病毒类生物制品安检和效检

病毒类生物制品 安全检验和效力检验 1 序言序言 “安全、有效、稳定、均一 ”是兽用生物制品质量 概念的 4个核心要素，对于生物制品而言 ,安全和效 力检验是所有预防用生物制品的必检项目，也是 生物制品企业质量管理和检验人员最主要的日常 工作。严格规范的试验操作是取得真实准确的检 验结果，保证制品质量的前题。以下就病毒类制 品的安全和效力检验问题与大家进行交流。 2 一、一、 常见病毒类制品的安全检验常见病毒类制品的安全检验 l 安全检验的原理及技术依据 l 安全检验的一般要求 l 安全检验的一般判定原则 l 病毒类制品安全检验的种类和控制要点 l 影响安全检验结果的主要因素 l 安全检验注意事项 l 安全检验的安全措施 3 安全检验的原理及技术依据安全检验的原理及技术依据 对人、畜及环境安全是对各类兽用生物制品最基本的要求 ，安全检验的 原理 就是生物制品大部分是用活的微生物制备 而成，有些 微生物本身就是强毒或残余一定毒力 ;另外在制 品 生产过程中 也可能由原材料、设备或操作过程造成 外源毒 素或微生物污染 ，如果没有严格的控制手段和检验标准有可 能 对人畜和环境造成危害 。因此兽用生物制品质量标准规定 ：对于预防、治疗用途的兽用生物制品必须进行安全检验。 兽用生物制品安全检验的 技术依据 如下： 1、中华人民共和国兽药典、兽用生物制品质量标准、生物 制品规程 2、企业的内控标准 3、企业安全检验 SOP 4 安全检验的一般要求安全检验的一般要求 l 1、安检样品 ： 除另有规定外，每批抽 3瓶混和后按照 规定进行检验和判定； l 2、场地： 安全检验应在专用动物舍内进行，不得在野 外进行 l 3、安检动物： 安检动物必须符合各制品质量标准和规 程的要求 l 4、安检动物的饲养： 安检动物应单独饲养不得与效检 免疫动物及攻毒动物同舍饲养，以免影响检验结果 l 5、特殊规定： 凡生产口蹄疫疫苗的企业，对其生产的 猪用活疫苗均需增加乳鼠进行安检。凡使用猪瘟强毒 或污染猪瘟强毒的生物制品企业，对其所生产的猪用 活疫苗均需用无猪瘟抗体的敏感猪进行安检。 (避免交 叉感染、散毒 ) 5 安全检验的一般判定原则安全检验的一般判定原则 l 安检动物在检验期间如有死亡时，必须及时解 剖，明确原因，确属意外死亡时， 作无结果论 ；如检验结果可疑，难以判定时，应以加倍的 该种动物 重检 ；如不安全，则该批制品应于 报 废 。 l 凡规定用多种动物进行安检的制品，只要有一 种动物的安检结果不符合规定，即不得出售。 6 病毒类制品安全检验的种类和要点病毒类制品安全检验的种类和要点 1、用本动物进行安全检验 l 用制品的靶动物进行安全检验是 最直接最有效 的安全检验方法，也是 大部分兽用生物制品采用的方法。在用本动物进行安全检验时必须注意 以下问题： l （ 1）对于禽用疫苗 : a.检验用鸡必须采用 SPF鸡，检验用鸡胚必须采用 SPF鸡胚，其 优点 是不需测定有关抗体。 b.对于某些标准暂时规定采用易 感禽的，在 试验前 应 测定 针对被检制品抗原的特异性抗体 水平，抗体效 价必须符合规定的标准。 l 在接种疫苗以后，必须及时进行观察，特别是对于发病病程短，不以 死亡作为判定标准的制品（如法氏囊、传支等疫苗） l 标准规定必须解剖的制品，必须在规定的时间内进行解剖和判定，需 要进行传代的，应采集病料按规定进行传代。 l （ 2）对于哺乳类动物疫苗 ， 在接种前应测定针对被检制品抗原的特异性 抗体水平，抗体效价必须符合规定的标准。 a.在接种疫苗以后，如规定某些观察和测定指标的（如体温、局部 反应、肌体状态、食欲变化等），必须按规定全面测定和观察，并及时 详细记录。 b.对于某些规定的特殊判定标准（如羊痘活疫苗，需测定痘肿反应 大小），应及时准确测量并记录具体数据。 7 2、用实验动物进行安全检验、用实验动物进行安全检验 l 有的制品标准规定可以用试验动物进行安全检验 l 如牛瘟活疫苗（用小白鼠和豚鼠进行检验） l 伪狂犬灭活疫苗（用家兔进行检验） 这种检验方法较少采用，其特点是试验动物比本动物 更为易感，而且试验动物均可表现出特异性的临床症 状。对于该类试验 观察要点是 特异性的临床症状 8 3、用本动物和实验动物同时进行安全检验、用本动物和实验动物同时进行安全检验 l 用本动物和试验动物同时进行安全试验，是大多数哺 乳类动物用疫苗及多联疫苗采用的方法。在这种安全 试验中： a.小实验动物一般承担非特异性的安全评价指标（ 内毒素、佐剂安全性等） ; b.本动物承担特异性安全评价指标 ; 对于这种安全检验，除个别产品的特殊规定外， 一般 判定原则是 :所有试验均应符合规定，只要有一种试验 不安全，均判为产品不安全。 9 4、特殊的安全检验指标、特殊的安全检验指标 有一些产品，因靶病毒对不同年龄的动 物致病性不同，可能规定需用不同年龄 段的本动物进行安全检验（如孕畜、仔 畜等），对于这类制品应按规定进行检 验。 10 影响安全检验结果的主要因素影响安全检验结果的主要因素 l 对于病毒类制品来说， 由于病毒与细菌不同 ： a.病毒更 易受抗体及各种理化因素的影响； b.病毒类疫苗在生产 过程中除易受细菌污染外，更易受外源病毒污染， 因 此潜在的不安全因素更为复杂 ，因此在对病毒类疫苗 特别是弱毒活疫苗进行检验时应注意以下几点： l （ 1）接种动物前及接种过程中应注意对稀释样品进行 冷藏，防止病毒灭活及被细菌污染。 （ 2）必须确保试验动物的抗体水平符合规定 （ 3）试验动物的年龄、品种甚至性别必须符合规定 （ 4）某些非致死性病毒病病程较短，症状不典型，应 及时全面观察，需要解剖的应及时解剖，防止因观察 不及时造成不安全产品的放行。 11 安全检验注意事项安全检验注意事项 l 1.为保证检验的公正性，避免在对安全检验结果判定的 主观影响，因此 应由 2名检验员 共同进行。 l 2.为防止污染，涉及疫苗稀释等操作步骤，应当在 无菌 条件 下进行。 l 3.动物 饲养环境 要符合动物饲养和检验的要求，如果环 境因素不稳定，应当设置合适数量的同来源 动物对照 。 l 4.检验过程中，如出现发病时，要增加观察次数，对死 亡动物要及时进行解剖并进行 无害化处理 12 安全检验的安全检验的 安全措施安全措施 1、 检验过程中应注意 防止 对检验 人员和环境 的 污染 ，检验人员必须穿戴工作服、口罩及相关的 安全防护器具，撒在操作台、地面的产品要及时 进行原位消毒。 2、 检验完毕后开封的产品均要进行 高压灭菌 处 理。 3、 发病或死亡动物、粪便及其污染物必须严格 按照 “防止散毒 ”等相关规定处理。 4、 怀孕或手部有外伤的 检验人员 禁止解剖死亡 动物。 5、 在检验过程中发生 烈性传染病或人员意外 时 ，必须 迅速报告 有关部门采取紧急措施。 13 二、病毒类制品的效力检验二、病毒类制品的效力检验 l 效力检验的原理及依据 l 效力检验的一般要求 l 效力检验的一般判定原则 l 病毒类制品效力检验 的种类及质量控制要点 l 影响效力检验结果的主要因素 l 效力检验注意事项 l 效力检验的安全措施 14 效力检验的原理及技术依据效力检验的原理及技术依据 l 对于兽用预防和治疗类生物制品来说，效力是制品的核心质量要 素之一， 效力是制品中发挥主要作用的核心成分如抗原、抗体及佐剂 等效能的集中反映， 效力检验是对以上各成分效能的综合指标进行检 验，是制品放行前 最主要 的评价指标，因此兽用生物制品质量标准和 规程规定预防和治疗用生物制品必须进行效力检验， 影响制品效力的 主要因素 有抗原的免疫原性、有效抗原的含量、佐剂的效能等，在现 有的效力检验方法中， 免疫攻毒试验是 对以上各因素进行综合评价的 最有效 的直接 方法 ，而 抗原含量测定、免疫动物后的抗体效价测定等 均属于间接方法 ， 但由于其指标与免疫攻毒保护试验具有一定的 平行 关系 因此可作为某些制品的效力检验指标。从生物制品的发展趋势来 看，由于人们对动物保护、环境和生物安全的重视，这些 间接方法特 别是体外评价方法是最主要的发展方向 。 l 效力检验的技术依据如下： 1、中华人民共和国兽药典、兽用生物制品质量标准、生物制品规程 2、企业的内控标准 3、企业效力检验 SOP 15 效力检验的一般要求效力检验的一般要求 l 样品要求 ： a.除另有规定外一般每批疫苗 任抽 1瓶 按 规定进行检验； b.同批疫苗分为几个亚批时，效力检验 均应按亚批分别抽样分别检验，不能采用检验一个亚 批代表其它批或几个亚批混和效检的方法进行检验。 l 动物要求 ： a.应选用同品种、体重大致相同并符合实 验动物要求的健康易感动物； b.外购动物要求来源相同 ,免疫前应隔离观察适当时间，确证符合试验动物标准 要求后方可使用。 c.隔离舍内饲养。 l 接种要求 ： a.免疫动物和对照动物必须同时注射 ;b.强 毒不能与免疫接种部位在同一个部位 ,例如左后腿接种 疫苗，攻毒部位应选右后腿。 16 效力检验的一般判定原则效力检验的一般判定原则 l 1、 免疫动物 中途有意外死亡或损失 ，如存活头数仍能达到要求 的保护头数以上时，可以进行攻毒，攻毒后如能达到标准规定的 保护头数，可判为合格。达不到保护头数判为不合格，不得以保 护百分率作为判定依据。攻毒后不合格，应算为一次检验。 l 2、对 不规律的效检结果 如本动物效检不合格，小动物检验合格， 应判为不合格。 l 3、同时 做两个稀释度检验时 ，高稀释度（如万倍）合格，低稀释 度（如 5000倍）不合格，判为无结果。 l 4、 攻毒对照动物 死亡或发病头数 达不到规定要求，但免疫组动物 符合标准时，该次检验判为无结果 ，不计算在检验次数内，但 必 须签在批签发报表中 。 对照动物不发病死亡时，不得重复攻毒。 l 5、 重检规定： a.规定用本动物检验的制品，效检两次不合格，应 报废，不得进行第 3次检验。 b.规定用本动物或小动物进行效检的 制品，可用小动物检 2次，本动物检 1次，如本动物检验不合格， 不得再用小动物进行重检。 17 病毒类制品效力检验病毒类制品效力检验 的种类及质量控制要点的种类及质量控制要点 l 病毒类制品的效力检验种类： 1、按照检验形式 分为：体内试验和体外试验 2类， 2、根据检验内容 分为：攻毒保护试验、抗原含量测 定、免疫抗体测定 3类。 对于弱毒类活疫苗多采用抗原含量测定 对于灭活疫苗多采用攻毒保护试验 以下按照第二种分类方式介绍 3类效力检验方法的质量 控制要点 18 （ 1）攻毒保护试验）攻毒保护试验 l 攻毒保护试验原理： 使用疫苗进行接种的最终目的是使接种 过的动物获得 抵抗强毒病原感染 的能力。因此，对靶动物或已经 建立的实验动物模型进行接种后，用强毒病原进行人工攻毒，根 据动物的保护情况判断疫苗的效力，是用以检验疫苗效力的最直 观方法。 l 攻毒保护试验种类 ： 由于效力检验采用的检验动物均为小样 本， 一般不以保护百分率表示试验结果，按照结果表示方法分为 ：绝对保护比例、相对保护比率、半数保护量（ PD50）、保护指 数（ PI值） 4种方法。 19 l a.绝对保护比例方法 ： 主要用于采用致死性强毒进行攻击的 产品或发病症状特异、判定客观（如新城疫灭活疫苗）等产品， 要求对照动物全部发病死亡，免疫动物以攻毒后的绝对保护数为 判定标准。（免疫 7/10、对照 0/5） l b.相对保护比率方法 ： 主要用于攻毒毒株毒力较弱，不一定 全部发病死亡的制品，如传染性支气管炎（免疫 6/8、对照 0/4或 免疫 8/8对照 3/4）、兔瘟灭活疫苗（免疫 4/4、对照 3/4） ） l c.半数保护量（ PD50）和保护指数（ PI值） 半数保护量测定方法 :是以不同剂量疫苗免疫动物，采用定量 强毒进行攻击，通过计算可使 50%动物得到保护的疫苗免疫剂量 评价制品的效力，该方法是攻毒保护试验的定量方法，是目前为 止较为科学的一种方法。目前采用该方法的产品主要有口蹄疫灭 活疫苗、鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗等。 保护指数方法 :在国内使用不普遍，主要用于致病力较弱，评价 指标不十分客观的制品，如马立克活疫苗的攻毒保护试验等，通 过计算免疫组和对照组保护百分比的比值进行效力评价。狂犬病 灭活疫苗的攻毒保护试验，通过同时计算疫苗和参考疫苗的 PD50 ，公式为：（疫苗的 PD50/参考疫苗的 PD50） 参考疫苗的 IU值 ，每头份应 2IU。 20 攻毒保护试验的质量控制要点攻毒保护试验的质量控制要点 l 1、动物： 必须是易感动物，在免疫前除 SPF动物外， 应按要求测定抗体效价。 l 2、免疫： 免疫接种量应准确 l 3、攻击用强毒： 攻毒前应准确测定毒价，在接种过程 中应注意对稀释毒液进行低温保存。 l 4、试验观察： 攻毒后应及时观察，有剖检要求的应在 规定时间进行剖检观察，要求分离病毒的应及时无菌 采集病料。 l 5、记录： 应按效力检验 SOP及时详细记录规定项目 21 采用此方法的主要产品有： l 鸡新城疫灭活疫苗、鸡传染性鼻炎 -鸡新城疫二联 灭活疫苗、 伪狂犬病灭活疫苗 、兔病毒性出血症灭 活疫苗、猪口蹄疫 O型灭活疫苗、牛口蹄疫 O型灭活 疫苗、 猪瘟活疫苗 (I)、猪瘟活疫苗（ II） 、 鸡传 染性喉气管炎活疫苗 、 鸡传 染性法氏囊病中等毒 力株活疫苗 、 猪瘟、猪丹毒、猪多 杀 性巴氏杆菌 三 联 活疫苗 、 伪 狂犬活疫苗 、 鸡传 染性支气管炎 活疫苗、 鸡 新城疫中等毒力活疫苗、 鸡 新城疫低 毒力活疫苗、 鸡 新城疫 -鸡传 染性支气管炎二 联 活 疫苗 、 鸭瘟活疫苗。 注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他 方法。 22 攻毒保护试验效检方法举例攻毒保护试验效检方法举例 l 牛口蹄疫 O型灭活疫苗效力检验： 用至少 6月龄的 健康易感牛（细胞中和抗体滴度 1： 8，或乳鼠中 和抗体滴度 1： 4） 15头，分为 3组，每组 5头，将 待检疫苗分为 1头份、 1/3头份、 1/9头份 3个剂量组 ，每一剂量组分别于颈部肌肉注射 5头牛。接种 21 天后，连同条件相同的对照牛 2头，每头牛舌上表 面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫 O型病毒强毒，每 点 0.1ml（共 0.2ml，含 10000ID50）。连续观察 10日 。对照牛应至少 3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在 舌面出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保 护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水泡或溃 疡判为不保护。根据免疫牛的保护数，按 Reed- Muench法计算被检疫苗的 PD50，每头份疫苗应至 少含 3 PD50。 23 （ 2）抗原含量测定）抗原含量测定 l 抗原含量测定原理： 制品中的抗原含量与免疫效力 一般呈平行关系，因此通过测定制品中的有效抗原含 量可间接反映制品的效力。 l 测定抗原含量的方法分为体内 和 体外两类： l a.对于病毒活疫苗主要是测定病毒含量 ，方法主要有 : 动物、鸡胚、细胞、血凝试验等。其中采用动物和鸡 胚方法属于 体内试验 ；采用细胞和血凝试验为 体外试 验 。结果表示主要有 LD5O 、 TCID50 、 ELD50、 PD50、 EID5O）或蚀班数（ PFU）、 HA价等 l b.对于灭活疫苗的抗原含量测定， 体内试验 主要是 PD50方法， 体外试验 主要是一些血清学方法如 ELISA等 。 24 病毒含量测定病毒含量测定 l 病毒含量测定 方法：每批疫苗按瓶签注明的头份用 指定的稀释液作适当稀释后，通常选择三个最佳稀 释度，按规定的途径和剂量接种一定数目指定的实 验动物、细胞、鸡胚，在规定的时间内观察，根据 动物反应、细胞病变、鸡胚存活数或病变数，通过 计算 LD5O、 TCID50 、 ELD50、 PD50、 EID5O或蚀班数（ PFU），以此来判定疫苗的效力。 25 l 病毒含量测定 常见疫苗（ 12种）： 口蹄疫 O、 A型活疫苗、 山羊活疫苗、鸡传 染性喉气管炎活疫苗、鸡传染性法氏囊病 中等毒力株活疫苗、鸡传染性支气管炎活 疫苗、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡新城 疫低毒力活疫苗、鸡新城疫、鸡传染性支 气管炎二联活疫苗、鸡痘活疫苗（ ）、 小鹅瘟活疫苗 、 鸡马 立克氏病活疫苗、 鸡 马 力克氏病火 鸡 疱疹病毒活疫苗 。 l 注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他 方法。 26 病毒含量测定方法举例病毒含量测定方法举例 l 口蹄疫 O、 A型活疫苗单价苗的效力检验： 将疫苗 用 PBS做 10倍系列稀释， O型苗以 10-5、 10-6、 10-7 三个个稀释度， A型苗以 10-6、 10-7、 10-83个稀释 度，各皮下接种 3 4日龄乳鼠 4只，每只 0.1ml， 观察 4-5日，根据乳鼠发病死亡数计算 LD50，每 0.1ml O型苗 105.5 LD50， A型苗 106.5LD50，判 为合格。 l 山羊痘活疫苗效力检验方法之一： 按瓶签注明 头份，用生理盐水稀释测其毒价，每头份病毒含 量应 103.5 TCID50。 27 （ 3）免疫抗体测定）免疫抗体测定 l 免疫抗体测定的原理： 主要是采用 血清学试验测 定 疫苗免疫动物后产生的 保护性抗体效价 ， 间接 反映制品的效力 。病毒性产品主要有病毒中和试 验、 HI试验、 ELISA等，其中中和试验有体内和 体外试验两种。 HI试验、 ELISA均属于体外试验 。 28 病毒中和试验病毒中和试验 l 病毒中和试验有固定病毒稀释血清、固定血清 稀释病毒两种方法 l a.固定病毒稀释血清法以中和抗体效价表示结 果 ， 中和抗体效价指能使 50%指示动物（鸡胚 、细胞）得到保护的抗体稀释度 l b.固定血清稀释病毒以中和指数表示结果 中和指数指试验组 LD50（ LD5O、 TCID50 、 ELD50、 PD50、 EID5O ）与对照组 LD50（ LD5O、 TCID50 、 ELD50、 PD50、 EID5O ）的比值 29 采用抗体效价测定的常见制品采用抗体效价测定的常见制品 l 主要有鸡产蛋下降综合征灭活疫苗（ HI抗体测 定）、马传染性贫血活疫苗（补体结合试验和 琼脂扩散试验）法氏囊疫苗（中和抗体）。禽 流感灭活疫苗等。 l 鸡 新城疫 -鸡传 染性支气管炎二 联 活疫 苗 、小鹅瘟活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗 。 注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他 方法。 30 抗体效价测定方法举例抗体效价测定方法举例 l 鸡产蛋下降综合症效力检验： 用 3-6周龄的健康易 感鸡（ HI抗体 1： 4） 10只，每只肌肉或皮下注 射疫苗 0.5ml, 另取 10只鸡饲养不免疫； 3-5周后 采血，测定 HI抗体，免疫鸡 HI抗体 几何平均滴度 1： 128，对照鸡抗体 HI抗体效价应 1： 4。 l 小鹅瘟活疫苗效力检验方法之一 ；取健康成年鹅 4 只，分别采血 1ml,分离血清并混合备用。然后注 射 1个使用剂量的疫苗，每只鹅 1ml， 21-