中度嗜盐菌Vibrio sp.K1-L一种噬菌体的分离、鉴定 毕业论文.doc

存档日期： 2011 年 06 月 存档编号： 本科生毕业论文（设计） 论 文 题 目：中度嗜盐菌 vibrio sp.k1-l一种噬菌体的 分离、鉴定 姓 名： 院 系： 生命科学学院 专 业： 生物技术 年 级、班 组： 指 导 教 师： 徐州师范大学生命科学学院印制 1 中度嗜盐菌 vibrio sp.k1-l 一种噬菌体的分离、鉴定 摘要：用从山西运城盐湖水样中分离到的一株中度嗜盐菌 vibrio sp.k1-l 做为 指示菌筛选从同处水样中的噬菌体，将获得的其中一种命名为 ad 的噬菌体。我 们从生理和生化角度对其做了研究；对噬菌体基因组以及结构蛋白做了研究； 用扫描电镜观察到了噬菌体结合到指示菌表面的现象。 关键词：噬菌体；盐湖；中度嗜盐菌 isolation and characteraztion of a phage infecting moderately halophilic vibrio sp.k1-l youkeji supervisor:wang ziyuan (school of life sciences, xuzhou normal university, xuzhou,jiangsu,221116,china) abstract: a moderately halophilic bacterial strain vibrio sp.k1-l，isolated from yuncheng saline was used as indicator to scan the water sample from the same location for phage detection. one phage, designated as was isolated. physiological and biochemical characterization of this phage were conducted. the investigation of phage genome and structure proteins were performed. this phage is capable of binding on the surface of indicator cells of vibrio sp.k1-l and was clearly demonstrated by scan electron microcopy. key words : phages；saline；moderate halophiles. 目 录 2 引言 .3 1 材料与方 法 3 1.1 供试材料 3 1.2 配置培养基材料 4 1.3 实验器材 4 1.4 嗜盐菌噬菌体的获得 5 1.5 噬菌体的验证 5 1.6 噬菌体的删选及纯化 6 1.7 氯仿耐受性试验 6 1.8 噬菌体的大量培养 7 1.9 噬菌体的过滤及浓缩 7 1.10 对噬菌体浓缩液进行 selfinosetm 4b 琼脂糖凝胶过滤层析 7 1.11 噬菌体 dna 的电泳 7 1.12 噬菌体蛋白质 sdspage 凝胶电泳 8 1.13 噬菌体电镜观察 8 2 结果与分 析 9 2.1 噬菌体的确认 9 2.2 噬菌体 dna 电泳 10 2.3 噬菌体蛋白质 sdspage 凝胶电泳 12 2.4 噬菌体的电镜观察 12 3 讨论 .13 4 结果 13 致谢 .14 参考文献 .14 3 引言 噬菌体（bacteriophage,phage）是寄生于细菌、放线菌、真菌等微生物 的病毒,体积微小,结构简单,广泛分布于自然界中，凡是有细菌的场所，都可能 有相应的噬菌体存在。根据噬菌体与宿主菌的关系，可分为裂解性噬菌体和溶 原性噬菌体。前者可在敏感宿主菌内增殖,并使之裂解；后者基因组整合于宿主 菌基因组中,成为细菌 dna 的一部分,不单独复制。 鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的宿主特异性,可利用噬菌体作细菌的鉴定和分 型,亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病 1 2。由于噬菌体结构简单、 基因数少，是分子生物学和基因工程的良好实验系统。噬菌体自被发现以来,就被 作为基因复制及表达调控研究的模型。 直到上世纪末，抗生素的滥用而产生耐药菌株和畜禽产品药物残留等问题 的日益严重，大量耐药菌株的出现使得抗生素在细菌疾病的治疗上不再那么有 效，噬菌体作为抗菌治疗生物制剂的研究才又重新受到人们的关注。目前噬菌 体制剂已受到许多国外生物技术公司的重视,噬菌体研究又成为国外科研机构的 研究热点之一。 噬菌体是在自然界的数量庞大。噬菌体基因本身就是十分重要的生物自然。 因此分离筛选研究新的噬菌体是一现十分重要的工作 3。 本实验以山西运城的一株中度嗜盐菌为宿主菌，分离筛选选出特定的噬菌 体，为后续研究作准备。 1 材料与方法 1.1 供试材料 （1）菌种：从盐湖水中分离出的 vibrio sp.k1-l 嗜盐菌 （2）实验用具：玻璃平板，试管，试管架，玻璃烧杯，塑料烧杯，移液管，酒 精灯，超净工作台，60恒温水浴锅，180 恒温烘箱，37恒温培养箱，液 体摇床培养箱，高压灭菌锅等实验器材 1.2 配置培养基材料 （1）配置 30%的 salt water4 4 表 1 30%海水配方 table1 30% seawater recipe 药品 用量 nacl 240g mgcl.6h2o 30g mgso4.7h2o 35g kcl 7g cacl2 (1ml/l) 5ml/l 用 1m naoh 调至 ph7.5， 用量约为 2ml /l。 加纯水定容至 1l （2）配制 15%的 mgm（液 400 ml） 表 2 15%的 mgm 配方 table1 15% mgm recipe 药品 用量 salt water 200 ml puer water 187 ml peptone 2 g yesat 0.4 g 配置 25%的 mgm（液 500 ml） 表 3 25%的 mgm 配方 table1 25% mgm recipe 药品 用量 salt water 417 ml puer water 67 ml peptone 2.5 g yesat 0.5 g 用 1m naoh 调 ph 至 7.5 , 约 2000ul （3）配置病毒稀释液 vds （dilute solution of virus） vds = 30%sw + 无菌水 例：6ml 20%vds = 4ml 30%sw + 2ml 无菌水 1.3 实验器材 vs-840-1 超净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 mls-3020 高压灭菌锅 sanyo electric co.,ltd 5 dnp-9052 型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 galanz wd700 型微波炉 佛山市顺德区格兰仕电器有限公司 dhg-9070a 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 mdf-382e 超低温保存箱 sanyo electric co.,ltd thz-c 恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂 摇床培养箱 atl-031 shanghai chemstar instraments co.ltd lhs-100cl 型恒温恒湿培养箱 上海绿宇精密仪器制造有限公司生产 lrh-250-gs 型 人工气候箱 广东医疗器械厂生产 h1650-w 型高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司生产 tc-25/h 型基因扩增仪 杭州博日科技有限公司生产 lg2000 型凝胶成像仪 杭州市朗基科学仪器有限公司生产 hz-2011-ka 型震荡培养箱 太仓市科教器材厂生产 dyy-6c 型电泳仪 北京六一六亿仪器厂生产 1.4 嗜盐菌噬菌体的获得 采用直接倒平板法分离嗜盐菌噬菌体 5 6 1 采集水样。 2 将细菌和其它固体颗粒离心 5000r/min，10 min 沉降。上清液备用。 3 将 100ul 盐湖水样上清液和 150ul(处于对数生长早期的受体菌 k1 培养液加入到已 融化且保持在 50的 0.5%琼脂中，混匀。 4 倒入已准备好的培养皿中(30ml mgm 10%sw 1.5%琼脂 若事先置冰箱中先取出预热 至室温） ，快速左右晃动，使上层琼脂覆盖全培养皿。 5 将培养皿过夜倒置培养(37） ，于第二天观察有无噬菌斑的出现。 1.5 噬菌体的验证 在观察到噬菌斑的培养皿中，用移液器吸取形态典型，和其他噬菌斑有较大空间 的噬菌斑上层培养基，在一预先存入 200ul vds(噬菌斑稀释缓冲液）新的 1.5ml 反应 管中反复上下吹打，然后漩涡振荡 1min。此为噬菌体保存液。 将 50ml 纯细菌和 3ml 0.5%的琼脂混匀，均匀分布在底层培养基上，然后取 2ul 噬 菌体保存液，滴在预先标记的部位，过夜培养，于第二天观察。若观察到所标记的部 位出现溶菌现象，则证明该噬菌体能够感染所用菌株。可以进行下一步纯化。 6 1.6 噬菌体的筛选及纯化 7 8 准备：由于噬菌体的数量庞大，在实验前我们必须对其液体进行稀释 方法：取上一步获得的噬菌体保存液 2ul，加入到 198ulvds 即总稀释 100 倍，然后再 从上面的 200ul 液体中取 10ul，加入到 90ulvds 中即总稀释 10 倍，接着以 10 倍的差 距继续稀释，以达到所需稀释倍数。 前一天在液体培养的试管中加入新鲜培养液，以便菌种正好生长至对数期，以利于 第二天的接种。对 2.5%mgm 1.5%agard 的固体培养基(底层培养基）和 2.5%mgm0.7%agar(上层培养基）进行灭菌，然后底层培养基倒平板并写上相应的时 间，将平板放在超净工作台上至冷凝后待用，同时对 k1 菌进行液体培养。 第二天，在超净工作台中操作，将昨天准备好的平板先放置在 37恒温箱中保温并 开启水浴锅定温度到 50，将数支灭菌试管插在试管架上放入水浴锅保温，然后按照 稀释方法对噬菌体保存液进行稀释，取 ep 管分别与稀释度相对应，点燃酒精灯，在 ep 管中先加 50ul k1 细菌液，然后取一定 10 微升的噬菌体稀释液到 ep 管中，vortex, 然后放置 30min，使噬菌体有充分时间感染细菌。等时间差不多的时候在微波炉中加 热上层培养基，用移液管吸取 3ml 到水浴锅中的试管里，接着再加 5060ulvds 至 ep 管中 (方便吸取 ep 管中的液体)，将 ep 管所有液体转移到试管中，快速 vortex 混 匀，避免产生气泡。取出平板，标上日期，写明相应稀释度，快速将相对应的试管里 的液体倒入平板上，左右晃动使之覆盖平板，待干后置于 37的温箱中倒置过夜培养。 顶层 agar（0.5%） 底层 agar（2.5%） 次日，观察平板上的噬菌斑，挑取形态典型，和其他噬菌斑间隔大的噬菌体重复上 述步骤。经过多次重复删选，直到获得现状一致的噬菌斑，可以认为噬菌斑得到了纯 化。 1.7 氯仿耐受性试验 噬菌体悬液加三分之一体积的氯仿，剧烈震荡 1min，然后静置 1h，将样品离心与 7 氯仿分离，上清液中存活的噬菌体用来检测活性。 1.8 噬菌体的大量培养 本实验采用平板法：取 50ul 细菌培养液加入 300010000pfu 的噬菌体，混合，室 温孵育 10min，倾倒至 3ml topagar 中，快速漩涡振荡后倒入已准备好的培养皿中， 第二天，取 5ml 噬菌体稀释液加入到过夜培养至 conflunt 的培养皿中，将 topagar 刮至一边，用移液器移至离心管中，在 6000rpm 4条件下离心 20min，上清夜中含有 大量噬菌体可用于进一步研究。 1.9 噬菌体的过滤及浓缩 1 上一步离心好的上清液经 0.22um 滤膜过滤，除去剩余的细菌。 取 0.5ml 保存，剩 下的噬菌体液加 rna 酶和 dna 酶(rna 酶的原浓度为 10mg/ml,dna 酶原浓度为 250mg/ml，体积都为噬菌体液的十分之一，两者共同作用除去噬菌体扩增液中细菌 裂解后释放的染色体 dna 和 rna） ，然后在 37条件下消化 1h。 2 接着向噬菌体扩增液中家 nacl 至 1m，加 peg6000 固体，终浓度为 10%(w/v） ，混匀 溶解后 4过夜，peg6000 沉淀噬菌体，获得噬菌体浓缩液。 1.10 对噬菌体浓缩液进行 selfinosetm 4b 琼脂糖凝胶过滤层析 经 peg 沉降的噬菌体溶液以 6000rpm 离心 30min，弃上清液，沉淀用 2mlsw 溶解。 用相应缓冲液(5%sw）充分平衡后，取 1ml 样品上样，以 1ml/min 流速洗脱，1ml/ 管收集过柱后溶液，共各 25 ep 管，记录所测峰值。 样品收集完后，用 23 倍与柱体积的 2.5%sw 清洗凝胶柱，然后将凝胶柱在 4条件下保存待用。 注：本次实验所浓缩得到的噬菌体为 k1 菌的某一种噬菌体，其噬菌斑比较大，故而称 其为 kd，以下文章涉及 kd 都是此种噬菌体。 1.11 噬菌体 dna 的电泳 取层析后 kd 峰值管，取出 400ul 于新的 ep 管中，分别加 表 4 电泳样品配方 table4 electrophoresis sample recipe 药品 用量 终浓度 无菌水 800ul sds （10%） 48ul 8 edta（500mm/l） 12ul 蛋白酶 k （20mg/ml） 3ul tris-hcl，ph7.5， 1m 12ul 反应条件：56，1h （2） kd 按 0.7 倍体积加入异丙醇(有絮状沉淀） ，室温保存 3h。 （3） 离心，吸取掉 ep 管中的异丙醇，加入 100ul70%乙醇，离心 13000rpm， 2min 倒去上清液，加入 50ul 无菌水，混匀，然后吸取 4ul 点样至电泳槽(加 1ul 加样缓 冲液） ，用 1%琼脂糖凝胶电泳，55min，75v。剩余样品-20保存。 6 泳结束后，胶放入 eb 中，染色 15min。 拍照 1.12 噬菌体蛋白质 sdspage 凝胶电泳 按以下比例制备电泳用凝胶： 12%分离胶 5%浓缩胶 dd h2o： 3.45ml 1.425ml acrbis: 4.00ml 425ul buffer： 2.5ml 0.625ml 10%sds: 0.1ml 25ul 10%aps: 50ul 12.5ul twmed: 适量（30ul） 15ul 先配好分离胶，将电泳槽组装好，先将配好的分离胶装入电泳槽，快到接近顶的时 候加入水，等待分离胶凝固（剩余分离胶可作为分离胶凝固的标准） ，配好浓缩胶，将 电泳槽中的水倒掉，加入浓缩胶，插入梳子，等待浓缩胶凝固。 注：胶中不能留有气泡，以免影响电泳。 配 50ul 样品 5 待电泳样：2 加样缓冲液，然后煮沸 5min，取 30ul 样品待胶凝固 后加样。 连接设备电泳，首先 85v 跑 2h，然后取下胶，在固定液中固定 30min，接着将胶放 入染色液中染色 40min，完后将胶加入脱色液中进行脱色，一般以三遍为准，最后当放 入水中让其自然褪色。 （在固定和脱色之前，都要将固定液和脱色液在 60水浴下预热） 对胶进行拍照。 9 1.13 噬菌体电镜观察 试剂准备： 4%戊二醛：吸取 25%戊二醛 1 份，无菌水 5 份，混匀共 3ml 2%戊二醛：吸取 4%戊二醛 1 份，无菌水 1 份，混匀共 2ml 5%salt water 配制梯度乙醇：20%、50%、80%、无水乙醇 100%叔丁醇 （1）实验前一夜制备细菌悬液 （2）将所需试剂放在 4预冷 30min（除叔丁醇，其结晶点为 23.5） （3）吸取 500l 菌液于 1.5ml 离心管中，6000rpm 离心 10min，吸去上清液，加入 噬菌体 5l， 室温放置 10min （4）加 100l5%salt water，移液器吹匀，4000rpm 离心 5min，吸去上清。 （5）加 400l4%戊二醛，移液器吹匀，0冰箱固定 60min （6）4000rpm 离心 5min，弃上清，加 400l5%salt water，移液器吹匀。4000rpm 离心 5min，吸去上清。 （7）加 400l2%戊二醛，移液器吹匀，0冰箱 30min （8）4000rpm 离心 5min，弃上清，加 400l5%salt water，移液器吹匀。4000rpm 离心 5min，吸去上清。 （9）梯度乙醇 20%、50%、80%、无水乙醇脱水。依次各梯度乙醇 400l和菌体 混匀后，0静置 10min，4000rpm 离心 5min，吸去上清。 （10）加 100%叔丁醇 400l置换 100%乙醇，混匀后放置十几分钟。 （11）将准备好的纯化的高滴度噬菌体溶液滴至 300 目的聚醋酸甲基乙烯脂和碳 包被的铜网，干燥 15min 至多余水分完全消失。接着用 2%磷钨酸负染色。用 zeiss em10 透射电镜在不同放大倍数下观察。拍照分析。 10 2 结果与分析 2.1 噬菌体的确认 图 1 k1 菌的噬菌斑 firure 1 k1 plaque bacteria 结果：我们首先用双层平板法检测所采盐湖水样是否有可以感染 vibrio sp.k1-l 的噬 菌体。所得结果如图一，显示有典型的噬菌斑存在。证明该菌有多种噬菌体可以侵染。 图 2 k 大噬菌体造成的噬菌斑 figure2 k caused a large phage plaques 结果：经过对 vibrio sp.k1-l 噬菌体的删选，删选出造成噬菌斑较大，边缘较整齐的 噬菌体，再经过多次的纯化后，所得结果如图 2，图中所示噬菌斑大小不一致，但大致 形态相似，我们认为该噬菌体造成的噬菌斑就是该形态。 11 2.2 噬菌体 dna 电泳 图 3 噬菌体核酸提取物 figure3 phage nucleic acid extract 结果：通过对噬菌体的核酸物质提取后，跑电泳，所得结果如图 3 所示，从左起第一 条带为标准样品，第三个条带为噬菌体核酸物质，从图可知该噬菌体的有大量的核酸 物质且大小在 23000 以上。 图 4 加入 rna 酶处理后 figure4 rna added after enzyme treatment 12 图 5 加入 dna 酶处理后 figure5 after adding dna enzyme treatment 结果：为确认噬菌体核算物质是 dna 还是 rna，将其分别用 dna 酶和 rna 酶处理后跑电 泳,所得结果如图 4 和图 5 所示，从左起开始的第一条带为标准样品， 图 4 经 rna 酶 处理后电泳后无条带，图 5 经 dna 酶处理后电泳后有条带，对比得出该噬菌体以 dna 为遗传物质。 2.3 噬菌体蛋白质 sdspage 凝胶电泳 图 6 蛋白质 sds-page 凝胶电泳 figure6 sds - page gel electrophoresis of protein 13 图 7 噬菌体浓缩后浓度的测定（以吸光度为标准） figure7 after the determination of the concentration of phage concentration (in absorbance as the standard) 结果：选取适当量的噬菌体进行蛋白质 sds-page 凝胶电泳，所得结果如图 6 所示，从右起 第一条带为标准样品，经过两次相同的电泳对比，可以得出该噬菌体外壳有多种蛋白质组成且大小 有层次分布，之后噬菌体经过过柱浓缩后以吸光度为标准测定其最大浓度，如图 7 所示，最大峰值 近 0.45。 2.4 噬菌体的电镜观察 结果：将 vibrio sp.k1-l 进行噬菌体的侵染实验，然后在扫描电镜下观察，如图 8 所 示，下图为光细菌的形态，上图为经过侵染后细菌的形态，细菌表面有颗粒状物质， 电镜放大倍数比较大，基本可以排除盐颗粒的可能，所以可以确定其为该细菌的噬菌 体。 图 8 k 大噬菌体的电镜图 figure8 k large electron micrographs of phage 14 3 讨论 在实验过程中，我们翻阅了许多文献，也进行可很多的尝试，比如在开始阶段， 对于噬菌体的大量培养，我们尝试过不同的盐浓度 9，试用过液体培养法，最后确定 了用双层培养法培养噬菌体 10，再通过分离获得高浓度的噬菌体，但这种方法比较繁 琐，随机性比较大，容易产生误差，比如所测噬菌体的量变化比较大，对此，噬菌体 的保存，培养基的营养成分，宿主菌的新鲜程度有很大影响，后续实验培养噬菌体应 注意这些方面。 初步分离得到的噬菌斑形态来看，大小不一致。边缘有些整齐，有些毛糙。我们 选择了噬菌斑大，边缘整齐的噬菌斑进一步纯化分离。 但是经过多次纯化步骤，仍然 会出现大小不均匀，两种边缘都出现的噬菌斑。因此我们确定该噬菌体是单一纯化的 噬菌体。出现噬菌斑不一致的情况可能和寄主菌能够群游有关。 再者，在做蛋白质凝胶的时候，从培养基上所刮下来的物品中，细菌的浓度大， 过滤噬菌体后，容易堵塞过滤柱，对于过滤柱的保养要做到位，以免下次实验出现错 误。 4 结果 本实验得出以下结果：首先，我们从运城盐湖水样中经分离得到了一株能够感染 k1 菌的烈性噬菌体。 接着，我们对该种噬菌体进行了纯化和鉴定，证明该噬菌体遗传 物质是双链 dna。电镜观察表明，噬菌体通过附着到细菌细胞表面受体感染细菌。由于 宿主菌是范家同学长获得的新型菌种，而且对运城盐湖至今没有有关噬菌体研究的报 道，因此可基本确定该种噬菌体为新型噬菌体。 致谢 通过本次毕业设计，我感受颇多。从查找收集资料到设计方案的确立，一直到最 后的设计完成，其间的每一步骤都十分重要必不可少的，极大地增进了自己对所学知 识的理解和对新知识的学习，培养了严谨的工作作风和态度。同时也进一步认识到： 做任何事都是一个不断完善改进的过程，一定要踏实严谨，又要敢于不断创新。 本课程设计是在王子元教授的悉心指导下得以完成的。在毕业实验期间王子元教授 不仅从实验方向、实验思路中给我认真的指导，而且对具体的实验过程提供有益的指 15 导和帮助。他工作认真负责、为人师表，这些优点都是我将在今后的工作和学习生活 中要不断学习的。谨在此向他表示最诚挚的感谢！另外在此还应特别感谢我的同学陈 妮娜、研究生范家同、成守亮、马英、耿苗、刘抗，实验员老师及所有教过我、给我 指导过的老师，祝工作顺利，万事如意！ 参考文献 1 陈晓春,王继文,曹永长,毕英佐,马静云. 噬菌体在疾病治疗方面的应用及研究j. 动物医 学进展, 2005,(01 2 王盛,童贻刚. 噬菌体治疗研究进展j. 微生物学通报, 2009,(07) . 3 孙荣华,李菁华等. 大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究j.中国病原生物学 杂志, 2009, 4(2)：88-104. 4dr.mike.dyall-smith.protocols for haloarcheal genetics. .version 7,march2008.12 5 rupniak ht. hill bt,studies with a clonogenic assay for tumor cells from human biopsy material and its comparison with other survival assay .br j cancer, 1980, 41(4) suppl :255 . 6 巢卫, 彭祥鄂 , 叶雨文. 体外双层琼脂培养法检测抗癌药对人癌干细胞集落形成的能力j. 中南大学学报(医学版), 1986,(03) 7 侯宁, 刘春光, 吴郁文, 张翠兰, 张炎. 双层培养基