚体。 表 1.1 家蚕 30k 蛋白的比较分析(sun q,2007) 由于30k蛋白的等电点，分子量极其相似，分离困难，因此家蚕究竟有多少种30k 蛋白尚 未完全研究清楚，目前已经纯化到的只有前面提到的4种。家蚕基因框架图的完成为我们提 供了丰富的数据资源 28，孙全（2007）通过对家蚕全基因组数据进行生物信息学分析，预测 到10个30k蛋白基因。这些基因编码的蛋白质氨基酸数目在246-271 个之间，理论等电点在 6.1-8.4之间，分子量在28-31kd之间，它们的氨基酸序列同源性在60%以上。根据它们与报道 预测的 30k 蛋白基因 理论 pi/mw 已报道的 30k 蛋白基因 理论 pi/mw 预测和报道的基 因间相似度 blastn 预测和报道的基 因间相似度 blastp bmlp1 6.11 / 29733.87 lp1 6.11 / 29733.87 99 99 bmlp2 6.33 / 30937.00 lp2 6.83 / 30034.93 97 97 bmlp3 6.44 / 29414.47 lp3 6.90 / 29242.33 99 99 bmlp1 6.11 / 29733.87 6g1 6.33 / 29661.81 99 100 bmlp3 6.44 / 29414.47 19g1 6.91 / 29499.58 98 99 bmlp4 6.84 / 30242.27 21g1 6.33 / 30183.20 98 98 bmlp5 7.56 / 28259.33 lp3 6.90 / 29242.33 87 68 bmlp6 8.31 / 30932.13 lp2 6.83 / 30034.93 89 78 bmlp7 7.64 / 29391.52 19g1 6.91 / 29499.58 94 93 bmlp8 8.23 / 29383.43 19g1 6.91 / 29499.58 86 74 bmlp9 6.34 / 29427.36 19g1 6.91 / 29499.58 86 75 bmlp10 7.01 / 29043.90 21g1 6.33 / 30183.20 85 71 西南大学硕士学位论文 4 的30k蛋白的相似度由高到低命名为 bmlp1-bmlp1029，如上表所示。分析还发现，这些基因 分布在6条scaffold上面，其中bmlp5、bmlp6和bmlp10位于 scafold003164上，bmlp1和bmlp4位 于scaffold005297上，bmlp2和bmlp7位于scaffold006074上，bmlp9位于scaffold010759，bmlp3 位于scaffold013959，bmlp8位于scaffold019608上。 1.2.3 30k蛋白基因的时期特异性 30k蛋白在家蚕血液中的表达具有时期特异性。 5龄初期以前，在血液中几乎检测不到该 类蛋白的存在，从5龄开始，其浓度逐渐增加，到吐丝至化蛹期间，其浓度达到最大值，而 后又逐渐减少，到成虫羽化时几乎消失。此外，不同种类的30k蛋白，在血液中表达的起始 和终末时期具有一定差异，但总体差异不大。 图 1.1 家蚕 30k 蛋白基因不同时期在脂肪体中的半定量 rt-pcr 分析(sun q,2007) 1: 5 龄幼虫第 1 天 2: 5 龄幼虫第 2 天 3: 5 龄幼虫第 3 天 4: 5 龄幼虫第 4 天 5: 5 龄幼虫第 6 天 6: 吐丝第 1 天 7: 化蛹第 1 天 8: 化蛹第 3 天 9: 化蛹第 5 天 10: 化蛹第 7 天 对脂肪体中 30k 蛋白基因的 mrna 进行分析，发现这些基因的 mrna 表达变化与 30k 蛋白在血液中的表达变化高度一致。5 龄初期以前，脂肪体内检测不到该类基因 mrna 的活 性，5 龄第 3 天其活性急剧上升，第 4 天达到最大值，此后略有下降，到吐丝期活性再度上 升后迅速下降，化蛹时活性完全消失。因此，30k 蛋白的合成时期集中在幼虫终龄的一段时 间内，化蛹时，尽管 30k 蛋白在血液中的浓度最高，但此时 30k 蛋白的合成可能已经停止。 孙全（2007）用不同时期的脂肪体 cdna 作为模板，通过半定量 pcr 检测 30k 蛋白基因的 表达( 如图 1.1)。结果发现除 bmlp5 和 bmlp10 没有检测到表达外，其余 8 个 30k 蛋白基因都 有表达，且其表达时期并不完全一致。bmlp2 基因最早开始表达，从 5 龄第 2 天就可以检测 到，其表达时期一直持续到化蛹第 5 天，其表达时期是最长的。从 5 龄第 3 天开始， bmlp3、 bmlp7 和 bmlp9 开始表达，其中 bmlp3 和 bmlp7 的表达时期持续到化蛹第 5 天，而 bmlp9 在化蛹第 3 天以后就检测不到表达。而其余的几个基因都从 5 龄第 4 天才开始检测到 表达，其中 bmlp1 和 bmlp8 的表达持续到化蛹第 5 天，bmlp4 在化蛹第 3 天后没有表达， bmlp6 的表达持续时间最短，化蛹第一天后就检测不到了。这些基因的表达量最高的时期都 主要集中在吐丝期前后，这个时期是家蚕从幼虫发育到蛹的重要变态时期，这表明 30k 蛋白 第一章 文献综述 5 质可能与这段时间家蚕体内发生剧烈的生理变化有一定的关系。 1.2.4 30k蛋白的遗传多态性 gamo等利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对30k 蛋白进行调查研究时，发现在 30kd处从高到低主 要分成3个部分，他们将其分别命名为lps、lpm和lpf。根据电泳迁移度的差异，lps又可 分为a、b 和c3种变异型，根据品种不同，目前已发现 a型、b型、ab型、bc 型和abc型等， 但没有发现c型品种。对这些品种进行交配试验，结果证明lps 的合成是由常染色体上的共显 性等位基因lp-sa 、lp-sb、lp-sab和lp-sbc 支配的。同时，还发现有不表达lpm 的品种， 推测为lp-m缺失 25。孙全等对不同品种的家蚕血液进行了电泳发现，除c108品种表现出5条 蛋白条带之外各品种都主要表现出4条蛋白条带，但是每条蛋白条带的表达起始时期不完全 一致，并且表达持续时间也不同，推测这可能与品种的差异有关。 1.2.5 家蚕30k蛋白基因的结构特征 sakai n等用5龄中期幼虫的脂肪体rna构建了一个cdna 文库，从该文库分离到了30k蛋 白基因的5个阳性克隆，分别命名为pbmhpc-6，pbmhpc-12，pbmhpc-19，pbmhpc-21 ， pbmhpc-2330。他们对5个阳性克隆进行了序列分析，发现它们在核苷酸序列上非常相似， pbmhpc-12， pbmhpc-21和 pbmhpc-23之间的序列同源性超过了85%，pbmhpc-6和 pbmhpc-12之间的同源性较小，但也有54%。每个cdna的终止密码taa或tag的下游 3883bp处都有一个加a信号 aataaa的共有序列出现。 pbmhpc-6，pbmhpc- 21，pbmhpc-23 的3端都含有一个短的poly(a)尾巴，而pbmhpc-12 和 pbmhpc-19的 poly（a）尾极短，甚至没有，sakai等推测这可能是cdna合成或克隆过程中rna末端区的切 除造成的，也可能是这些基因的mrna所固有的。 这些基因编码的蛋白序列初级结构表明，每个cdna克隆都含有一个完整的orf序列， 从5 端首个atg后分别跟随一个编码251至264个氨基酸的orf。30k蛋白各成员间的初级结构 具有较高的同源性，最高的达到了89%，而较低的也有43%。这些蛋白序列均含有一组疏水 性氨基酸，将其序列与已纯化30k 蛋白的氨基酸序列进行比较，表明存在典型的转膜分泌的 信号序列。该信号序列中大多为疏水性氨基酸，1个单一的ser残基紧随该疏水性结构域。推 测pbmhpc-6、 pbmhpc-12和 pbmhpc-19的信号序列的断裂点位于前部的ala-thr, ala-ala或 ala-gly之间。 pbmhpc-21和pbmhpc-23 的氨基酸序列还不知道，但根据报道，许多分泌蛋白信号序列 的断裂通常发生在一个具有小侧链的氨基酸残基处，考虑到前面3种信号肽的结构规律，推 测这两种的断裂位点可能在ala-val和ala-gly之间。 为了分析30k蛋白组分的基因结构和染色体组成， mori s等从家蚕基因文库中分离了这 些基因的cdna 相应的基因组克隆，并对它们的结构进行了比较 31,32。对克隆的基因编码部 分进行测序，发现除了2个错配序列外，推断6g1 的氨基酸序列与其cdna的序列一致，但是 西南大学硕士学位论文 6 cdna在5非转录区的序列与相应基因组克隆的序列显著不同，说明至少有一个内含子存在于 6g1基因的5非翻译区。通过引物延伸实验和s1核酸保护分析，证实在 6g1基因的蛋白质编码 外显子上游约800bp处的区域还有1个短的外显子。同样的分析结果表明，21g1和19g1 基因的 外显子/内含子组成类似于6g1基因。 图 1.2 30k 蛋白基因的结构和一些调控元件(sun q,2007) 30k 基因的上游调控元件由 nsite 程序来鉴定。上游 500bp 和下游 100bp 的区域是通过刻度来画的。箭头 代表转录起始位点。核酸序列的位置是根据它与预测的转录起始位点之间的距离来计算来。开放性阅读框是 用黑色的盒子表示的。 数字表示他们与转录起始位点之间的距离。白色盒子表示 est 的覆盖区域。sp1 因 子和 gata-1 因子的结合位点分别用白色的和黑色的圆圈表示。白色的星表示 nf_kb 基序，黑色的星表示 oct-1 基序。 孙全等对生物信息学预测到的十条30k 基因（bmlp1-bmlp10 ） 进行了基因组结构分析( 图 1.2)，结果显示这些基因的上游调控序列都有一个启动子，这些启动子呈现典型tata 结构特 征。分析其基因上游500bp和下游100bp的潜在调控元件，发现这10个基因都含有sp1 和 第一章 文献综述 7 gata-1结合位点。sp1是一个很常见的转录调控因子结合位点，它通过结合启动子元件中的 gc-boxes而达到调节基