基因功能与调控试题植

功能基因与调控试题 1、顺式作用元件与反式作用因子有什么区别? 1.1 顺式作用元件 存在于基因旁侧与结构基因串联的特定 DNA 序列，是转录因子的结合位点， 它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。顺式作用元 件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作 用而起作用。顺式元件可分为以下四种类型：核心启动子成分，如 TATA 框； 上游启动子成分，如 CAAT 框，GC 框，ATF 结合位点；远上游元件：如增强 子，沉默子等；特殊启动子成分：如淋巴细胞中的 Oct 和 KB。这些元件都为 不同的转录因子及蛋白质识别和结合来调节转录。 1.2 反式作用因子 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序 列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。大多数真核转录调节因子由某一基因 表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因 的转录，这种调节蛋白称反式作用因子。反式作用因子通过以下不同的途经发 挥调控作用：蛋白质和 DNA 相互作用；蛋白质和配基结合；蛋白质之间 的相互作用以及蛋白质的修饰。参与基因表达调控的因子,它们与特异的靶基因 的顺式元件结合起作用。编码反式作用因子的基因与被反式作用因子调控的靶 序列(基因)不在同一染色体上。 反式作用因子有两个重要的功能结构域:DNA 结合结构域和转录活化结构域,它 们是其发挥转录调控功能的必需结构。反式作用因子可被诱导合成,其活性也受 多种因素的调节。同一类序列特异性的反式作用因子由多基因家族所编码。与 转录水平调节的反式作用因子通常可分为四大类：RNA 聚合酶；和 RNA 聚 合酶相联系的普遍性转录因子，它们结合在靶基因的启动子上，形成前起始复 合物， 启动基因的转录；特异性转录因子(如激活因子和抑制因子)，一类与靶基因 启动子和增强子(或沉默子)特异结合的转录因子，具有细胞及基因特异性，可 以增强或抑制靶基因的转录；种类多样的协调因子，要么改变局部染色质的 构像(如组蛋白酰基转移酶和甲基转移酶)，对基因转录的起始具有推动作用， 或直接在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用(如中介因子(Mediator)， 推动前起始复合物(PIC)形成和发挥作用。包括：1.DNA 结合域：a.螺旋-转角- 螺旋；b.锌指结构；c.亮氨酸拉链 d.螺旋-突环-螺旋；2.转录激活域：与其他 转录因子相互作用的结构成分。随着表观遗传学的发展，研究发现除了蛋白， DNA、RNA 也有调控功能，所以现在也称反式调控元件，主要有 miRNA，转录因 子等。 2、请分别设计研究顺式作用元件、反式作用因子以及两者之间 相互作用的实验。 2.1 全长启动子序列获得 premier 5.0 walking 技术 提取 RNA-反转生成 cDNA-引物设 5和 3侧翼序列 （包括启动子) 2.2 生物信息学分析与预测 获得启动子序列后, 首先通过生物信息学方法对启动子序列进行初步的预测和 分析,分析序列中含有的可能的相关顺式作用元件。常用的植物启动子预测相关 数据库和软件资源包括：EPD、TRRD、TRANSFAC、PLACE、Plant CARE。 2.3 突变分析启动子序列信息 突变分析法是鉴定顺式作用元件最可靠的方法, 多数突变分析包括缺失突 变和取代突变。 5 端缺失法、3 端缺失法 内部缺失法 分析确定功能启动子的调控区边界 确定重要顺式作用元件 点突变法 精确的点突变 获得启动子顺式作用相关元件。 2.4 凝胶阻滞分析法 凝胶阻滞依据的原理就是在凝胶电泳中,由于电场的作用,小分子 DNA 片段比其 结合了蛋白质的 DNA 片段向阳极移动的速度快,依据电泳迁移率的变化可以确定 蛋白质与核酸分子的结合情况。凝胶阻滞实验常用于研究启动子功能元件与核 蛋白的结合情况,从而鉴定新的顺式作用元件或验证已知顺式作用元件与转录因 子的相互作用。 2.5 确定与蛋白质结合的 DNA 的长度及序列 DNase I 足迹分析法其基本原理是用 DNase I 部分消化已进行单链末端标 记的待测双链 DNA,在变性聚丙烯酰胺凝胶上形成以相差一个核苷酸为梯度的 DNA 条带；当 DNA 片段与其特异性结合的蛋白结合后,结合蛋白的区域受到蛋白 的保护, 免受 DNase I 的攻击 , 因此形成切割梯中的空白区域。再结合 DNA 化 学测序法,就可知该结区的碱基序列。 2.6 顺式作用元件与反式作用因子作用研究 酵母单杂交体系从酵母双杂交技术发展来的。该方法根据 DNA 结合蛋白 (即转录因子)与 DNA 顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目 的转录因子的基因、鉴别已知转录因子的 DNA 结合位点, 是一种利用酵母细胞 来进行 的体内遗传分析系统。其原理是: 转录因子通常由一个 DNA 结合结构域和一 个转录激活结构域组成。理论上, 任何一个 AD 都可以与任何一个 BD 结合并激 活转录, 而且只要二者能够通过一定方式在空间上足够靠近, 就可激活转录。 其基本操作过程为:将已知顺式作用元件构建到最小启动子的上游, 把报告基因 连接到 Pmin 下游。将编码待测转录因子的 cDNA 与 AD 融合表达载体导入酵母 细胞, 该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合, 就能激活 Pmin 启动子, 使 报告基因得到表达, 从而筛选出与已知顺式作用元件相互作用的转录因子的编 码基因。 3、请设计一种 miRNA 启动子的甲基化调控基因表达的实验，并 描述 miRNA 对靶基因的调控方式以及研究方法。 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的 非编码 RNA，其大小长约 2025 个核苷酸。成熟的 miRNAs 是由较长的初级转录 物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进 RNA 诱导的沉默复合体， 通过碱基互补配对的方式识别靶 mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体 降解靶 mRNA 或者阻遏靶 mRNA 的翻译。最近的研究表明 miRNA 参与各种各样的 调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂 肪代谢等等。 3.1 miRNA 启动子的甲基化调控基因表达实验设计 细胞体外培养 细胞中转染甲基化 micRNA 检测靶基因 micRNA 表达 Western blot 检测蛋白质表达 侵袭实验 统计分析 3.2 miRNA 对靶基因的调控方式 miRNA 在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质- RNA 复合物（miRNP），在 miRNP 的作用下指导其识别同源 mRNA。miRNA 与靶 mRNA 调控方式 方式主要有两种。在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链 miRNA 与靶 mRNA 的 3 UTR 不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调 节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响 mRNA 的稳定性。目前， 该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们 24认为，正 常衰退途径引起的 mRNA 降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且 miRNA 不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制 的靶 mRNAs 和 miRNAs 共同聚集于胞浆中被称为 P-bodies 的区域，这个区域还 浓缩了许多参与 mRNA 降解的酶类。然而，P-bodies 可能是作为未翻译 mRNA 进 行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定 P-body 组成蛋白的表达能够缓 和 miRNA 介导的基因表达抑制。 另一种作用方式是，当 miRNA 与 mRNA 完全互补配对时，引起目的 mRNA 在 互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与 siRNA 类似。如大 多数植物在可读框(ORF)中与它的靶位点几乎完全配对。这种 mi/siRNA 介导的 基因沉默机制已得到了相关的阐释。以 siRNA 参与的 RNAi 为例进行说明， siRNA 可与 RISC 结合,作为模板识别 mRNA 靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA 与 siRNA 中的反义链结合，置换出正义链。双链 mRNA 在 Dicer 酶、ATP 和解旋 酶共同作用下产生 22nt 左右的 siRNA，siRNA 继续同 RISC 形成复合体，与 siRNA 互补的 mRNA 结合，使 mRNA 被 RNA 酶裂解。这个过程也称为转录后基因 沉默(PTGS)。 除此之外，近期，PNAS 刊载一项最新的发现：快速脱腺苷酸化 (accelerated deadenylation)是 miRNA 抑制基因表达的新机制。它们能够促 进 mRNA 聚腺苷酸尾巴 (polyA tail)的去除。他们认为 miRNA 去除聚腺苷酸尾 巴的能力不是由于降低翻译水平或需要 poly(A)为存在的翻译抑制。为证明这 点，Wu 等用 3组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以消除 miR-125b 对 mRNA 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。由此可知， miRNA 通过降低翻译效率和聚腺苷酸化 mRNA 的浓度来抑制基因表达远比阻遏 翻译强而全面，而且，不像翻译阻遏那样导致 mRNA 的解体是不可逆转。总之， miRNA 与靶 mRNA 不完全互补后有两种转录后作用机制，除了阻遏翻译外还可 引起 mRNA 快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。 3.3 miRNA 研究方法 3.3.1 miRNA 鉴定方法 鉴定 miRNA：常用的方法包括直接克隆鉴定，miRNA 芯片分析和生物信息学 预测。当然计算机预测的 miRNA 必须经过 RT-PCR 或 Northern 试验分析才能鉴 定，另外也可以通过 miRNA mimics 和 inhibitors 从功能上进行实验鉴定。 3.3.2 miRNA 功能鉴定 miRNA mimics 是模拟生物体内源的 miRNAs，运用化学合成的方法合成，能 增强内源性 miRNA 的功能。而 miRNA inhibitor 是化学修饰的专门针对细胞中 特异的靶 miRNA 的抑制剂。人工合成的 miRNAs 既能够特异性地沉默单一基因， 也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。miRNA mimics 进一步增强内源 miRNA 的沉默作用，降低细胞内蛋白表达量，进行功能获得性（gain-of- function）研究；相反，使用化学合成的方法合成 miRNA