曹会凯开题报告

附表 4： 河北科技师范学院 硕士学位研究生论文开题报告 系（所） 理化学院 专 业 应用化学 学生姓名 曹会凯 导师姓名 杨越冬 教授 课题名称山楂中黄酮类化合物的研究 入学时间 2010 年 9 月 河北科技师范学院研究生处制 填表时间 2011 年 12 月 5 日 一、立题依据（可加页） 包括科学意义、应用前景、国内外研究现状和发展趋势、创新点、主要参考文献。 科学意义 山楂果为蔷薇科山楂属的干燥成熟果实，可药食两用，在我国资源丰富。 本草纲 目记载本品“ 酸甘微温，消食积，补脾 ”。山楂性温、味酸、具有消食化积、活血化瘀 之功效，临床主要将其干燥果实用于食积、妇女产后瘀阻腹痛、疝气、小儿痘疹等 1。 对山楂化学成分的研究始于 1921 年,20 世纪 50 年代以前的研究,多集中在其所含的纤维 素、鞣质、三萜类等成分,50 年代以后随着黄酮类化合物的迅速发展,发现山楂中所含的 黄酮类成分对心血管系统有明显的药理作用,研究重点转向黄酮类成分。到目前为止,从 山楂( 果肉、核及叶) 中发现且分离得到的物质有 150 多种,其中主要有黄酮类、低聚黄烷 类、有机酸类,另外还含有三萜类、甾体类和有机胺类等 2。 在诸多中药有效成分研究中，黄酮类化合物（flavonoid，又称类黄酮化合物）因其 在菊花、银杏叶、苦参、槲寄生等多种中药材中均有分布，来源较广泛；且具有抗氧化、 抗肿瘤、抗血栓、扩血管、抗病毒等多种生物活性而被众多学者所青睐，并经相关研究 开发而逐步应用于临床。如葛根异黄酮及其主要成分大豆素（daidzein）和葛根素 （puerarin）有治疗心肌缺血的药理作用并用于治疗冠心病；水飞蓟素具有改善肝功能、 保护肝细胞膜作用而运用于各种急慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝等肝功能障碍疾病的治疗； 大豆异黄酮亦有用于乳腺癌治疗的报道。 3 应用前景 山楂黄酮的药用研究多有报道。1、山楂黄酮对心脑血管系统的作用。此类研究主 要集中在 2004 年以后。崔新羽，崔新颖 4通过研究发现山楂黄酮对实验性大鼠急性心 肌缺血具有明显的保护作用。程再兴等 5以小鼠为研究对象，山楂总黄酮能改善小鼠血 瘀性脑缺血-再灌注模型血液流变性，预防脑水肿的发生和 Ca2+超载，改善脑组织的病 理情况，具有保护脑缺血-再灌注损伤的作用。王燕霖等 6以三氯化铁损伤大鼠血管， 观察山楂总黄酮注射液对大鼠大脑中动脉血栓所致局部脑缺血性损伤的保护作用，证明 山楂总黄酮注射液对脑缺血性损伤具有良好的保护作用。周玲等 7以小鼠为对象，观察 山楂总黄酮抗心肌缺血作用，发现山楂总黄酮对预防心肌缺血有较好作用，其机制可能 与抑制心肌自由基生成有关。姜建芳 8等通过研究山楂总黄酮对大鼠离体血管功能的影 响，得出结论：山楂总黄酮对大鼠离体血管具有舒张作用，该作用主要是通过抑制细胞 外 Ca2+内流，抑制细胞内贮 Ca2+释放，以及激活非选择性钾通道和内向整流钾通道来 实现的。2、山楂黄酮的抗肿瘤作用。张妍等 9以人喉癌 Hep-2 细胞株为研究对象，发 现山楂果总黄酮对正常细胞的生长无明显影响,但对肿瘤细胞的生长却有显著抑制作用, 并发现山楂果总黄酮在体外对 Hep-2 细胞的抑制作用可能是通过钙超载,进而导致细胞 凋亡。柳嘉等 10研究山楂黄酮提取物的抗氧化能力以及对人肝癌 Hep-G2 细胞和人肠癌 Caco-2 细胞生长抑制作用发现山楂黄酮提取物对人肝癌细胞 Hep-G2 和人肠道癌细胞 Caco-2 都有明显的生长抑制作用，且呈剂量效应。此外山楂黄酮还有降血脂 11-15和修 复肝脏损伤的作用 16-19。 国内外研究现状和发展趋势 黄酮类化合物有多种提取方法，最传统的方法为索氏提取法。随着学科相互渗透， 对提取原理的深入研究，出现了许多新的技术，如超临界流体萃取法(SFE)技术、超声 辅助提取、微波提取，快速溶剂萃取等。超临界二氧化碳萃取技术在萃取过程中只需加 入少量夹带剂，对环境污染较小、提取效率高。但是操作压力高，一般在 20-50MPa、 能量消耗大、设备放大时成本高；超声提取法优点在于提取时间适中、温度一般较低、 收率高，并且可以为样品大生产的提取、分离提供合理化生产工艺流程及参数。并且低 温提取有利于有效成分的保护。缺点是受超声波功率的限制，大规模生产的经济性不好， 其安全性也有待验证；微波萃取法在所有提取方法中所用时间最短，且得率较高，但是 微波辐射对人体有害，反应剧烈，不易控制，因此不能应用于规模生产。快速溶剂萃取 方法是近两年兴起的一种新型萃取方法，快速溶剂萃取较超声波法和索氏提取法提取时 间大幅度减少,提取效率明显提高。另外,快速溶剂萃取可自动化控制,操作简单、方便， 可用于规模化生产。除此之外还有超高压萃取，以及酶和表面活性剂辅助提取。 在分离粗提品时，常用的方法有硅胶吸附色谱、葡聚糖凝胶吸附色谱、大孔吸附树 脂色谱、制备薄层色谱以及制备液相色谱等；通过旋光、熔点及其它的物理参数判断浓 度，常用的检查方法有 TLC、HPTLC、HPLC 等；常用的结构鉴定波谱学方法有 IR、UV、X-ray、MS、NMR 等。近十年来，色谱技术在分离时取得了巨大的突破， HPLC 连用技术（如 LC-UV，LC-MS，LC-NMR）不断发展与完善，及其在黄酮类化 合物中的应用，可以快速、准确的实现微量成分的结构鉴定及有效成分的定量分析，并 在此基础上建立高效、快速、微量的分析方法。 目前已知的山楂黄酮主要是以洋芹素(Apigenin) 20和木犀草素(Luteolin) 21为苷元的 一系列苷类,也有少数报道山楂中含 4-黄芩素(Scutellarein)衍生物。山楂属植物黄酮苷元 的基本结构如图 1 所示。糖和苷元大多以碳-碳键直接相连成碳苷类化合物。以洋芹素 为苷元的苷类有牡荆素(Vitexin) 22、异牡荆素(Isovitexin) 23及其衍生苷类,以及洋芹素的 5 种己酮呋喃糖苷类(Ketohexosefuranoside)山楂苷 A、B 、C、D 、I 24；木犀草素的碳苷 类则主要为红蓼素(Orien-tin)和异红蓼素(Isoorientin) 25,26及其衍生苷类。 洋芹素：R 1=H，R 2=H O R1OH OHO OH R2 木犀草素：R 1=OH，R 2=H 4-黄芩素：R 1=H，R 2=OH 图 1 山楂属植物中黄酮苷元的结构 创新点 (1)采用快速溶剂萃取技术提取山楂中黄酮类化合物。 (2)利用硅胶柱色谱和高速逆流色谱手段对山楂中黄酮类化合物进行分离纯化；采用 UV、IR、LC-MS、NMR 等方法对黄酮类化合物进行结构鉴定。 主要参考文献： 1宋立人,洪恂 ,丁绪亮,等.现代中药学大辞典上册北京: 人民卫生出版,2001:165. 2刘荣华,邵峰 ,邓雅琼.等.山楂化学成分研究进展J.中药,2008,31(7):1100-1108. 3陈锐,孔繁智 .黄酮类化合物的临床运用概况J.浙江中医杂志,2011,46(12):919. 4崔新羽,崔新颖 .山楂黄酮对实验性大鼠急性心肌缺血保护作用的研究J.中国地方病防 治杂志,2004,19(5):275-276. 5程再兴,陈红等 .山楂总黄酮对血瘀合并脑缺血-再灌注小鼠的影响J.中国医药导报, 2009,6（26）:8. 6王燕霖,龚小妹等 .山楂总黄酮注射液对大鼠大脑中动脉血栓所致局部脑缺血性损伤的 保护作用J.中国现代医药杂志,2010,12（6）:66-67. 7周玲,邓琳 ,赵湜.山楂总黄酮抗心肌缺血作用及机制J.中国生化药物杂志,2011,32(6): 475-477. 8姜建芳，沈晓兰，张宁.山楂总黄酮对大鼠离体血管功能的影响及其机制J.中国现代 应用药学，2011,28(7）. 9张妍,李厚伟 ,等.山楂果总黄酮的提取分离及体外抗肿瘤活性J.中草药,2004,35(7):787- 789. 10柳嘉，David Glen POPOVICH，景浩.山楂黄酮提取物的抗氧化活性和对癌细胞生长 抑制作用J.食品科学,2010,31(3):220-223. 11林秋实,陈吉棣 .山楂及山楂黄酮预防大鼠脂质代谢紊乱的分子机制研究J.营养学报, 2000,22(2):131-135. 12谷仿丽,陈乃富 ,等.山楂总黄酮和茶多酚联合调节血脂的优化配比研究J.皖西学院学 报,2009,25(2). 13谢伟华,孙超 ,刘淑敏.山碴黄酮对高脂血模型小鼠血脂及生脂基因转录表达的影响J. 中国中药杂志,2009,34(2):224-225. 14高莹,肖颖 .山楂及山楂黄酮提取物调节大鼠血脂的效果研究J.中国食品卫生杂志, 2002,14(3):14-16. 15刘北林,董继生 ,等.山楂黄酮提取及降血脂研究J.食品科,2007,28(5):324-326. 16薛冬英，陈一奕 ,叶军.丹参酚酸和山楂黄酮联用对大鼠非酒精性脂肪性肝病脂质 过氧化损伤的影响J.中国中西医结合消化杂志,2011,19(6):373-377. 17邱蓓蕾,张家瑞 .山楂黄酮与运动对非酒精性脂肪肝影响的研究现状J.科技资讯， 2011,17:219. 18潘莹，江海燕，丁国强.大果山植总黄酮对实验性酒精肝损伤保护作用的研究J.中 医药学刊,2004,22(12):2293-2311. 19罗先钦,黄崇刚 ,等.山楂总黄酮对复合因素致大鼠脂肪肝模型脂质代谢与低密度脂蛋 白受体表达的影响J.中草药，2011,42(7）：1367-1373. 20Melikoglu G,Mericli F, Mericli A H.Flavonoids of Crataegus orientalis.Bollettino Chimico Farmaceutico,1999,138(7):351-352. 21Titova A A,Batyuk V S.C-glycosides of Crataegus curvisepala.Khim.Prir.Soedin.,1986,(3):373. 22孙敬勇,杨书斌 ,谢鸿霞,等.山楂化学成分研究.中草药,2002,33(6):483-486. 23Nikolov N,Manolov P,Ivanov V,etal.Flavanoid mixture from plantmaterial.Belg,BE 843187,1976,8. 24张培成,徐绥绪 .山楂叶化学成分研究.药学学报,2001,36(10):754-757. 25Nikolov N,Seligmann O,Wagner H,etal.New flavonoid glycosides from Cratageus monogyna and Crataegus pentagyna.PlantaMed.,1982, 44(1):50-53. 26NikolovN,Wagner H,ChopinJ,etal.Recent investigations of Crataegus flavonoids.Stud.Org.Chem.(Amsterdam),Volume Date 1981,11(Flavonoids Bioflavonoids),1982:325-344. 二、研究方案(可加页） 包括研究目标、研究内容、研究方法、技术路线、可行性分析、预期进展。 研究目标与研究内容 1.黄酮类化合物的提取：利用微波法、超临界流体萃取技术、快速溶剂萃取法确定最佳 提取方法。 2.黄酮类化合物的分离纯化：利用硅胶柱色谱及高速逆流色谱进行分离纯化，最后根据 分离的具体情况结合其它的纯化方法，如制备型液相色谱。 3.黄酮类化合物的分析及结构鉴定：分离出单体后，利用波谱方法对结构进行鉴定。 研究方法 1.黄酮类化合物的提取： 1.1 微波提取：先进行单因素试验，因素为微波时间、微波功率、乙醇浓度及料液比； 再通过正交试验，获得最佳工艺参数。 1.2 索氏提取：先进行单因素试验，因素为回流时间、回流温度、乙醇浓度及料液比； 再通过正交试验，获得最佳工艺参数。 1.3 超临界萃取：考察因素为萃取压力、萃取温度，萃取时间及料液比，通过数据分析 获得最佳工艺参数。 1.4 快速溶剂萃取：确定乙醇浓度，提取温度，提取时间，循环次数为考察对象，进行 单因素和正交试验，获得最佳提取方法。 2.黄酮的分离纯化： 利用硅胶柱色谱及高速逆流色谱进行分离纯化。通过波层色谱法（TLC）选取溶剂，用 不同梯度的溶剂点板，根据硅胶板上斑点分离的程度确定粗分时溶剂的浓度，若 Rf0.3 时，说明应换梯度，从而确定过柱时所需的梯度。 3.黄酮类化合物结构鉴定：通过红外光谱确定有机化合物结构中的主要官能团，通过质 谱确定有机化合物的分子量以及分子式，通过核磁共振确认有机化合物中氢的分布和碳 链骨架，综合分析即可确认该有机化合物的结构。 技术路线 提取山楂黄酮化合物 残渣 滤液 旋干，并用不同 溶剂萃取 石油醚层 正丁醇层 水层乙酸乙酯层 利用硅胶柱及其它方法进行 分离纯化并得到单体 利用波谱方法对结构进 行鉴定 可行性分析 山楂黄酮在临床应用上有着很高的实用价值，必然会带来很大的市场价值。但是对 山楂黄酮的应用只是停留在山楂总黄酮和其粗提取物的水平上。在一定程度上造成材料 的浪费和利用的不明确。这使得人们难以明确何种物质在发挥作用，或是几种物质联合 才能发挥